Isolement et Caractérisation d’agent de la Tuberculose de l’olivier et des bactériophages

1. Isolement et Caractérisation d’agent de la
Tuberculose de l’olivier et des bactériophages
associés
Présenté par :
SLITI Hana
Université Tunis El Manar
Facultés des Sciences de Tunis
Encadrée par
SADFI-ZOAOUI Najla
Mastère de Biologie Moléculaire et Cellulaire/Biochimie-Microbiologie

2. Introduction Matériel et
méthodes
Résultats
et
discussion
Conclusion
et
perspectives
Objectifs
2

3. l’apparition d’excroissances de
couleur marron appelées : (Chancre
ou galles)
Les galles apparaissent de formes
irrégulières de couleur verte au début
et une surface lisse
Les galles acquièrent un
aspect spongieux et
irrégulier, et devenant dur et
de couleur brune.

4. Jusqu’à ce jour, Les
traitements chimiques
disponibles par les produits
cupriques et les
antibiotiques sont inutiles
contre l’agent responsable
qui est capable de
développer rapidement des
mécanismes de résistance à
ces substances (Archibani et
Bouaichi, 2017).

5. - La propagation rapide de
la maladie dans différentes
régions en Tunisie.
- Absence d’un traitement
efficace pour lutter contre
la Tuberculose de l’olivier.

6. L’isolement et la caractérisation d’ agent
pathogène de la tuberculose de l’olivier.
L’étude de la pathogénicité des
bactéries sur les oliviers de variété
chetoui.
L’isolement des bactériophages
associés.
1
2
3
6

7. 1-Échantillonnage
Régions visitées durant les échantillonnages

8. 2-Prélevement à partir des branches
é réalisé dans le but de compléter l’analyse d’ agent causal de cette maladie
Prélèvement
Le prélevement à
partir des
branches
symptomatiques
Analyse interpretation
Identification
morphologiques et
biochimiques
des souches
Caractériser
des souches
bactériennes .
8

9. 3.Identification morphologique et moléculaire des isolats
bactériens
Etude
Macroscopique
Etude
Microscopiq
ue
Etude
Moléculaire

10. Les bactéries
Coloration de Gram Test oxydase Test Catalase
10
Test sous radiation UV
 Identification biochimique

11.  les facteurs de virulence :
Production de
cytokinines
Formation de
biofilm
La conversion d’acide
indole acétique
La méthode de coloration au
Cristal violet
Résistance au
cuivre
Les bactéries

12. 4.Etude de la pathogénicité
Test de
pathogénicité des
bactéries
Oliviers de
variété chétoui
Feuille de tabac
12

13. 5.Identification moléculaire
PCR
-Les bactéries :
Amorces
universelles
forward S1 et
reverse S2
Séquençage
-Les produits PCR
ont été envoyés en
vue d’être
séquencés
Extraction
d’ADN
- Des bactéries:
le kit de la
marque
analytikjena
innuPREP Bacteria
DNA Kit
13

14. Prélevement Analyse interpretation
-
Échantillonnag
e se fait à
partir du sol et
des branches
infectes .
-par le test spot
et le résultat de
purification .
L’ apparition du
plage de lyse
indique la
présence des
phages .
14
6. Nouvelle stratégie de bio-contrôle de la
bactériose

15. 6
A
A B
C D
1. Observation des symptômes sur terrain
Les symptômes de la maladie de la tuberculose de l'olivier de variété chemalali sur
branches (A), sur le Tronc(B), (D): sur les rameaux(C): l'aspect de galle.

16. 2. la relation entre le volume tumoral et l’apparition de la colonie
16
0
10
20
30
40
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Histogramme des poids et des diamètres des galles
Somme de poids mg
Somme de diamètre mm
Les résultats obtenus montrent que plus le volume tumoral est important
plus le nombre des colonies obtenus est élevé.

17. 3. Identification des bactéries détectées au niveau des trois régions
15%
25%
60%
Présentation des pourcentages des
bactéries isolées à partir de la tumeur
bacillus Like bactéries jaunâtres Pseudomonas Like
=> Colonies de forme ovoïdes, présentant un aspect muqueux ou lisse , de
couleur blanche, sans odeur, contour régulier

18.  Aspect sur le milieu de culture
Aspect sur milieu King B

19.  Caractère de fluorescence des isolats
Résultats de détection de fluorescence sous UV
Ces résultats sont en concordance à ceux trouvés par Palleroni. (1993 ) qui ont
démontré que tout les Pseudomonas possèdent un caractère fluorescent.

20. Bactéries
à Gram
négatifs
85%
bactéries
à Gram
positifs
15%
Bactéries à Gram négatifs
Bactéries à Gram positifs
4. Identification biochimique des souches bactériennes
 coloration de Gram
Bacille à
Gram
négatifs
91%
Cocci à
Gram
négatifs
9%
Bacille
Cocci
Pourcentages de Bactéries
A
B

21. Sélection des souches
37
à Gram -
retenues

22.  Test catalase et oxydase
Test catalase Test oxydase
Tous les isolats à Gram-
négatifs produisent
l’enzyme catalase et
présentent une réaction
négative au test de
l’oxydase
Ceci a été prouvé dans une étude identique réalisés par Prescott et al
(2003)

23.  Test pectinase
Test pectinolytique Test CVP
- 37 bactéries à Gram- négatifs et oxydase négatives ont été testées pour leur pouvoir pathogène
sur des tranches de pomme de terre uniformes.

24. Identification
macroscopique
Identification
microscopique Tests Biochimiques
les bactéries présentes au niveau des galles sont des bactéries à Gram-
négatifes , oxydase négatives , Pectinase négatives du genre Pseudomonas.

25.  Test cellulase
45%
55%
Pourcentage des souches Pseudomonas like
souches cellulase - souches cellulase +
Test cellulase
la majorité de Pseudomonas savastanoi pv savastanoi like est
capable de synthétiser l’enzyme cellulase.
5. Caractérisation enzymatiques des souches bactériennes

26.  Test protéolytique
Résultats du test protéase
=> Tous les isolats
bactériens n’ont pas
provoqué d’halo clair
sauf le témoin positif
Halomonas sp
Pseudomonas savastanoi est incapable de produire la
protéase

27.  Test amylase
=> 37 souches du genre
Pseudomonas n’étaient pas
capables de dégrader
l’amidon.
Alpha amylase -
Témoin positif : Pseudomonas
veronii

28. Production de DNAase
37 bactéries à Gram-négatifs ont montré
leur capacité d’hydrolyser ADN.
Ce résultat est confirmé par travaux de Nord et al. (1975) qui ont montré
que la majorité des bactéries du genre Pseudomonas est capable
d’hydrolyser l’acide désoxyribonucléique.
DNAase +

29. Production de gélatinase
- la souche Pseudomonas savastanoi est gélatinase négative
B : Témoin positif :
Pseudomonas veronii
A: Gélatinase -
A
B

30. 6.Identification moléculaire
2C : OP122093
2E :OP122094
4B: OP122095
6F:OP122096
L’alignement des séquences de la région 16S de l’ADN r sur la base de données NCBI a
montré que : les souches 2C, 4B, 2E et 6G présentaient une homologie de 98% avec
Pseudomonas savastanoi
L’électrophorèse des produits PCR 16 S sur gel d’agarose à 1,5%
1500 pb

31.  BOX A1R PCR
18 souches présentent des profils électrophorétiques identiques et une similarité de 100%, il s’agit du
premier groupe(2C,6G,1F,5A,1B,6E,3B,2B,5B, 1E,CH34,CH13,CH12,CH17,CH25,CH35,CH28,CH23).
2 souches présentent des profils similaires mais différents par rapport au témoin positif, il s’agit du
deuxième groupe(CH19,CH5).
une seule souche présente un profil électrophorétique différent des autres souches ,il s’agit du troisième
groupe (6B).

32. 7.Hypersensibilité sur Tabac
La souche de P. savastanoi a déclenché une réponse d’hypersensibilité sur tabac
Résultats d’hypersensibilité sur feuille de tabac
A B

33.  Antibiogramme
Antibiotique Copie1(mm) Copie2(mm) Copie3(mm) Moyen(mm)
FOX30 0 0 0 0
IPM10 60 55 50 55
OFX5 18 20 15 17.66
PIP100 16 14 15 15
TIM85 12 10 11 11
AMC30 16 16 14 15
RA30 12 8 10 10
Ces résultats sont différents à ceux trouvés par Boulssen et al. (2016) qui ont
montré que la souche Pseudomonas savastanoi est sensible à l’amoxicilline.

34. Aspect sur milieu Levane
Production de Levane
6. Facteurs de virulence
Ceci indique la présence de levane sucrase qui décompose le saccharose et
former un type d’exo-polysaccharides qui est le levane.
37 souches ont présenté des
colonies blanchâtres, convexes
et brillantes.

35. Formation du biofilm
0
0.5
1
1.5
48 72 96 120
28 30 35 40
DO
à
580
nm
incubation
Somme de incubation en f(
h)
Somme de incubation en
f(T)
Les conditions optimales pour Pseudomonas savastanoi sont:
(i) une température de l ’ordre 35°C et (ii) un temps
d’incubation de 96 heures.

36. Les catégories Densité optique Profil de production
1 0 Absence de production
2 0_0.05 Faiblement producteur
3 0.05_0.15 Producteur intermédiaire
4 >0.15 Fortement producteur
Cette bactérie est fortement productrice du biofilm
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1 0,15
DO
udu
cristal
violet
(600nm)
DO d’ une suspension bactérienne
dosage schématique du cristal violet sur biofilms dans
une microplaque P96
Total
Classification des souches selon la méthode de dosage CV (Vieu, 2014)

37. Les catégories Densité optique Profil de production
1 0 Absence de production
2 0_0.05 Faiblement producteur
3 0.05_0.15 Producteur intermédiaire
4 >0.15 Fortement producteur
Cette bactérie est fortement productrice du biofilm
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1 0,15
DO
udu
cristal
violet
(600nm)
DO d’ une suspension bactérienne
dosage schématique du cristal violet sur biofilms dans
une microplaque P96
Total
Classification des souches selon la méthode de dosage CV (Vieu, 2014)

38.  Acide indole acétique lysine
+
-
L’électrophorèse des produits PCR sur gel d’agarose à 1,5%
454 pb
Ce résultat montre la présence du gène qui est capable de
convertir l’acide indole acétique en acide indole acétique
lysine.

39.  cytokinines
- Ptz est un gène impliqué
dans la biosynthèse des
cytokinines, il a été amplifié
chez 18 souches

40.  résistance au cuivre
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0,042 0,084 0,169 0,337 0,675 1,25 2,5
DO
de
la
suspension
bactéienne
[Cu So4]
Somme de 2C+
Somme de 2C
Somme de 2E+
Somme de 2E
- Ce test a montré que Cu
SO4 a une efficacité plus
importante contre
Pseudomonas avec une
concentration minimale
inhibitrice comprise entre
0.675 mM et 0.337 mM .
Ceci a été déterminé dans une étude similaire réalisés par Quesada et al. (
2010)
Mais on ne peut pas utiliser ces substances à cause de leur toxicité sur la
santé humaine et leurs effets néfastes sur l’environnement.

41. 8. Nouvelle stratégie de bio-contrôle de la
bactériose
Plage de Lyse formé suite à lyse de la souche 2C par le phage à
partir du sol des vergers de l'olivier de chtatla.
Les zones de lyse produites
par les deux phages sont
respectives 7 mm et 10 mm.
 isolement
7mm
10 mm

42.  Purification
Des phages ont été isolés à partir des échantillons du sol des vergers symptomatiques et
nécessitent des investigations ultérieures et des essais à grande échelle.

43. Conclusion
Une collection de 67 bactéries a été établie à partir des rameaux présentant des galles,
symptôme caractéristique de la tuberculose.
En se basant sur leurs profils phénotypiques à savoir l’aspect sur King B, la coloration de Gram,
ont permis de sélectionner 37 isolats.
43
L’étude des caractéristiques phénotypiques a montré que la microflore bactérienne
présentait le genre Pseudomonas.
L’identification phénotypique a montré que les isolats étaient à Gram-négatifs, non
productrice d’oxydase et incapables d’hydrolyser la pectine et la gélatine. Par contre,
ils étaient aptes à produire la cellulase et fluorescentes sur les milieux King B.
D’autres facteurs de virulences ont été aussi étudié principalement la formation de biofilm et la
production de certaines enzymes tel ques la DNAase et la gélatinase.

44. Conclusion
Une analyse approfondie des génotypes a été effectuée. Trois gènes ont été amplifiés l’ADNr16S, le
gène codant pour l’acide indole acétique ‘iaal’ et le gène ‘ptz’ impliqué dans la biosynthèse des
cytokinines.
les profils inter-géniques BOX ont été étudiés montrant une certaine variabilité intra-espèce..
Des phages ont été isolés à partir des échantillons du sol des vergers symptomatiques.
44
La sulfate du cuivre a une efficacité plus importante contre Pseudomonas avec une concentration
minimale inhibitrice comprise entre 0.675 mM et 0.337 mM
Dans notre étude, la résistance aux antibiotiques a montré que Pseudomonas savastanoi est résistante à
l’Amoxicilline et sensible à l’imipénème.

45. Perspectives
D’élargir le nombre de phage isolés en établissant d’autres
campagnes d’échantillonnage.
De déterminer l’effet des conditions environnementales sur la stabilité
du phage.
45
D’ étudier la cinétique de croissance du phage isolé
En perspectives nous envisageons

46. Merci
de
votre
attenti
on
46