Immunocytochimie ou cytométrie en flux

1. MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE d’ALGER 1 BEN YOUCEF BEN KHEDDA
FACULTE DES SCIENCES – DEPARTEMENT SNV
SPECIALITE BIOCHIMIE APPLIQUEE
1ERE ANNEE MASTER (2018/2019)
Quelle technique adopter pour le phénotypage des alvéolites
lymphocytaires : immunocytochimie ou cytométrie en flux ?
HOUMA Melissa
LAHLOUH Lamia
LANASRI Naima
LOUNES Rania
ZAIDI Amina

2. PLAN :
I. Généralités
II. Classification des pneumopathies interstitielles diffuses
III. Diagnostic des alvéolites lymphocytaires
1. Lavage Broncho Alvéolaire
2. Immunocytochimie :
• Sur étalement
• Sur cytoblocs
3. Cytométrie en flux
IV. Conclusion

3. Généralités:
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) représentent un groupe hétérogène de
pathologies pulmonaires diffuses dont la caractéristique histologique est
L’atteinte de l’interstitium pulmonaire (espaces entre les
cellules alvéolaires et des membranes basales endothéliales )
par de l’inflammation et de la fibrose en proportions
variables.

4. Classification de 2012 (D'après ATS (American thoracic society) et ERS(European Respiratory society)
Classification des PID
Cause connue idiopathiques
rares
Majeures inclassables
Granulomatose
Formes
particulières
Chroniques
fibrosantes
Aiguës,
subaiguë PI lymphoïde
idiopathique
Liées au tabac
Fibroélastose pleuro-
pulmonaire
idiopathique

5. Dans cette étude nous prendrons l’exemple de l’alvéolite lymphocytaire pour
comparer entre les deux techniques : cytométrie en flux et l’immunocytochimie.
Qu’est ce que l’alvéolite lymphocytaire ?
De façon générale L’alvéolite lymphocytaire se caractérise par une inflammation des alvéoles
( de petits sac contenant l‘air dans les poumons) , s’accompagnant d’un afflux des leucocytes.
Elle existe en plusieurs types:
- Alvéolite infectieuse ( Pneumopathie bactérienne).
- Alvéolite fibrosante: due à une réaction auto-immune.
- Alvéolite radique: complication de la radiothérapie
des cancers du poumon et du sein( inflammation liée à la
pénétration des rayons X ).
- Alvéolite allergique : fait suite à une allergie respiratoire
due à l’inhalation des déjections d’oiseaux, de moisissures
des foins. Elle entraîne une pneumopathie d’hypersensibilité.

6. Physiopathologie des Pneumopathies d’hypersensibilité:
 Plusieurs antigènes sont impliqués dans le processus
pathogénique( micro-organismes, insectes, produits
chimiques de bas poids moléculaire…).
 l’antigène inhalé produit une augmentation du nombre des
lymphocytes sans avoir de conséquences cliniques.
 La coexistence de facteurs génétiques et environnementaux
provoque une réaction immunitaire exagérée ce qui induit
un processus inflammatoire pulmonaire.

7. Réponse immunitaire Th1
=> production de nombreux
médiateurs pro-inflammatoires
qui interviennent dans le
recrutement de plusieurs cellules.
Formation d’un
granulome
Hypothèse de la physiopathologie des pneumopathies d’hypersensibilité

8. Formation d’un
granulome
Lors d’une exposition répétée à un antigène
avec une prédisposition génétique ceux-ci
incitent le recrutement et l’activation des
fibroblastes et l’accumulation de la matrice
extra cellulaire induisant une évolution
chronique vers une fibrose.

9. Etapes du Diagnostic des PID :
La démarche diagnostique dans les PID est le résultat d’une confrontation multidisciplinaire
entre : - pneumologues,
- radiologues et
- pathologistes
En effet, le diagnostic des PID est porté selon des arguments cliniques, radiologiques et
anatomopathologiques.

10. Manifestations cliniques
• Les symptômes débutent le plus souvent avec une dyspnée et d’une toux
• Ces symptômes ne sont pas typiques des PID et ne permettent pas
d’orienter le diagnostic étiologique.
Aspects radiologiques
• La radiographie du thorax donne une vision globale de l’atteinte
parenchymateuse, de préciser la topographie des lésions par rapport aux
structures anatomiques normales. Elle permet surtout de surveiller
l’évolution des lésions dans le temps.
Selon les nouvelles recommandations de l’ATS et de l’ERS, le LBA doit être réalisé dans toute PID confirmée radiologiquement

11. Lavage Broncho-Alvéolaire (LBA):
• C’est un outil fondamental du diagnostic positif
des PID avant d’envisager d’autres moyens
diagnostiques tels que la biopsie.
• Il permet d’explorer le poumon profond en
détectant les cellules ( inflammatoires,
néoplasiques …) ou le matériel acellulaire
(lipoprotéines) anormal et la mise en évidence
de nombreux agents pathogènes.
• C’est un outil très pratique pour le suivi de
l’évolution des processus pathologiques ou
pour évaluer la réponse à un traitement.

12.  Le LBA est réalisé au cours de la
fibroscopie.
 Du liquide isotonique stérile est instillé
à travers le canal généralement un
volume total de 100-300 ml puis le
recueil se fait entre chaque lavage.
 Il contient les cellules et substances des
cavités pulmonaires et sa composition
reflète l’infiltrat cellulaire interstitiel et
le contenu alvéolaire.
Réalisation lavage broncho alvéolaire LBA

13. Il est reçu dans les laboratoires dans des flacons
numérotés siliconés (ne permettant pas l’adhésion
des cellules).
Sa conservation:
- Si le temps de transport jusqu’au laboratoire < 30
minutes => T° ambiante
- Si t=30 à 60 minutes => T° 4 °C.
- Si t > 60minutes il est conseillé de centrifuger les
cellules et de les mettre en suspension dans un
milieu nutritif (à 4 °C) ce qui permet de les
conserver pendant 24 h.
Si la centrifugation n’est pas possible, il est
recommandé d’ajouter du milieu nutritif dans le
liquide de lavage et de le stocker à 4 °C ce qui
permet une conservation pendant 12 h.
Acheminement du LBA

14. Après la réception du liquide à explorer:
1. On note l’aspect du liquide qui peut nous
aider à suggérer un diagnostic précis (par
exemple : l’aspect hémorragique oriente
vers une hémorragie alvéolaire, l’aspect
laiteux ou gras oriente vers une
lipoprotéinose).
2. On mesure le volume du LBA en mL sans
filtration car la filtration altère les cellules,
notamment les lymphocytes.
Interprétation du LBA

15. 3. On fait une homogénéisation du
LBA à l’aide du Vortex Mixer.
4. On évalue ensuite la richesse
cellulaire à l’aide de la cellule de
Malassez.
Richesse cellulaire
normale 150 -300000C/ml
Viabilité cellulaire :
au bleu de trypan
cellule
cellule

16. Cytocentrifugation
Le processus de cytocentrifugation implique une centrifugation à basse vitesse du fluide obtenu
après LBA, Permet à la fois de concentrer les cellules et maintenir la morphologie cellulaire.
1. Etaler la suspension entre lame et
lamelle 2. Monter la lame dans un diapositif qui va dans la centrifugeuse

17. 3. Démarrer la centrifugeuse à
1200/min pendant 10 min
4. Après centrifugation les cellules sont
centrées dans une zone déterminée

18. Coloration
Après séchage à l’air pendant environ une à deux heures, des colorations standard étaient faites :
la coloration au MGG et Papanicolaou.
1- May-Grünwald Giemsa (MGG):
est une méthode de coloration utilisée pour différencier les cellules du sang lors des préparations
cellulaires.
Il repose sur l'action combinée de deux colorants neutres :
Le May-Grünwald, contenant un colorant acide, l'éosine, et un
colorant basique, le bleu de méthylène.
Le Giemsa, contenant lui aussi de l'éosine, et un colorant
basique, l'azur de méthylène.
Les constituants cellulaires acides, fixeront électivement les
colorants basiques ( ADN, LYMPHOCYTES …)
Les constituants cellulaires basiques, fixeront électivement les
colorants acides ( granulations des éosinophiles ..)
Résultat :
Les noyaux sont de bleu à violet-noir,
Les hématies sont beige-rosé,
Les granulations des grands lymphocytes sont pourpres.

19. 2- Papanicolaou:
Elle permet de différencier les cellules en fonction de leur maturité et de leur activité métabolique
Le colorant de Papanicolaou est composé de trois colorants :
L’hématoxyline de Harris: colore les noyaux des cellules grâce à son affinité avec l’ADN.
L’orange G (OG 6): réagit avec les cellules squameuses matures de par son affinité avec la kératine.
L’éosine-azur (EA 50): réagit avec le cytoplasme des cellules squameuses non matures
(cellules basales et intermédiaires) ainsi qu’avec les hématies.
Résultats:
Les noyaux des cellules sont colorés en bleu/noir,
Les cytoplasmes des cellules sont en rose/orange
/transparent,
Les hématies sont en rouge.

20. L’orientation du diagnostic se fait selon le pourcentage des du type cellulaire présent dans le
liquide du LBA.

21. Nous avons colligé 32 cas
d’alvéolites lymphocytaires
Lavage broncho alvéolaire
Diagnostic au service d’anatomie pathologique :
• Pour l’analyse cytologique de LBA.
• Et marquage Immunocytochimique.
Dans le département d’hématologie :
• Pour le phénotypage par Cytométrie en flux.
Dans cette étude:

23. Référence a l’anticorps utilisé dans la procédure
Évoque l’étude des cellules

24.  Soit l’anticorps peu être marquée par un fluorophore qui émettra une lumière âpres avoir excité.
 Soit l’anticorps est conjugué a une enzyme « peroxydase »
( disponible en grande quantité , peu couteuse , couplée de façon stable a des protéines).
 Soit l’anticorps peut être couplée a des billes d’or microscopique ce qui permet d’obtenir un
marquage et une localisation dans la cellule grâce à un microscope électronique.
 C’est une technique qui permet de localiser des antigènes ou molécules d’ intérêt au sein
d’une ou plusieurs cellules grâce à l’utilisation d’anticorps spécifiques dirigés contre
l’antigène d’intérêt à détecter.
 Cette localisation est visualisée par plusieurs façon :

25. Deux méthode de détection :
 Cette méthode utilise
uniquement un anticorps
primaire qui est couplé avec un
marqueur, et donc lie
directement l’échantillon.
1) Méthode direct :
 est utilisée quand la quantité des
antigènes dans les cellules est très
importante.

26. 2) Méthode indirect
 Utiliser un anticorps secondaire couplé au
marqueur et dirigé contre l’anticorps primaire.
 La détection de protéines de faible
abondance peut être parfois difficile même
avec des méthodes indirect.
 Les anticorps biotynilés permettent une
amplification accrue du signal.

27. Amplification par le système biotine / streptavidine :
 La streptavidine est une glycoprotéines qui a une grande affinité pour la biotine , peut lier 4
d’entre elles , peut être couplée aux enzymes.
 d’autre part la biotine peut être couplées aux anticorps.
 cette technique d’amplification procède en trois étapes :
Liaison de l’anticorps
primaire à l’antigène
Liaison d’un Ac
secondaire biotinylé à
Ac primaire
Liason de la
streptavidine
peroxydase à la biotine

28. Dans cette étude c’est la méthode indirect qui a été utilisée ainsi deux
procédures de marquage immunocytochimique ont été réalisées :
marquage sur des coupes
incluses en paraffine
(cytoblocs)
marquage sur des
étalements cytologiques
frais

29. étalements cytologiques frais

30. Etalement des cellules sur une lame de verre
Liquide du LBA

31. Fixation :
 Par séchage à l’air
 Par fixation chimique ( formol , méthanol…. )

32. Immunomarquage des cellules :
Blocage des peroxydases
endogènes par incubation
avec la peroxydase
d’hydrogène pendant
10 minutes.
Lavage avec TBS
« solution saline
tamponnée » (3 bacs de
5 minutes chacun).
Incubation avec anticorps
primaire «anti CD3 CD4 ,CD8»
dans une chambre humide
à température ambiante
pendant 1 heure.
est une étape nécessaire , si elle est
éliminée du protocole, les peroxydases
endogènes peuvent provoquer une
précipitation des chromogènes qui produit
une coloration de fond.

33. Lavage avec TBS
Incubation avec postprimary block (30 minutes )
Lavage
Incubation avec polymère peroxydase (l’anticorps secondaire)
30 min
Lavage

34. Révélation :
Réalisée avec le
chromogène DAB
(diaminobenzidine)
Rinçage à l’eau
L’obtention d’une coloration brune

35. Contre coloration et montage :
Réalisée avec
l’hématéine de
Mayer
Rinçage sous l’eau
5min
Déshydratation dans 3 bains d’alcool
éthylique de concentration croissante
70%, 80 % et 96 % pendant
5 minutes chacun
Montées avec un milieu de montage
adapté au toluène/xylène.

36. Résultats :
Parmi les 28 cas concluants:
 Une lymphocytose à CD4 était
observée dans 20 cas (71,4 %) .
 Une lymphocytose à CD8 était
observée dans 8 cas (28,6 %)
non concluatnts
(4 cas)
concluants
(28 cas)
12,5 %
87,5 %
Dans les 4 cas non concluants :
ce fait pourrait être expliqué par
des problèmes d’acheminement et
de conservation du liquide de
lavage qui sont tributaires des
services cliniques

37. Résultats :
Marquage membranaire des
lymphocytes par l’anticorps anti-CD4.
Marquage membranaire des
lymphocytes par l’anticorps anti-CD8.

38. Immunocytochimie sur étalements Immunocytochimie sur cytoblocs
• Etalement
• Fixation
• Marquage immunocytochimique
• Contre coloration et montage
• Fixation
• Déshydratation
• Enrobage dans la paraffine et
confection des cytoblocs
• Déparaffinage
• Démasquage antigénique
• Marquage immunocytochimique
• Contre coloration et montage
Protocole de l’immunocytochimie :
• Etapes spécifiques a chaque technique
• Etapes communes entre les deux techniques

39. Fixation avec l’alcool-formol-acide
acétique (AFA) pendant au minimum
3 heures.
Centrifugation à 1500 tours/min pendant
3 minutes.
Liquide du LBA
On regroupant les différents culots et on
les glisse dans une cassette à inclusion
entre deux tissus mousses.
Immunocytochimie sur cytoblocs

40. Cassette à inclusion
Tissu
Mousse
Echantillon
(culots)
Immunocytochimie sur cytoblocs
Dépôt des culots dans une cassette a inclusion

41. Déshydratation
La paraffine n’est pas miscible dans
l’eau, la déshydratation progressive
dans des bains d’alcool éthylique de
degrés croissants jusqu’à l’alcool
absolu (70, 80, 95 et 100°) permet au
fur et à mesure de remplacer l'eau par
l'alcool. Cette opération peut être
réalisé à l’aide d’un automate de
déshydratation et dure jusqu’à 16
heures.
Immunocytochimie sur cytoblocs

42. Enrobage dans la paraffine
Immunocytochimie sur cytoblocs
Moule
Echantillon
Paraffine

43. On place les moules enrobé de
paraffine sur une surface froide.
Une fois la paraffine est solidifiée
on obtient des cytoblocs.
Immunocytochimie sur cytoblocs
Enrobage dans la paraffine
Cytoblocs

44. Réalisation des coupes
Les coupes sur les cytoblocs ont été réalisées à l’aide d’un microtome
avec une épaisseur variant de 3 à 4 microns.
Immunocytochimie sur cytoblocs

45. Immunocytochimie sur cytoblocs
Réalisation des coupes
Ensuite elles sont montées sur des
lames silanisées et on les laisse sécher.
Les coupes sont placées dans de
l’eau chaude entre 27 et 30°C.

46. Lames silanisées
séchées à l’air libre.
Portées à 56°C dans une
étuve pendant 12 à 24
heures au point de fusion
de la paraffine.
Déparaffinage dans 3
bains de toluène
(5 minutes chacun).
Réhydratation dans 3 bains d’alcool
éthylique de concentration décroissante
100°,70°et 50° (5 minutes chacun).
Lavage des lames à
l’eau distillée.
Immunocytochimie sur cytoblocs
Déparaffinage

47. Démasquage antigénique
Les lames ont été immergées dans un
tampon citrate puis chauffées au four à
micro-ondes (2 cycles: 5 minutes à
90°C et 10 minutes à 97°C).
Après avoir été refroidies sur la
paillasse à température ambiante
pendant 20 minutes les lames ont
été rincées à l’eau distillée.
Immunocytochimie sur cytoblocs
Les coupes ont été délimitées avec un
crayon hydrophobe.
 Vise à rompre les liaisons moléculaires créées
par le fixateur
 Permet une accessibilité aux sites antigéniques
 Les lames sont ainsi préparés pour le marquage
immunocytochimique sur blocs et la contre
coloration.

48. Immunocytochimie sur cytoblocs
Résultats: Réalisée chez 17 patients ( 53,1%), les autres cas n’ont pas pu
être étudiés vu l’absence du culot lors de l’inclusion en paraffine.
Non
concluants
41,2%
Concluants
58,8%
 Fixation insuffisante des
lames.
 Mauvais séchage.
 Démasquage insuffisant
secondaire à un tampon de
pH inapproprié.
10 cas interprétables 7 cas non concluants
Une lymphocytose
à CD4 dans 4 cas (40%)
à CD8 dans 6 cas (60%)

49. Immunocytochimie sur cytoblocs
Résultats
Marquage membranaire des lymphocytes
par l’anticorps anti-CD4 sur cytobloc.
Marquage membranaire des lymphocytes
par l’anticorps anti-CD8 sur cytobloc.

50. Rapport
CD4/CD8
< 1,6
(5 cas)
≥ 1,6
(1 cas)
≥ 1,6
(1 cas)
< 1,6
(1 cas)
Immuno-
cytochimie sur
étalements
62,5 % 12,5 % 25 % /
Immuno-
cytochimie sur
cytoblocs
62,5 % 12,5 % / 25 %
Comparaison entre immunocytochimie sur étalements et
immunocytochimie sur cytoblocs
Bonne reproductibilité entre les 2 techniques (même laboratoire, mêmes conditions
d’acheminement et de conservation).
Selon ces résultats, le coefficient de concordance kappa est estimé à 0,7
Les deux techniques ont été réalisées simultanément dans 17 cas avec des résultats
interprétables dans 8 cas.

52. CELLULE
MESURE
FLUIDE

53. CYTOMETRIE EN FLUX
1. Principe de la technique.
2. Les composants de la cytométrie en flux :
i. Système fluidique.
ii. Système optique.
iii. Système électrique.
3. Traitement des données.
4. Intérêt d’applications.
5. Protocole expérimental :
 Interprétation des résultats.
 Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements et en cytométrie en flux.
 Comparaison des résultats en immunocytochimie sur cytoblocs et en cytométrie en flux.
6. Avantages et inconvénients de la cytométrie en flux.

54. La cytométrie en flux (CMF) est une technologie permettant l'analyse
individuelle de cellules où les cellules sont alignées selon le principe du
centrage hydrodynamique avant de passer devant un faisceau laser.
Les phénomènes optiques engendrés permettent une analyse
multiparamétriques des caractéristiques physiques (taille, structure) des
cellules des liquides biologiques (sang, ascite, épanchement pleural…)
après incubation avec des réactifs le plus souvent fluorescents, présentant
ainsi de nombreuses applications dans divers domaine.

55. 1. Principe :
La Cytométrie en flux est une technique qui nous permet de mesurer simultanément de
multiples caractéristiques physiques d’une cellule ainsi que l’enregistrement du
comportement de la cellule quand celle-ci passe devant le laser et cela grâce
à la diffusion de la lumière incidente et l’émission de la fluorescence.

56. 2. Les composants du Cytomètre en flux :
i. Le système fluidique:
C’est un système base sur le principe de focalisation
hydrodynamique. Il s'agit d'un flux laminaire
(liquide de gaine) qui permet aux cellules en
suspension de traverser individuellement le faisceau
laser focalisé sur l'axe du jet.

57. ii. Le système optique:
La lumière émise par les cellules après qu’elles aient été irradiées dans la chambre de
flux est dirigée vers un ensemble de détecteurs par un système complexe de miroirs et
filtres qui constituent le système optique.
La lumière (photons) qui traverse un système optique doit être convertie en un signal
électronique par des photomultiplicateurs afin de permettre l’acquisition et l’analyse
de données.

58. iii. Le système électronique :
Les signaux émis sont focalisés, séparés par une alternance de miroirs et de filtres
optiques, en fonction de leur longueur d'onde.
Ils sont ensuite amplifiés et transformés en impulsions électriques par les
photomultiplicateurs puis digitalisés pour être utilisés par l'unité informatique.
Ainsi il est possible d’identifier des sous‐populations de cellules spécifique à l’aide de
fluorochromes appropriés pour chaque type cellulaire.

59. Figure 1 : Les différents systèmes composants le cytomètre en flux.
Système fluidique
Laser
Système optique
Détecteurs
Système électronique :
Analyse de données

60. 3. Traitement des donnés:
 Suivant l’axe du laser (Forward Scatter, FSC):
Il fait un angle d’environ 180° avec le flow cell. La lumière diffractée est donc collectée
sous un petit angle (1-10°).
Le signal est relatif à la taille de la cellule; une cellule de petite taille diffuse moins de
lumière qu’une cellule de grande taille.
taille

61.  Suivant 90° de l’axe du laser (Side SCatter, SSC):
Le signal recueilli par ce filtre est relatif à la granularité de la cellule et qui correspond à
la complexité de la cellule (densité des organites, des irrégularités internes ou de
surface).

62. Figure 2: Présentation des résultats en cytométrie en flux.
Le logiciel affiche le graphique en nuage de points de la taille des cellules (mesure FSC)
en fonction de la granularité (mesure SSC).
On repère ainsi les trois populations de leucocytes :

64. 5. Intérêt d’applications :
Les applications sont multiples, avec la cytométrie,
il est possible de :
► Suivre une population de cellules par la taille et la granularité du cytoplasme.
► Evaluer la présence de protéines membranaires sur des cellules vivantes, et de
protéines cytosoliques sur des cellules perméabilisées.
► Trier des cellules vivantes selon l'expression de ces marqueurs.
► Suivre un gène rapporteur fluorescent après transfection.
► Evaluer la viabilité d'une population de cellule, sa mortalité et le type de mort.
► Diagnostiquer certains déficits immunitaires et autres anomalies:
Alvéolites lymphocytaires.

65. 100 μL de LBA
Centrifugation
10 min à 1200
tours/min
PBS : Le sérum physiologique
tamponné au phosphate
Contrôle
Tube pour le marquage par les
anticorps
Incubation avec
les anticorps
monoclonaux
couplés à des
fluorochromes
5. Protocole expérimental:
Le culot
Eau distillée
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4 HCL
Lavage avec 2 ml
de PBS.
Centrifugation
10 min à 1200
tours/min
Fixation par
paraformaldéhyde

66. o Les fluorochromes supports de l'étude multiparamétrique:
Aujourd'hui, on réalise une véritable étude multiparamétrique
afin d'obtenir une analyse complète où la cytométrie utilise
des marqueurs fluorescents, ces fluorochromes sont
associés à des anticorps qui reconnaissent des antigènes particuliers sur la cellule,
permettant d’identifier et de caractériser les profils des protéines qui sont présentes
dans ces cellules.
Le fluorochrome absorbe l’énergie du LASER et réémet l’énergie absorbée par vibration
et dissipation de chaleur, L’émission de photons est d’une longueur d’onde plus élevée.

67. Fluorescéine
Isothiocyanate
Phycoérythrine
Grâce à ces fluorochromes spécifiques et à des instruments adéquats, il est
possible d’identifier des sous‐populations de cellules.

68. Figure 3 : Longueurs d’ondes des anticorps-fluorochrome utilisés dans notre étude par cytométrie en flux.
Lymphocytes T
cytotoxiques
Lymphocytes T
helper
Lymphocytes T

69.  INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS :
Concuants
Non concluants
Présentation des pourcentages de : L’hypo-cellularité et de l’hyper-cellularité.
75%
25 %
Hypo-cellularité des culots
ou
faible viabilité
8 cas
Non concluants
24 cas
Concluants

70. 8 cas
non concluants
24 cas
concluants
Une lymphocytose
à CD4 17 cas (70,8%)
à CD8 7 cas (29,2%)
à CD 4
à CD 8
70,8%
29,2 %
Présentation des pourcentages de lymphocytose à : CD 4/ CD8.

71.  Comparaison des résultats en immunocytochimie sur étalements
et en cytométrie en flux:
Dans notre série d’étude, 23 cas avaient des résultats interprétables avec les deux techniques (71,8 %)
et étaient donc comparables.
Selon ces résultats, le coefficient de concordance kappa est estimé à 0,34
Reproductibilité médiocre
0.00%
5.00%
10.00%
15.00%
20.00%
25.00%
30.00%
35.00%
40.00%
8 cas
< 1,6
7cas
≥ 1,6
7 cas
< 1,6
7 cas
≥ 1,6
1 cas
< 1,6
1 cas
≥ 1,6
Immuno-cytochimie
sur étalements
Cytométrie en flux
Concordance médiocre entre les 2 techniques
(Laboratoire différent, conditions d’acheminement et
de conservation différentes).

72.  Comparaison des résultats en immunocytochimie sur cytoblocs
et en cytométrie en flux:
Dans notre série d’étude, Les deux techniques ont été réalisées dans 17 cas et 5 cas uniquement
avaient des résultats interprétables dans les deux techniques.
Selon ces résultats, le coefficient de concordance kappa est estimé à 0,34
Reproductibilité médiocre
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
2 cas
< 1,6
1 cas
≥ 1,6
2 cas
< 1,6
2 cas
≥ 1,6
Immuno-cytochimie
sur cytoblocs
Cytométrie en flux
Concordance médiocre entre les 2 techniques
(Laboratoire différent, conditions d’acheminement et
de conservation différentes).

73. Avantages Inconvénients
- Etude quantitative de nombreuses
caractéristiques (présence d'un
antigène,quantité d'ADN ou d'ARN).
- Le nombre de cellules doit être de l'ordre de
quelques centaines de milliers au minimum.
- Séparation des cellules avec une très
grande pureté en condition stérile.
- Les cellules doivent être en suspension.
- Analyses précises sur des critères très
différents et très nombreux.
- L'analyse étant qu'à un unique instant donné,
on ne peut pas faire de véritable étude
cinétique portant sur une même cellule.
- N'abime pas les cellules. - Pas d'image des cellules analysées.
6. Avantages et inconvénients de la cytométrie en flux:

74.  Cette étude met l’accent sur la mauvaise reproductibilité entre ces 2 techniques
qui n’ont pas été réalisées dans le même laboratoire ce qui pourrait expliquer
la discordance observée.
 Les auteurs ont préféré la cytométrie en flux par rapport à l’immunocytochimie vu
qu’elle nécessite beaucoup moins de temps
(4 heures pour l’immunocytochimie vs.40 min pour la cytométrie en flux
dans notre étude).
 Dans d’autres études il a été démontré une bonne reproductibilité entre
l’immunocytochimie et la cytométrie en flux.
Conclusion

75. Conclusion
Immunocytochimie Cytométrie En flux
 Nécessite peu de matériel et plus de
temps.
 Le comptage lymphocytaire est fait sur
un nombre bien limité de cellules
(maximum de 400 éléments).
 La fiabilité des résultats dépend
fortement de l’expérience de
l’observateur.
 L’immunocytochimie paraît donc avoir
un grand intérêt dans la mise en
évidence d’antigènes fortement
exprimés au niveau cellulaire.
 Requiert plus de matériel mais moins de
temps.
 Permet une simplification de
l’immunophénotypage des lymphocytes
alvéolaires tout en augmentant la
fiabilité des résultats.
 La cytométrie en flux est plus apte à
détecter des épitopes faiblement
présents dans les cellules.
Afin d’avoir des résultats fiables,
la réalisation de ces deux techniques
nécessite un matériel de très bonne
qualité avec une préservation cellulaire
optimale.

76. Références bibliographiques :
https://issuu.com/caeliosformation/docs/immunocytochimie
https://slideplayer.fr/slide/11121041/
https://slideplayer.fr/slide/3258548/
http://www.poly-prepas.com/images/files/ue2%20chapitre%201-%20m%C3%A9thodes%20en%20histologie.pdf
http://campus.cerimes.fr/anatomie-pathologique/poly-anatomie-pathologique.pdf
Item 206 (ex item 120) – Pneumopathie interstitielle diffuse Collège Français des Pathologistes (CoPath) 2013
Thomas Denize*, Inès Boussen, Flore Delecourt, Julie Leclerc, Thierry Jo Molina Lavage bronchoalvéolaire de
l’enfant et de l’adulte, rôle du pathologiste
Cours Techniques cytologiques Dr Gérard Abadjian USJ 2007.

77. MERCI POUR
VOTRE
ATTENTION