Tests in vitro pour évaluer la sensibilité de P.falciparum aux drogues

Ministère de la Santé, du Planning
Familial et de la Protection Sociale
Madagascar

Tests in vitro pour évaluer la sensibilité

de P. falciparum aux drogues

Marie Ange Rason

Atelier Paludisme – 6eme édition
10 Mars au 18 Avril 2008

…, il est impératif de surveiller la
sensibilité/résistance de Plasmodium sp aux
antipaludiques, notamment dans les pays
d’endémie.

Evaluation de la sensibilité de
P. falciparum aux antipaludiques

Test de
chimiosensibilité

Echantillon
Tests in vitro
de sang

Génotypage
(marqueurs de
résistance)

Test in vivo
(traitement et suivi)

Test de chimiosensibilité in vitro

Microscopique
OMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001

Colorimétrique (pLDH, HRPII)
Moreno et al. Med Trop 2001; 61:545-57
Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-64

Isotopique (hypoxanthine tritiée)
Desjardins, Clin Pharmacol Ther 1979; 26:327-29
Le Bras, Am J Trop Med Hyg 1983; 32: 447-51
Cytométrie en flux
Pattanapanyasat et al. Cytometry 1997; 27: 84-91

Microfluorimetrique (PicoGreen, Sybergreen)
Mise en culture Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24
des parasites Smilkstein et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:1803-1806
Bennet et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1807-1810
viables M.A. Rason et al. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008; 102, 346-351
4

Tests de chimiosensibilité in vitro

Microscopique

Noedl et al. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:1658-
64

Isotopique (hypoxanthine
tritiée)
Cytométrie en flux

Microfluorimetrique (PicoGreen,
Sybergreen)
Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24 5

Cycle biologique des plasmodies infectant
l’homme

Contraintes logistique et technique (communes)

• Clone de parasites
• Équipements de laboratoire
• Personnel compétant
• Bonnes pratiques de laboratoire

• Souches de référence de P. falciparum (3D7, FCM29,
D6 …)

Questionnements :
- laboratoires régionaux en Afrique ?
- collaborations sud-nord ?

Conduite du test isotopique in vitro
Procédure:
Randrianarivelojosia et al, 2002
Le Bras & Deloron, 1983

Plasmodium falciparum (synchronisé)

Préparation de la suspension parasitaire dans du RPSH
10%(200 l par puits sur plaque de 96 puits; 0,5% de
parasitémie; 1,5% d’hématocrite; hypoxanthine tritiée 0,4
Ci/puits)
Incubation 42h à 37°C (atmosphère micro aérophile et
humide)
Evaluation de la radioactivité incorporée et calcul des
CI50


Plaques de culture
à 96 puits, à fond plat,
pré médicamentées
Exemple de drogues :
Chloroquine
Monodesethyl-AQ
Quinine
Dihydro-artémisinine

Modular Incubator Chamber

Billups-rothenberg


Mise en culture
Incubation pendant 42h à
37°C; atmosphère humide;
en microaérophilie

Congélation

Décongélation des plaques
de culture

Salle de collecte, collecteur et filtre en fibre de verre

Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthine
tritiée dans l’ADN du parasite

Hypoxanthine-3H

+

ADN plasmodial
ADN marqué
(début du test)
au tritium

Compteur à scintillation liquide piloté par ordinateur
. Comptage de la radioactivité(cpm) à
l ’aide du Microbeta
. Calcul des CI50 (concentration
inhibitrice 50%)
. Seuil resistance :chloroquine (100 nM),
monodesethylamodiaquine (60 nM) ,
quinine (800 nM).

Résultats du comptage de radioactivité pour
un test de chimiosensibilité in vitro de P. falciparum

Faible
CQ MAQ Q DHA
concentration 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 13819 13626 14042 13988 14141 14103 12061 12252 14425 11577 11489 14374
B 13276 12774 14926 15296 15550 14952 8243 7737 7353 8487 6670 8765
C 6373 5763 5547 12805 13048 12214 4816 5046 4912 1125 845 1106
D 859 1015 1112 880 914 1062 2916 2381 2746 700 479 672
E 549 593 549 417 392 444 1104 1250 1333 529 555 520
F 553 478 477 496 390 402 496 592 643 583 457 1015
G 567 485 13177 820 638 13372 746 766 12513 12014 466 1077
H 521 587 11900 783 635 11898 782 1210 11944 11444 700 495
Forte TDD01 TDD01 TDD01 TDD01
concentration

vert = Témoin négatif (puits sans médicaments)

Test de chimiosensibilité in vitro

Microscopique


Isotopique (hypoxanthine tritiée)
Cytométrie en flux

Microfluorimetrique (PicoGreen, Sybergreen)
Mise en culture Corbett et al. Am J Trop Med Hyg 2004; 70:119-24
des parasites Smilkstein et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:1803-1806
Bennet et al. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1807-1810
viables Rason et al. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008; 102, 346-351
17

SYBR Green I is a DNA- intercaling dye that prefers G and C base pairs.
formule chimique: C32H37N4S - cyanines asymétriques (fluorophores)
Excitation is at 488nm and emission at 510 to 550

Méthode avec Sybr Green (fluorophore)
______________________________________________
Mise en culture des parasites
. Plaque prémédicamentée
. Lavage 3x avec RPMI-1640
. RPSH 10% sans hypoxanthine tritiée
. Parasitémie à 0.5%, hématocrite à 1,5%
. Incubation 72 h à 37°C, atmosphère microaérophile et humide
. Congélation plaque

lecture:
. Décongeler les plaques pendant 2 H au moins à RT
. Transférer 100 L de la suspension parasitaire dans une plaque vierge
. Préparer mix: 0,2 L/ml de Sybr Green avec tampon lyse MSF
(Malaria Sybr Green fluorescence)
. Ajouter 100 L/puits de ce mix dans la suspension parasitaire
. Incuber 30 mn à RT, à l’abri de la lumière
. Lecture 485/535 nm au fluorimètre

Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green

Plaque prémédicamentée Plaque prémédicamentée

Suspension parasitaire + hypox-3H Suspension parasitaire

Incubation culture (42H)
Incubation culture (72H)

Transfert sur filtre
Transfert 100µL+ rajout Tp Lyse MSF
Séchage filtre
avec Sybr Green

Rajout liquide scintillant
Incubation 30mn
scellé

Compteur à scintillation liquide Lecture / Fluorimètre

Table 1: Comparison of the isotopic and SYBR Green I measurements for clinical isolates of P. falciparum tested against four drugs
______________________________________________________________________________________________________________
Drug tested No. isolates
Geometric mean (nM) [95%CI] P-valuea αcb
tested
___________________________________
Isotopic assay [3H]- SYBR Green I
hypoxanthine
_________________________________________________________________________________________________

50% inhibitory concentration
Chloroquine 138 20.2 [16.5-27.7] 22.3 [18.7-26.7] 0.46 0.93
Monodesethylamodiaquine 138 7.6 [6.6-8.8] 7.2 [6.3-8.3] 0.61 0.92
Quinine 135 48.7 [40.6-58.4] 52.3 [44.7-61.3] 0.56 0.90
Dihydroartemisinine 130 0.80[0.65-0.97] 0.80[0.65-0.96] 0.99 0.81

90% inhibitory concentration
Chloroquine 138 116.6[98.0-138.8] 119.4[102.3-139.5] 0.84 0.68
Monodesethylamodiaquine 138 32.9[28.8-37.7] 35.5[30.8-40.8] 0.45 0.73
Quinine 135 342.1[296.7-394.4] 335.8[287.7-391.9] 0.86 0.72
Dihydroartemisinine 130 4.4[3.8-5.1] 4.6[3.95-5.46] 0.66 0.58
____________________________________________________________________________________________________________

a Significances by Mann-Whitney U tests are given for the difference in inhibitory concentrations measured with the two assays.
b Concordance coefficient correlation.

Correlation between individual IC50s (in nM) for chloroquine
determined by the SYBR Green I and the isostopic assays
(n=541; r = 0.93, CI95% 0.92-0.94) P< 0.0001

1000

100
Log IC50 isotopic

10

1

0,1

0,01
0,01 0,1 1 10 100 1000
Log IC50 SYBR Green I

Avantages et Inconvénients
_________________________________________________
Méthode isotopique Méthode avec Sybr Green

. Radioélément . Fluorophore
. Référence . Simple
. Radioprotection . Rapide
. Personne compétant . très sensible
. Compteur à scintillation . Fluorimètre
. Incubation 42H . Incubation 72H
. Résultats en cpm(coups/minutes) . RFU(Relative Fluorescence Units)
. 50US$ par plaque 96 puits . 0,88US$ par plaque 96puits

Fluorescence-based assays:
conclusions
Of published methods, SYBR Green I/MSF assay is preferable
on the basis of signal, flexibility and cost

Optimization likely to be ongoing and sometimes
site-specific

Unequivocal utility as a drug testing method
– Ideal for high-throughput screening
– Appropriate for side-by-side comparisons
– Feasible for field use

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