Cette présentation résume des travaux d’un mémoire de Master pour l’obtention du diplôme de Master ès Sciences. Ce travail vise à montrer l’implication moléculaire des bactéries du genre Bacillus dans le processus de formation des biofilms.

1. UNIVERSITE MARIENNGOUABI
Faculté des Sciences et Techniques
MÉMOIRE
Pour l’obtention du Diplôme
de Master ès Sciences et Techniques
Option: Biochimie et Microbiologie Appliquée
Présenté et soutenu publiquement par
NKANGOU Andra Valaire Amour
Directeur de mémoire
KAYATH Aimé Christian, Maitre-Assistant CAMES, FST/ UMNG
Formation des biofilms chez les bactéries du genre
Bacillus dans les aliments fermentés

2. PLAN DE
L’EXPOSE
INTRODUCTION
PROBLEMATIQUE
OBJECTIFS
MATERIEL ET
METHODES
RESULTATS ET
DISCUSSION
CONCLUSION ET
PERSPECTIVES
2

3. Introduction 1/4
Ensemble d’agrégats multicellulaires, maintenus ensemble par une matrice
extracellulaire (polymères biologiques). (Santosh Pandit & Tiina Nypelö 2020)
3
Biofilm
Bactéries d’intérêt
 Agriculture: biofertilisant
 Bioremédiation des sols pollués
 Traitements des eaux usées
L’éventail de leurs
applications reste encore
largement à explorer
 Homogène ou
hétérogène
Structure
 Limitation de la pénétration
d'agents toxiques
 Résistance aux contraintes
mécaniques
Protection
 Surfaces minérales
 Tissus vivants
 surfaces métalliques
ou plastiques
Environnement

4. 4
Introduction 2/4
Bacillus et biofilm
 Plus de 99 % des bactéries se développent en biofilms: Bacillus (R.M. Donlan, 2002)
 Sur la base de l’ARNr 16S, neuf (09) groupes
Bactéries à Gram +, en forme de bâtonnets, majoritairement mobiles et sporogène; phylum
des Firmicutes, famille des Bacillaceae
Microorganismes ubiquitaires: Aliments fermentés (Kayath et al., 2016)
Groupe Espèces
I
B. subtilis, B. safensis, B. pumilus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B.
mojavensis, B. altitudinis, B. atrophaeus, B. sonorensis, B. aerophilus
Tableau I: Classification des bactéries du genre Bacillus (Wang & Sun, 2009)

5. 5
Bacillus et biofilm
 Composition:
 Polysaccharides EPS
(extracellular polymeric
substance)
 Protéines (TasA, TapA et
BslA)
 Régulation:
 Quorum sensing
 Produits de fermentation: l'acétoïne et
l'éthanol (B.cereus)
 Les biofilms bactériens ont été caractérisés en partie grâce aux études effectuées sur
l’organisme modèle Bacillus subtilis.
Introduction 3/4
(Yan et al., 2017)
(Santosh Pandit & Tiina Nypelö 2020)
 Architecture du biofilm est liée à la matrice extracellulaire.

6.  5 étapes (Lebeaux & Ghigo, 2012)
Introduction 4/4
Bacillus et biofilm
6
Attachement
irréversible
2
Formation des
microcolonies
3
Maturation
du biofilm
4
Dispersion du
biofilm
5
Attachement
réversible
1
Forme planctonique à
la forme sessile
Production de la matrice
extracellulaire
• Passive
• Active

7. 7
Problématique
Dans l’optique de valoriser les produits fermentés locaux, une
attention particulière est portée sur quelques aliments
fermentés afin de mettre en évidence la formation des biofilms
chez les bactéries du genre Bacillus.
Les aliments fermentés couvrent au
quotidien les besoins alimentaires de
la population congolaise (Kayath et
al., 2016).
Peu d’études décrivent
la formation des
biofilms, bénéfique en
industrie
biotechnologique des
aliments fermentés.

8. Objectifs
8
OS1
• Caractériser phénotypiquement les isolats purifiés par les
techniques classiques de microbiologie et de biochimie
OS2
• Sélectionner les isolats capables de former les biofilms et
évaluer leur potentialité à produire des biosurfactants
OS3
• Utiliser les technologies de l’ADN pour l’identification des
isolats et l’amplification des gènes de biofilms
Objectif général: Montrer la formation des biofilms chez les
bactéries du genre Bacillus dans les aliments fermentés.

9. 9
Matériel et méthodes 1/2
Matériel
 Milieux de culture
 Mossel
 L.B
 PCA
 GRC
 TSB
 …
 Matériel de laboratoire
 Réactifs
 Rouge Congo
 Saccharose
 TAE
 OneTaq polymerase
 dNTP
 Lysosyme
 KOH
 …
 Appareillage
 Etuve
 Spectrophotomètre
 Thermocycler
 Autoclave
 Micro-onde
 Bain marie
 ...
Matériel biologique
 Echantillons d’aliments fermentés locaux : vin de gingembre, vin de palme (Nsamba),
vin de banane (Mbavou) et feuilles fermentées de manioc (Ntoba mbodi).
 Une souche contrôle de Bacillus subtilis

10. 10
Matériel et méthodes 2/2
Méthodologie
Echantillonnage
Caractérisation
phénotypique et
biochimique
Isolement sur
milieu Mossel
Techniques de microbiologie classique
Extraction de l’ADN génomique
PCR du gène
de l’ARNr
16S
Analyses moléculaires
PCR des
gènes de
biofilm
Test de
Gram
Test de
catalase microscopie
macroscopie
sporulation
Tests:
 formation de
biofilm
 production des
biosurfactants
 inhibition des
pathogènes Electrophorèse
d’ADN
RFLP
PCR du gène
fibE
1
2
3
4

11. Résultats et discussion1/10
Figure 6. Aspects macroscopiques de deux isolats de Bacillus
spp., (A, isolat NM6 et B, isolat VB22) purifiés sur le milieu
Mossel
11
 133 isolats obtenus
Bacillus peuvent être isolées de différents aliments
fermentés
(VOUIDIBIO et al.,2017)
45
33
23
32
Vin de palme Vin de gingembre
Vin de banane Ntoba mbodi
Figure 5. Résumé du nombre d'isolats de Bacillus spp.
obtenus par aliment fermenté.

12. 12
Résultats et discussion 2/10
133 isolats testés, 60 soit 45 % ont été
positifs au test de formation de biofilm
après incubation.
Test de biofilm
 Méthode GRC
60 % des bactéries d’origines
alimentaires étaient capables de produire
les biofilms sur milieu GRC
(MAHAMAT et al., 2013)
Figure 8. Profil phénotypique des isolats de Bacillus spp.
capables de former (coloration noire) ou non (coloration
rouge) le biofilm sur Gélose Rouge Congo
Positifs,
60, 45%
Négatifs,
73, 55%
Positifs
Négatifs
Figure 9. Bilan des isolats de Bacillus spp.
capables de former ou non le biofilm

13. 13
C - G19 VP21 C +
Figure 12. Profil phénotypique des isolats de Bacillus
spp. capables de former (film bordant le fond ou paroi)
du tube) ou non le biofilm après coloration au cristal
violet à 2%.
Résultats 3/10
Test de biofilm
 Méthode tubes à essai
la formation du biofilm peut être
influencée par la nature du substrat.
Glucose et Nacl influençaient sur la formation
des biofilms .
(MAHAMAT et al., 2013)
Figure 14. Criblage de la production de biofilms par la
méthode de tube à essai des isolats négatifs.

14. Résultats et discussion 4/10
Figure 15. Emulsion de l’essence de
quelques isolats de Bacillus spp.
Emulsion
C- C+ NM29 G7 VP13 VB15
14
60 isolats testés, 39 soit 65 % ont émulsifier
l’essence avec des IE compris entre 5 et 100 %.
11 isolats ont obtenus un IE ≥ 50 % avec la
culture et 5 autres avec le surnageant
Test d’émulsification
B. subtilis et B. licheniformis étaient capables d’
émulsifier les hydrocarbures
(Satpute et al., 2010)
Figure16. Index d'émulsification avec culture et surnageant
acellulaire. Chaque cercle représente un pourcentage.

15. 15
Des 16 biosurfactants extraits, 9
soit 56 % ont démontré un pouvoir
inhibiteur.
Résultats et discussion 5/10
Test d’inhibition
Biosurfactants de B. subtilis présentaient une
activité antibactérienne contre les bactéries
pathogènes
(de Souza Freitas et al., 2020)
Halo clair
Contrôle +
Contrôle -
Figure 18. Comportement des extraits de biosurfactant
dans la l’inhibition des bactéries pathogènes (A, E. coli ;
B, S. aureus et C, Salmonella sp.) Figure 19. Diamètres des halos d’inhibition d’extraits de
biosurfactants testés
-5
0
5
10
15
20
25
G1 G17 VP2 VP7 VB4 VB15 NM11 NM23 NM29
Diamètre
des
halos
(mm)
Extraits de biosurfactants
Activité inhibitrice
E.coli Staphylococcus aureus Salmonella

16. 16
Résultats et discussion 6/10
 Analyses moléculaires  16 isolats sélectionnés (profil biofilm et IE ≥ 50 %).
MP 1 2 3 4 6 MP
0,5Kb
1Kb
10Kb
+
Figure 21. Profil électrophorétique de l’ADN génomique de
quelques isolats de Bacillus spp. sur gel d’agarose à 1%.
Extraction d’ADN PCR du gène fibE
Tableau VII: Amorces utilisées pour l’amplification du gène fibE

17. Résultats PCR du gène fibE
17
MP 1 2 3 4 5
1000pb
500pb
≈ 850pb
Figure 22. Profil électrophorétique sur gel d’agarose à 1%
des amplicons de la PCR du gène fibE.
G23, VB15, NM11: B. pumilus ; G7
et G26: B. subtilis; G17: B. safensis
G33: B. licheniformis
PCR de l’ARNr 16S
1500 pb
1000 pb
500 pb
+
Figure 23. Profil électrophorétique sur gel d’agarose
à 1% des produits PCR du gène de l’ARNr 16S.
Résultats et discussion 7/10
(Kaya-Ongoto et al., 2019)

18. 18
Produits PCR ARNr 16S
Coupure par PstI
B. pumilus
(860+646)pb (836+654)pb
B. safensis
Figure 24. Profil électrophorétique de digestion enzymatique sur
gel d’agarose à 1 % des produits PCR de l’ARNr 16S.
MP 1 2 3 MP 1 2 3
RFLP
Résultats et discussion 8/10

19. 19
Résultats et discussion 9/10
Étude in silico
Figure 20. Alignement des séquences de trois espèces (B. subtilis, B. pumilus et B. licheniformis) avec
des amorces spécifiques qui s’hybrident (http://multialin.toulouse.inra.fr/ multialin/cgi-bin/pl)
PCR des gènes de BIOFILM

20. Résultats PCR des gènes de BIOFILM
20
Résultats et discussion 10/10
≈1035 pb (eps)
≈786 pb (tasA)
≈435pb (ymcA)
1000pb
500pb
≈432 pb (ymcA)
≈1089pb (yfiQ)
Figure 25. Profil électrophorétique sur gel d’agarose à 2 % des
produits PCR des gènes eps, yfiQ, ymc et tasA des isolats de
Bacillus spp.
Ont été amplifiés les gènes eps et
tasA répertoriés chez B. subtilis; les
gènes ymcA et yfiQ répertoriés chez
B. licheniformis ainsi que le gène
ymcA répertorié chez B. pumilus.
Ainsi tous les gènes ciblés ont été
obtenus aux tailles attendues.

21. 21
 L’objectif de ce travail a permis de contribuer à la valorisation des produits fermentés locaux et à
la compréhension moléculaire dans le processus de formation des biofilms chez les Bacillus.
 Gène fibE: 7 isolats ont été identifiés notamment G23, VB15, et NM11 comme B. pumilus ;
G7 et G26 comme B. subtilis, G17 comme B. safensis et enfin G33 comme B. licheniformis.
 Les isolats identifiés (B. pumilus, B. subtilis et B. licheniformis) ont parallèlement démontré leur
aptitude à former les biofilms par amplification des gènes de biofilm (eps, tasA ymcA et yfiQ ).
 Les Bacillus ont été isolés et caractérisés par des techniques de microbiologie.
Conclusion
Conclusions et Perspectives 1/2

22. Conclusions et Perspectives 2/2
22
Cibler d’autres
gènes impliqués dans
la formation du
biofilm à travers le
genre Bacillus.
Faire le screening
d’autres
microorganismes
capables de former
les biofilms dans
les aliments
fermentés.
Etudier le
niveau
d’expression
des gènes du
biofilm via la
technologie de
RT-PCR.
1
2
Perspectives
3

23. 23