1.
Hépatite C
Virus & Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
des Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris-Est
Créteil

2.
Découverte du Virus de l’Hépatite C
From New England Journal of Medicine, 1975
Hépatite C : Virus et Marqueurs

3.
Identification du Virus de l’Hépatite C
From Science 21 April 1989
Hépatite C : Virus et Marqueurs

4.
The Global Burden of HCV Infection
• Approximately 130-170 million people are
chronically infected with HCV
• HCV is responsible for >350,000 deaths per year
worldwide
• Up to 85% of HCV-infected patients are unaware of
their status
• Less than 10% of the HCV-infected population has
received treatment in the US
Hépatite C : Virus et Marqueurs

5.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
RateofSVR(%)
0
20
40
60
80
100
IFNα + RBV
48 weeks
IFNα
48 weeks
10%
Peg-IFNα
+ RBV + PI
24-48 weeks
Peg-IFNα
+RBV
48 weeks
All-oral
IFN-free
12 weeks
30%
45%
70%
Peg-IFNα
+ RBV + NA
12 weeks
89%
95%
Pawlotsky et al., J Hepatol 2015; 62:S87-S99.
Rates of SVR according to Treatment
Regimens (G1)

6.
Plan
Hépatite C : Virus et Marqueurs

7.
I. TAXONOMIE

8.
Virus de l’Hépatite C
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Phylogénie bayésienne de
la région codant la
protéine NS5B
Drexler et al., PLoS Pathog. 2013;9(6):e1003438.

9.
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
• Hôte naturel : Homme
• Tropisme : Foie
Virus de l’Hépatite C
Hépatite C : Virus et Marqueurs

10.
Identification d’Homologues du VHC chez
les Non Primates
Kapoor et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108(28):11608-13; Kapoor et al., Mbio 2013;4(2):e00216-13.
Phylogénie de la région codant RdRp (7711-8550 HCV g1a)
CHV: canine hepacivirus
RHV: rodent hepacivirus
Hépatite C : Virus et Marqueurs

11.
Identification d’Homologues du VHC chez
les Non Primates
Equine hepacivirus in Blue
Rodent hepacivirus in Red
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Drexler et al., PLoS Pathog. 2013;9(6):e1003438.
Phylogénie de la région
NS3 (3192-4889 HCV g1a)

12.
II. MODÈLES EXPERIMENTAUX

13.
Les Différents Modèles d’Etude in vitro
• cDNA développés en 1997
• Réplicons subgénomiques (1999)
• Pseudoparticules rétrovirales (HCVpp) (2003)
• Système de culture permettant le production
de particules virales infectieuses (HCVcc)
(2005)
Hépatite C : Virus et Marqueurs

14.
Les Modèles Animaux
Tawar et al., Cell Res. 2014;24(10):1153-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

15.
III. ORGANISATIONS
STRUCTURALE & GENOMIQUE

16.
Organisation Structurale
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.

17.
Densité des Particules Circulantes
Lindenbach BD. Curr Top Microbiol Immunol 2013;369:199-218.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

18.
The “Lipidome“ of HCVcc Particles
Merz et al., J Biol Chem 2011;286(4):3018-32.
LPC: lysophosphotidylserine
CE: cholestery ester
Chol: cholesterol
PI: phosphatidylinositol
PS: phosphatidylserine
PE: phosphatidylethanolamine
SM: shingomyelin
PC: phospahtidylcholine
PG: phosphatidylglycerol
Total lipid profile Phospholipid profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs

19.
Organisation Structurale
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700; Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.

20.
• Infection chronique VHC généralement
associée à une hypocholestérolémie et
hypo ou hyper TG
– 700 VHC-pos (75% de patients ARN détectable)
inclus parmi plus de 11 000 individus
– 74 patients VHC-pos inclus parmi les 130
patients ayant une hépatopathie
Serum Lipid Profile in Patients with HCV
Infection
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Dai et al., J Hepatol 2008;49(1):9-16; Van Thiel et al., Dig Dis Sci 2014;59(4):881-5.

21.
Organisation Génomique des
Flaviviridae
Hépatite C : Virus et Marqueurs
0 1800 3600 5400 7200 9000 10800
C
4A
p7
NS5BNS5ANS4BNS3NS2E2E1
5’UTR 3’UTR
Hepatitis C virus
Npro
C E1 E2E0 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B
4A
p7
5’UTR 3’UTR
Pestivirus
C
prM
E NS1 2A 2B NS3 NS5NS4A 4BCap
5’UTR 3’UTR
Yellow fever virus

22.
Organisation Génomique
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Li et al., Nat Rev Microbiol 2015;13(9):544-58.

23.
Structure de l’IRES
Hépatite C : Virus et Marqueurs
“Pseudoknot domain“
Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.

24.
Crystal Structure of the Full HCV IRES
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.

25.
MicroRNA (miR)-122 et Infection VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Expression abondante et spécifique du
foie
• Interaction avec la région 5’NC du génome
viral
– 2 sites au niveau du domaine I
• Favorise la stabilité de l’ARNm viral

26.
miR-122 : Cible Thérapeutique ?
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Janssen et al., N Engl J Med. 2013;368(18):1685-94.

27.
Efficacité Antivirale du Miravirsen
Janssen et al., N Engl J Med 2013;368(18):1685-94.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

28.
Pros & Cons des Antagonistes de miR-122
• Activité pangénotypique
• Barrière à la résistance élevée (HTA)
• Administration parentérale
• Faible taux de miR-122 dans les hépatocytes a
été associé au développement d’HCC
Tsai et al., J Clin Invest 2012;122(8):2884-97; Wilson et al., Curr Opin Virol 2014;7C:11-18.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

29.
RG-101 : Oligonucléotide anti-miR-122
• Bonne tolérance après administration sous-cutanée
de doses allant de 0,5 mg/kg à 8 mg/kg chez 40
volontaires sains
• Absence d’interactions avec les DAAs (simeprevir)
• Activité antivirale in vivo (n=32 G1,3 et 4 non-
cirrhotiques)
– 1 injection (2 doses : 2 et 4 mg/kg)
– Diminution moyenne de l’ARN VHC à S4 : -4,4 Log UI/mL
– 7 patients avec ARN <LLOQ après 20 semaines de FU
van der Ree et al., EASL 2015.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

30.
• Activité antivirale in vivo
– 6 patients conservaient un ARN indétectable à S28 (1 G1, 2
G3, 3 G4)
van der Ree et al., AASLD 2015, Abstract 208.
RG-101 : Oligonucléotide anti-miR-122
Hépatite C : Virus et Marqueurs

31.
IV. LES DIFFÉRENTES
PROTÉINES VIRALES

32.
Protéines du VHC
Bartenschlager et al., Nature Reviews Microbiology 2013; 11, 482–496.
Assembly module Replication module
Hépatite C : Virus et Marqueurs

33.
Protéine de Capside
• Forme mature formée de ~177 amino
acides (21-kDa)
• Capacité de lier les lipides et l’ARN
• Structure tridimensionnelle non résolue
– Conformation en hélices alpha (~ 50%)
– Constituée de 2 domaines (D1 & D2)
Hépatite C : Virus et Marqueurs

34.
Protéine de Capside
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Boulant et al, J Virol 2005, 79(17): 11353-11365.
Domaine d’interaction avec l’ARN viral Domaine d’interaction
avec LD

35.
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
VHC G1b

36.
Glycoprotéine E2
Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
• Protéine de fusion classe II
– Hétérodimères avec E1
Hépatite C : Virus et Marqueurs

37.
Kong et al,Science. 2013 Nov 29;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Topologie de la Protéine E2 : Domaine “Ig-like“

38.
Structure de E2
Purple and red: Ig ß sandwich
Blue: CD81 receptor binding loop
Kong et al,Science 2013;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

39.
Glycoprotéine E2
Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
• Protéine de fusion classe II
– Hétérodimères avec E1
• Interaction avec récepteurs membranaires
– CD81
– SRB-I
Hépatite C : Virus et Marqueurs

40.
Étape Précoce : Entrée du VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700.

41.
E2 : Trois Domaines Variables
• E2 contient 3 domaines très variables
– HVR1
– VR2
– VR3
• Délétion HVR1 est non létale mais
augmente la sensibilité du virus aux
anticorps neutralisants
Hépatite C : Virus et Marqueurs

42.
Variabilité du VHC
Magiorkinis et al., PLoS Med. 2009;6(12):e1000198.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

43.
Transmission du VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs

44.
6a_33
2b_JFH1
Patient 1 (7/04)
5a_SA13
1b_HVR3812
S5 (7/05)
Patient 3 (7/05)
Patient 3 (9/05)
Patient 2 (7/04)
Patient 2 (9/04)
Patient 3 (7/04)
S4 (6/05)
S3 (6/05)
S2 (6/05)
Patient 3 (01/05)
S1 (6/05)
1a_HCT27X5
2a_Q2B
3a_CB
1a_HCT18X5
Patient 6
1b_AWV2C33
Patient 8
Patient 4
Patient 7
4a_ED43
0.2
100
Surfaces inertes
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
Patients VHC chroniques
Séroconversion VHC
Analyse Phylogénique
Région HVR1 (81 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
Hépatite C : Virus et Marqueurs

45.
Protéine p7
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Viroporine dont la
structure 3D a été
récemment déterminée
par ME
• Rôle(s) in vivo ?
• Cible thérapeutique
potentielle
Luik et al., Proc Natl Acad Sci 2009, 4;106(31): 12712-6; Griffin S, Proc Natl Acad Sci 2009, 106(31): 12567-68.

46.
Activité Antivirale du BIT225
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• IC50 de 314 nM dans le modèle du BVDV
• Activité synergique
Luscombe et al., Antiviral Res 2010;86(2):144-53.

47.
Activité Antivirale in vivo
• Phase II
- Patients VHC (G1a, G1b, G3)
- Patients VIH (inhibiteur de Vpu)
- Patients coinfectés
• Activité antivirale chez les patients G1 naïfs de
traitement
- 200 à 400 mg en combinaison avec SOC pendant 4
semaines suivi de la bithérapie pendant 44
semaines
Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

48.
Taux de Réponses Virologiques
• Futurs développements
– Génotypes 1 & 3
– 3 mois de traitement en association à pegIFN/RBV
– Evaluation de l’efficacité en association à d’autres
DAA
Treatment EVR (%) SVR % (n/N)
200 mg BIT225+ pegIFN/RBV 88 88
400 mg BIT225+ pegIFN/RBV 86 100 (7/7)
pegIFN/RBV 63 75 (6/8)
Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

49.
Protéine NS2
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• NS2 (région N-ter)
– Rôle dans
l’organisation de la
formation des
nucléocapsides
• NS2pro
(région C-ter)
Jirasko et al., PLoS pathog 2010;6(12): e1001233; Ivo et al., Nature 2006, 442: 831-835.

50.
Protéine NS3-4A
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.

51.
Inhibition de la Production d’IFN par NS3
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Rehermann B., J Clin Invest 2009;119(7):1745-54.

52.
Cibles des Antiprotéases
Lindenbach and Rice, Nature, 2005;436:933-938.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

53.
Saalau-Bethell et al. Nat Chem Biol 2012;8(11):920-5.
Mécanisme d’Action des Antiprotéases
Hépatite C : Virus et Marqueurs

54.
Raney et al., J Biol Chem 2010; 285(30): 22725-731.
Interaction du Telaprevir avec NS3
Hépatite C : Virus et Marqueurs

55.
Antiprotéases (anti-NS3/4A)
1ère
génération
1ère
vague
1ère
génération
2ème
vague
2ème
génération
Telaprevir Simeprevir Grazoprevir (MK-5172)
Boceprevir Paritaprevir/r ACH-2684
Asunaprevir
Vedroprevir
Vaniprevir
Spectre étroit (G1)
Faible barrière à la résistance
Activité pangénotype (sauf G3)
Faible barrière à la résistance
Activité pangénotype (~)
Forte barrière à la résistance
Hépatite C : Virus et Marqueurs

56.
Protéine NS5A
RNA binding
groove
Tellinghuisen et al., Nature 2005;435(7040):374-9.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

57.
NS5A est une Phosphoprotéine
• Existence de 2 formes
– p56
– p58 (forme hyperphosphorylée)
• Phosphorylations assurées par CKI-α*
au niveau de résidus sérine et thréonine
– PI4KIIIα régule le niveau de phosphorylation
*Casein Kinase I-α
Masaki et al., J Virol 2014;88(13):7541-55; Reiss et al., PLoS Pathog 2013;9(5):e1003359.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

58.
NS5A is “a Scaffold“ for other Viral
Proteins
Janardhan and Reau., Hepat Med 2015;7:11-20.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

59.
NS5A dans le Cycle Viral
• Nombreuses interactions protéiques
– Core, NS4B et NS5B du VHC
– Partenaires cellulaires (>100) dont CypA et
PI4KIIIα*
*phosphatidylinositol-4 kinase III alpha
Hépatite C : Virus et Marqueurs

60.
Recrutement et Activation d’une
Phosphatidylinositol Kinase (PI4KIIIα)
Reiss et al., Cell Host Microbe 2011;9(1):32-45.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

61.
NS5A dans le Cycle Viral
• Nombreuses interactions protéiques
– Core, NS4B et NS5B
– Partenaires cellulaires (>100) dont CypA et
PI4KIIIα
• Essentielle pour la réplication et
l’assemblage des nouvelles particules
virales
Hépatite C : Virus et Marqueurs

62.
Réplication versus Assemblage
p56 p58
CKI-α, PI4KIIIα
Chatterji et al., Antimicrob Agents Chemother 2015;59(5):2496-507.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

63.
Cibles des anti-NS5A
Lindenbach and Rice, Nature, 2005;436:933-938.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

64.
Activité Antivirale du Daclatasvir
Assay EC50
HCV replicon genotype 1a, H77 50±13 pM
HCV replicon genotype 1b, Con1 9±4 pM
HCV replicon genotype 2a, JFH1 71±17 pM
HCV replicon genotype 3a 146±34 pM
HCV replicon genotype 4a 12±4 pM
HCV replicon genotype 5a 33±10 pM
Infectious HCV, genotype 2a, JFH1 28±24 pM
Cytotoxicity Huh7 cells 17±1 µM
Gao et al., Nature 2010;465(7294):96-100.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

65.
Efficacité Antivirale du BMS-790052 après
Administration d’une Seule Dose per os
Gao et al., Nature 2010;465(7294):96-100.
-1.8 Log
-3.2 Log
Hépatite C : Virus et Marqueurs

66.
Interaction NS5A/anti-NS5A
Nettles et al., J Med Chem 2014;57(23):10031-43.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

67.
Inhibiteurs anti-NS5A
1ère
génération 2ème
génération
Daclatasvir Elbasvir ABT-530
Ledipasvir Velpatasvir ACH-3102
Ombitasvir
Activité G1 & G4
Autres génotypes variables
Faible barrière à la résistance
Activité pangénotype
Plus forte barrière à la
résistance (/1ère
))
Hépatite C : Virus et Marqueurs

68.
Modes d’Action des anti-NS5A
Eyre NS and Beard MR., Gastroenterology 2014;147(5):959-62.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

69.
Les anti-NS5A Bloquent la Formation de
novo des “Membranous Web“
Berger et al., Gastroenterology 2014;147(5):1094-105.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

70.
Les anti-NS5A Bloquent le Recrutement
de la PI4KIIIα
Reghellin et al., Antimicrob Agents Chemother 2014;58(12):7128-40.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

71.
Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999,
7: 1417-1426.
Protéine NS5B : RdRp
Hépatite C : Virus et Marqueurs

72.
Réplication
– Modèle du poliovirus
. Virus à ARN
monocaténaire de
polarité positive
De Clercq., Nature Review Drug Discovery 2007; 6: 1001-18.
Réplication Virale
Hépatite C : Virus et Marqueurs

73.
Variabilité Génétique
• Erreurs au cours de la réplication
– Fréquentes
. 10
-4
-10
-5
mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
– Spontanées
– Au hasard
• Absence d’activité exonucléasique 3’⇒5’
("proofreading")
– Accumulation de mutations
• A l’origine de :
– La diversification des types et des sous-types
– La distribution en quasi-espèces
Hépatite C : Virus et Marqueurs

74.
Diversification des Génotypes
Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
4
1
5a
3
2
6
7a

75.
Distribution des Génotypes
Manns and von Hahn., Nat Rev Drug Discov 2013;12(8):595-610.
Hépatite C : Virus et Structure

76.
Répartition des Génotypes en France
61%
9%
19%
9%
2%
Génotype 1 (n=961)
Génotype 5 (n=29)
Génotype 4 (n=144)
Génotype 2 (n=137)
Génotype 3 (n=293)
Génotypes6 (n=10)
0,6%
Brouard et al., J Hepatol 2009, 50(Supl. 1): S148 (abstract 390).
Hépatite C : Virus et Marqueurs

77.
Distribution en Quasi-espèce
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Domingo E., Cell 1978, 13 (4):735-744.

78.
Cibles des anti-NS5B
Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
Site A (Thumb/fingertips)
Site B (Thumb)
Site C (Palm)
Site Actif
Site D (Palm)
AA
BB
CC
DD
EE
Hépatite C : Virus et Marqueurs

79.
Inhibiteurs Nucléos(t)idiques de la RdRp
Site actif
AA
BB
CC
DD
Hépatite C : Virus et Marqueurs

80.
Nucleotide Analogues Act as a Chain
Terminator
SOF
3’
AG C
C GA CGGG
C
5’
Template strand
Primer strand
U
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Blocage de l’élongation
de la chaîne d’ARN
C

81.
Inhibiteurs Nucleos(t)idiques de la RdRp
Analogues
nucléotidiques
Sofosbuvir
MK-3682
ACH-3422
AL-335
Activité pangénotype
Forte barrière à la résistance
Hépatite C : Virus et Marqueurs

82.
Efficacité Antivirale du SOF
D8: -4.65 Log HCV RNA (median)
5/8 (63%) : RNA <15 IU/mL Lawitz et al., J Viral Hepat 2013;20(10):699-707.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

83.
Inhibiteurs non-Nucléosiques de la RdRp
Site A (Thumb I)
Site B (Thumb II)
Site C (Palm I)
Site D (Palm II)
AA
BB
CC
DD
Hépatite C : Virus et Marqueurs

84.
Inhibiteurs non-Nucléosidiques de la RdRp
Site A Site B Site C
Beclabuvir GS-9669 Dasabuvir
Spectre étroit (G1)
Faible barrière à la résistance
Spectre étroit (G1)
Faible barrière à la résistance
Spectre étroit (G1)
Faible barrière à la résistance
Hépatite C : Virus et Marqueurs

85.
V. CYCLE VIRAL

86.
Cycle Viral
deLemos & Chung., Trends Mol Med 2014;20(6):315-21.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

87.
Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
HCV Entry

88.
Réplication du VHC
• Mécanismes moléculaires encore mal
connus
• Localisation cytoplasmique au sein de
complexes de réplication (membranous
web)
– NS4B, NS5A, NS34A et NS5B (RdRp)
– Association étroite avec des facteurs cellulaires
Hépatite C : Virus et Marqueurs

89.
"Membranous Web"
Paul et al., J Virol 2013;87(19):10612-27.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

90.
Modèle de Réplication du VHC
• Selon modèle des virus à ARN ss polarité
positive (exemple du PV)
Ding., Nature Reviews Immunolog, 2010; 10: 632-644.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

91.
Assemblage & Sécrétion du VHC
Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.
Hépatite C : Virus et Marqueurs

92.
Hépatite C
Stratégie Diagnostique & Suivi
Virologique
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
des Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris-Est
Créteil

93.
Marqueurs indirects
Anticorps anti-VHC totaux
Marqueurs directs
Ag de capside (AgC)
ARN VHC
Génotype VHC
Profil de résistance
Marqueurs Virologiques
Stratégie diagnostique & suivi virologique

94.
Tests Sérologiques
• Détection des anticorps anti-VHC par EIA de 3ème
génération
• Tests “Combo”
– Détection simultanée de l’AgC et des anticorps anti-VHC
• TROD (test rapide d’orientation diagnostique)
• Détection et quantification de l’antigène de capside
(AgC)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

95.
Détection des Anticorps anti-VHC
• The first-line diagnostic test for HCV
infection
• Large number of commercially available
assays
– Specificity: ≥99.5%
– Sensitivity: ~100%
Stratégie diagnostique & suivi virologique

96.
Détection des Anticorps anti-VHC
• Trousses commerciales
• Faciles à utiliser, automatisées
• A l’aide d’un test de 3ème
génération
­ ADVIA Centaur (Siemens)
­ VITROS ECi (Ortho-Clinical Diagnostic)
­ AXSYM HCV 3.0 (Abbott)
­ Cobas Elecsys Modular HCV (Roche)
­ INNOTEST HCV Ab IV (Innogenetics)
­ Monolisa anti-HCV Plus version 2 (Bio-Rad)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

97.
Détection des Anticorps anti-VHC
• The first-line diagnostic test for HCV
infection
• Large number of commercially available
assays
– Specificity: ≥99.5%
– Sensitivity: ~100%
– Low predictive values in populations with a low
HCV prevalence (<10%)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

98.
Importance of the Signal-to-Cutoff Ratios
for EIA Assays
Screening Test Manufacturer Signal-to-cutoff ratio predictive of
a true positive ≥95%
Ortho HCV 3.0 ELISA test Ortho ≥3.8
Abbott HCV EIA 2.0 Abbott ≥3.8
VITROS anti-HCV Ortho ≥8.0
AxSYM anti-HCV Abbott ≥10.0
Architect anti-HCV Abbott ≥5.0
Advia Centaur HCV Bayer ≥11.0
Guidelines for Laboratory Testing and Result Reporting, CDC; http://www.cdc.gov/hepatitis/hcv/labtesting.htm
Stratégie diagnostique & suivi virologique

99.
Test “Combo“ (AgC/Anti-VHC)
• Diagnostic de l’infection par le VHC
– Trousses commerciales (2 trousses disponibles)
– Faciles à utiliser
– Non automatisées
– Diminution de la fenêtre sérologique d’environ
20-30 jours
– Moins sensibles que les tests de 3ème
génération
pour la détection des anticorps anti-VHC
Stratégie diagnostique & suivi virologique

100.
Tests rapides Disposant d’un Marquage CE/IVD
ou OMS pour la Détection des Ab anti-VHC
Oraquick
®
HCV
Toyo®
HCV
Labmen®
HCV
Multisure
HCV
Signal
HCV v2.0
HCV
TriDot 4th
Manufacturer Orasure Turklab Turklab
MP
Diagnostics
Span
Diagnostics
J Mitra & Co
Specimen
type
oral fluid,
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
serum,
plasma
serum,
plasma
Volume
required (µL)
40 (oral
fluid)
20
30 10 25 100
One drop
(35 µL)
Time to read
(min)
20 15 15 15 10 3
Stratégie diagnostique & suivi virologique

101.
Tests rapides “en cours de Marquage CE/IVD“
pour la Détection des Ab anti-VHC
Assure®
HCV
First Response®
HCV
Manufacturer MP Diagnostics
Premier Medical
Corporation Ltd
Specimen type
whole blood,
serum, plasma
whole blood,
serum, plasma
Volume required
(µL)
50 One drop (35 µL)
Time to read (min) 15 20
Stratégie diagnostique & suivi virologique

102.
Performance of RDT
Capillary Whole Blood
Tests Specificity Sensitivity
OraQuick®
HCV Rapid Ab Test 100% 99.4%
TOYO®
anti-HCV test 98.8% 95.8%
Labmen®
HCV test 100% 63.1%
Chevaliez et al., Clin Microbiol Infect. 2016, in press.
• 318 patients with chronic HCV infection; 25 patients
with resolved HCV infection; 170 HCV-seronegative
subjects
Stratégie diagnostique & suivi virologique

103.
Tests Specificity Sensitivity
OraQuick®
HCV Rapid Ab Test 100% 97.6%
• 318 patients with chronic HCV infection; 25 patients
with resolved HCV infection; 170 HCV-seronegative
subjects
Performance of RDT
Crevicular Fluid
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Chevaliez et al., Clin Microbiol Infect. 2016, in press.

104.
Performance of RDT
Meta-analysis
• More than 13,000 individuals included in 18 studies
between 1994 and 2011
– Stratification according to matrix specimens
. Whole blood (venous and capillary): 4,259 specimens
. Saliva: 3,994 specimens
Specimen Specificity Sensitivity
Whole blood 99.5% 98.9%
Saliva 98.2% 97.1%
Shivkumar et al., Ann Intern Med 2012;157(8):558-66.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

105.
Antigène de Capside : un Marqueur
de la Réplication
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNAlevel m2000 (LogIU/mL)
HCVcoreAglevel(Logfmol/L)
r=0.89;p<0.0001
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNAlevel CAP/CTM v2.0 (LogIU/mL)
HCVcoreAglevel(Logfmol/L)
r=0.88;p<0.0001
Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

106.
Antigène de Capside en Fonction des
Génotypes
Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

107.
Interests of HCV Core Ag Quantification
• A surrogate marker of HCV replication
• New tool for the monitoring of virologic
response during IFN-free DAA regimens
• Many advantages over the molecular
methods
– Cheaper (30-50% less expensive than molecular
method)
– Stability of marker at RT for 96 hours
– Short time to result
Stratégie diagnostique & suivi virologique

108.
Tests Moléculaires
Détermination
du Génotype
Quel est le génotype du VHC ?
Détection de la résistanceDétection de la résistance
Quel type de VHC est présent ?
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?
Tests Qualitatifs-Quantitatifs
Stratégie diagnostique & suivi virologique

109.
- Identify active viral replication
- Make appropriate decisions
. Shorten or extend treatment duration
. Stop treatment due to futility
­ Identify treatment failure and the emergence
of resistance
. Virological failure is associated with selection of viral
variants with reduced susceptibility to DAAs
Clinical Utility of HCV RNA Assays
Stratégie diagnostique & suivi virologique

110.
Requirements for HCV RNA Assays
• Real-time-based assays with
– A low lower limit of detection
– A broader range of linear quantification
– Identical lower limits of detection (LLOD) and
quantification (LLOQ)
• Satisfactory analytical performance, regardless
of the HCV genotype
Stratégie diagnostique & suivi virologique

111.
Range of Linear Quantification
Stratégie diagnostique & suivi virologique
10 102
103
104
107
108
Cobas Amplicor
HCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNA
Assay
Versant HCV RNA
3.0 (bDNA)
CTM HCV test v2.0CTM HCV test v2.0
(Roche)(Roche)
RealTiRealTimme™ HCVe™ HCV
(Abbott)(Abbott)
Artus HCV QS-RGQArtus HCV QS-RGQ
(Qiagen)(Qiagen)
CAP/CTM HCV test,CAP/CTM HCV test,
v2.0 (Roche)v2.0 (Roche)
105
106
Chevaliez et al., Gastroenterology 2012;142(6):1303-1313.

112.
Quantification de l’ARN VHC (CTM v1.0)
Adapted from Chevaliez et al., Hepatology 2007;46(1): 22-31.
HCVRNAlevelinCAP/CTMv1.0(Log10IU/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA
(Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3
876543 876543
Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and
bDNA (Log10IU/mL)
Differencebetween
CAP/CTMv1.0andbDNA(Log10IUI/mL)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
-0.15
+0.48
+1.11
Genotype 3 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 1 (n=29) Genotype 4 (n=30)
Genotype 6 (n=2)
Genotype 5 (n=9)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

113.
Impact de Substitutions Nucléotidiques
sur la Quantification de l’ARN du VHC
Chevaliez et al., Hepatology 2009;50(5):1681.
WT G4 or WT G1
A165T or G145A
G145A+A165T
HCVRNAlevels(Log10IU/mL)
5.7
6.1
6.4
4.0
6.0
6.7
4.3
5.9
6.3
<1.2
6.0
6.6
0
2
4
6
8
CTM v1.0 m2000RT bDNA
Stratégie diagnostique & suivi virologique

114.
Quantification de l’ARN VHC G4
(CAP/CTM v2.0)
HCVRNAlevelinCAP/CTMv2.0(Log10IU/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA (Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3
876543 876543
Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and
bDNA (Log10IU/mL)
Differencebetween
CAP/CTMv1.0andbDNA(Log10IUI/mL)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
+0.08
+0.35
+0.62
Genotype 4 (n=122)
Chevaliez et al., J Clin Microbiol 2013;51(4):1078-82.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

115.
Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-32.
HCV RNA Quantification
(m2000, Abbott)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 2 (n=21)
Genotype 1 (n=55) Genotype 4 (n=24)
Genotype 6 (n=3)
Genotype 5 (n=9)
876543
Mean of HCV RNA levels in m2000 and bDNA
(Log10IU/mL)
Differencebetween
m2000andbDNA(Log10IUI/mL)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
-0.06
+0.26
+0.58
HCVRNAlevelinm2000(Log10IU/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA
(Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3
876543
Stratégie diagnostique & suivi virologique

116.
HCV RNA Quantification
(GenXpert)
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNAlevel m2000 (LogIU/mL)
HCVRNAlevelXpert(LogIU/mL)
Genotypes1 to4 (n=46)
r=0.99;p<0.0001
0
-1.5
-0.5
0.5
1.5
Meanof HC
DifferencebetweenXperytHCVandm2000
(Log₁₀IU/mL)
Unpublished data.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

117.
HCV RNA Level Assessment in the Era of DAA
• HCV RNA quantification should be regularly assessed
before, during and after treatment
• HCV RNA quantification should be based on a real-
time PCR (or TMA) assay
– With results expressed in IU/mL
– With identical LLOD and LLOQ, of the order of 10-15 IU/mL
• In a given patient, HCV RNA level monitoring must
be performed with the same real-time assay
Stratégie diagnostique & suivi virologique

118.
Europe or FDA Approval for HCV RNA
Quantification Tests
• 2 tests are approved by the FDA and in Europe
for HCV RNA quantification in clinical practice
– m2000 since May 2011
– New version of CAP/CTM since March 2013
• 1 test is approved only in Europe for HCV RNA
quantification in clinical practice
- Xpert HCV viral load since May 2015
Stratégie diagnostique & suivi virologique

119.
Génotypes
Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.
4
1
5a
3
2
6
7a
Stratégie diagnostique & suivi virologique

120.
Détermination du Génotype
• Méthodes moléculaires (genotyping)
– Analyse de la séquence après séquençage direct
– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype
spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes
génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”)
– ELISA compétitif
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

121.
Arens et al., J Clin Virol 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
• Méthodes moléculaires (genotyping)
– Analyse de la séquence après séquençage direct
– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype
spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes
génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”)
– ELISA compétitif
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype

122.
Analyse Phylogénique après Séquençage
Direct
Région NS5B(286 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-
parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
5aSA13
2aHCJ6
Patient 49
6aEUHK2 3aNLZ1
Patient 62
4aED43
1hFrSSD98
1h98CM1357
1h98CM1521
1cHCG9
1cSR031
1cKhaja1
1aHCV1
1aHCVH
1aHCJ1
1jQC2
1jQC89
1kQC68
1kQC82
1eM4541N
1eCAM1078
1eQC172
1g1382
1g2152
1gEG024
1lM5186N
1l98CM1427
1l98CM1457
1fFR2
Patient 59
Patient 46
Patient 54
Patient 2
Patient 28
Patient 64
Patient 16
Patient 36
Patient 18
Patient 17
Patient 8
Patient 7
1bHCJ4
1bHCVBK
1bHCP01
Patient 40
1iFR16
1iQC77
1iQC181
Patient 48
Patient 60
Patient 52
Patient 26
1dFR17
1dHC1N16
1dBA107
1mGUI17
1mGUI11
1mGUI24
0.05
59
99
96
34
100
72
100
98
43
Génotype 2
Génotype 4
Génotype 3
Génotype 1
Génotype 6
Génotype 2
Génotype 5
Génotype 1, sous-type b
Génotype 3, sous-type a
Génotype 1, sous-type i
Génotype 1, sous-type ?
100
Stratégie diagnostique & suivi virologique

123.
Versant®
HCV Genotype 2.0 Assay
(INNO-LiPA)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

124.
Résumé
• Détermination du génotype (sous-type)
VHC
– La détermination du génotype sur la seule
région 5’NC doit être proscrite
– La 2nde
génération de Line Probe Assay qui utilise
des sondes dirigées contre la région core en
plus de la région 5’NC est la meilleure méthode
permettant de distinguer les sous-types 1a et
1b
EASL CPG., J Hepatol 2015; 63:199-236.
Stratégie diagnostique & suivi virologique

125.
Tests de Résistance Disponibles en Europe
• Aucune trousse commerciale disponible
• Uniquement des techniques de séquençage direct
“maison“ de la protease NS3, du domaine I de la
NS5A et de la NS5B
• Méthodes de séquençage ultra-sensible en
développement (NGS)
–Sentosa SQ HCV Genotyping Assay (VELA Diagnostics)
Stratégie diagnostique & suivi virologique

126.
Tests de Résistance Disponibles en Europe
• Méthodes commerciales disponibles pour les trois
régions ciblées par les DAA
– ARN du VHC ≥2000 UI/mL requis
– Basée sur technique NGS (cut-off 10%)
– G1a or 1b
Stratégie diagnostique & suivi virologique

127.
Tests de Résistance Disponibles en Europe
• Test de résistance systématique en pré-traitement
chez des patients naïfs ou en échec de bithérapie ?
­ Taux de RVS élevés
– Impact des RAV NS5A sur la réponse au traitement
chez les patients cirrhotiques en échec
• Test de résistance en cas d’échec du traitement ?
– La plupart des patients ont des variants résistants
au moment de l’échec
• Test de résistance pour le retraitement ?
­ Des données supplémentaires sont nécessaires
Stratégie diagnostique & suivi virologique