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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique
Université des Sciences et de la Technologie
HOUARI BOUMEDIENE
Faculté des Sciences Biologiques
Master : Biotechnologie et Pathologie Moléculaire.
M1 G2 .
Les anticorps monoclonaux
Année universitaire : 2015/2016
Présenté par : Dirigépar :
HAMDIKEN Souad Dr.MEZIOUG
BEN RAIS Amina
BOUACHIBA Hadjira
BOUKHALF Hakima
DJELLIEL Nabila
Sommaire :
1-Introduction
1-1 Définition
1-2 Objectif
1-3 Historique
1-4 La différence entre un anticorps monoclonal et polyclonal
1-5 Les différents types d’anticorps monoclonaux
1-5-1 L’anticorps Murins
1-5-2 L’anticorps chimérique
1-5-3 L’anticorps humanisé
1-5-4 L’anticorps humain
1-5-4-1 Technique des souris transgéniques
1-5-4-2 Technique de phage display
2-Mode d’action des anticorps monoclonaux
2-1 Blocage
2-2 Signalisation
2-3 Ciblage
3- production des anticorps monoclonaux
3-1 Définition d’un hybridome
3-2 Immunisation des animaux
3-3 Fusion
3-3-1 fusion chimique
3-3-2 fusion physique
3-4 Sélection des cellules hybrides
3-5 Screening des cellules productrices d’anticorps :
3-6 Clonages des hybridomes sécréteurs
3-6-1 Clonage par dilution limite
3-6-2 Clonage sur gel d’agarose
3-7 Production en masse des anticorps monoclonaux
3-7-1 Production in vivo
3-7-2 Production in vitro
3-8 Purification et conservation des anticorps monoclonaux
4- Utilisation des anticorps monoclonaux dans la thérapie
4-1 Anti IgE
4-2 Anti CD20
4-3 Anti HER2
4-4 Anti VGEFR2
5- Diagnostic par les anticorps monoclonaux
5-1 Diagnostic des infections respiratoire
5-2 Recherche des anticorps, Sérologies Virales
6- Pharmacologie
6-1 Absorption
6-2 Distribution
6-3 Métabolisme
6-4 Elimination
7- Les effets secondaires des anticorps monoclonaux
8- Les anticorps monoclonaux biosimilaires
9- Economie des anticorps monoclonaux
10- Conclusion
11- Bibliographie
1-Introduction :
La biotechnologie permet de créer les médicaments de demain comme la synthèse de
molécule naturelle : anticorps monoclonaux largement utilisés en biologie et en médecine à la
fois comme outil de diagnostic et dans des buts thérapeutiques.
1-1 Définition :
Les anticorps monoclonaux sont immunoglobuline(IgG) caractérisées par un poids
moléculaire important (Environ 150.000 daltons) Ils ne reconnaissent qu’un seul type
d’épitope sur un antigène donné. Ils sont tous identiques et produits par un seul clone de
plasmocyte.
1-2 Objectifs :
 Étudier la production des biomolécules à partir de systèmes eucaryotes.
 Utilisation des biomolécules dans le diagnostic et dans la thérapie.
1-3 Historique
 En 1888 :l’invention de la sérothérapie par CHARLES RICHET
 En 1928 : le premier antibiotique PENICILLINE a été découvert par ALEXANDER
FLEMING en étudiant les champignons
 En 1959 : la structure des antibiotiques a été décrite par PORTER et EDEIMAN
 En 1975 : la première production d’anticorps monoclonaux par CESAR MILSTEN et
GEORGES KHOLER la technique d’hybridome
1-4 Comparaison des principales caractéristiques des ACM et ACP :
ACM ACP
Temps et cout de
fabrication
Rapide et moins cher Lent et plus cher
Reproductibilité Variable Constante
Affinité Variable Constante
Concentration et degré de
pureté
Faible Elevé
Stabilité de pH Plus stable Moins stable
Disponibilité Limitée Illimitée
1-5 Les différents types d’anticorps monoclonaux :
1-5-1 Murins (MOMAB) : en 1975 100 % murin Mais ces anticorps monoclonaux ont
présenté des effets indésirables sérieux :
-La formation d’Anticorps humains anti Ig murin ou HAMA (humain anti mouse anti bodies)
-Les anticorps murins ont une demi-vie courte dans le sérum
-Capacité limitée de recruter des effecteurs cellulaires comme le complément
1-5-2 Chimérique (XIMAB) : 25% MURIN
Les régions constantes des chaines lourdes et légères des anticorps murin sont remplacées par
les régions constantes des chaines lourdes et légères des anticorps humains par la technique
d’ADN recombinant
1-5-3 Humanisé : ZUMAB
Afin d’augmenter les parties humaines des anticorps on a greffé les parties hyper variables
CDR (complementarity determining regions) d’anticorps murin par technique de greffe des
CDR
1-5-4 Humain (MUMAB) : 100% HUMAIN par deux techniques :
1-5-4-1 Souris transgénique :
Les gènes de souris peuvent être remplacés
L’obtention de ces souris nécessite trois grandes étapes
1- inactiver les gènes codants pour les chaines légères et lourdes de l’anticorps considéré
.cette étape a été réalisé dans des cellules souches embryonnaires
2 - transfecter chez les souris les locus correspondants aux gènes des anticorps humains
Le clonage de ces locus a été facilité par l’utilisation des chromosomes artificiels de levure
(yac : yeast artificial chromosom)
Les yac ont été introduits dans des cellules souches
3-après plusieurs portés ; la souris transgénique peut produire des anticorps d’origine humaine
1-5-4-2 Technique du phage display :
Les bactériophages ou phages sont des virus qui doivent infecter une bactérie hôte afin de se
multiplier en reproduisant leur ADN en grand nombre de copies ; puis sont libérés sous forme
de particules virales comportant un assemblage de protéines virales entourant cet ADN
On peut introduire dans le génome des phages ; des séquences d’ADN codant les anticorps de
telle façon que ceux-ci se retrouvent joints au domaine
N-terminal des protéines de surface du phage sous forme de fragments Fc Fab
Cette technique de présenter des protéines recombinantes à la surface de phage filamenteux
est appelée « technique de phage display »
2-Moded’action :
Les anticorps monoclonaux peuvent fonctionner selon trois principaux modes d’action :
Blocage, Signalisation, Ciblage.
2-1 Blocage :
est une premier voie d’action directe , les ACM vont empêcher l’action de facteur
de croissance, de cytokine ou d’autre médiateurs solubles en se liant directement
au facteur soluble lui-même ou à son récepteur.
2-2 La signalisation :
Est une voie d’action indirecte qui recrute d’autres effecteurs. L’anticorps, par
l’effet de sa plurivalence antigénique permet de regrouper au niveau de la
membrane de la cellule cible les marqueurs antigénique reconnus. Ce phénomène
peut alors induire au niveau intracellulaire l’activation de signalisation de
l’apoptose via des cascades des phosphorylations aboutissant à l’arrêt de cycle
cellulaire et donc à la mort de la cellule cible.
2-3 Le ciblage :
Est une troisième voie d’action directe. En cas d’invasion microbienne, les
anticorps sont capables de reconnaître des structures antigéniques de l’agent
pathogène et cette reconnaissance induit directement l'élimination de ce pathogène
par deux mécanismes principaux :
2-3-1 La CDC (complement dependent cytotoxicity) :
La fixation de l’Ac sur l’Ag active le système de complément, cette
activation entraine la destruction de la cellule cible par la formation de
complexe d’attaque membranaire (CAM) au niveau de la membrane du la
cellule cible.
2-3-2 L’ADCC (Anti body Dependent Cellular Cytotoxicity):
Les anticorps, fixés spécifiquement sur une structure antigénique par leur
région variable, sont reconnus au niveau de leur région constante (fragment
FC) par différentes cellules effectrices, comme les macrophages ou les cellules
NK (naturel killer…). Cette reconnaissance se fait par l'intermédiaire de
récepteurs particuliers pour ce fragment FC. Cette interaction FC-RFc
déclenche l’activité cytotoxique de ces cellules sur la cible antigénique.
2-3-3 la phagocytose :
Par la fixation d’Ac monoclonal sur le récepteur par sa partie FC par le
biais de macrophage.
3-Productiondes anticorps monoclonaux(in vitro /in
vivo) :
Afin de produire des lignées stables de cellules produisant l'anticorps désiré, Kohler et
Milstein ont élaboré l'idée et la méthode de fusion de deux types de cellules. Ainsi, des
cellules B (produisant les anticorps), dont l'incapacité de se reproduire est palliée par des
myélomes (des cellules cancéreuses immortelles) résulte en un hybridome secrétant des
anticorps et ayant à la fois la propriété de se reproduire indéfiniment
Cette technique compte 5 étapes :
-L’obtention de lymphocytes sensibilisés
-La fusion des lymphocytes B sensibilisés avec des cellules de myélome
-La sélection des cellules hybrides
- Le clonage des hybridomes sécréteurs
- Le screening des cellules productrices d’anticorps
3-1 Définition d’un hybridome :
Un hybridome est une cellule qui provient de l'hybridation entre des cellules
lymphoïdes normales de mammifères et des cellules myélomateuses de tumeurs malignes du
système immunitaire.
L'intérêt est de cumuler les propriétés des deux cellules de départ : production spécifique
d'anticorps pour le lymphocyte et immortalité pour la cellule cancéreuse.
Les hybridomes donnent des lignées immortalisées stables productrices
d'anticorps monoclonaux.
3-2Immunisation des animaux :
Choix de l’animal
La souris reste l’animal le plus utilisé, car le génome des souris présente environ 95%
d’homologie avec celui de l’homme. De plus, les souris sont des animaux de petites tailles et
faciles à élever, ont une durée de vie courte et se reproduisent facilement. L’utilisation de
souris permet d’obtenir à la fois des cellules de myélome et des lymphocytes B compatibles
entre eux pour l’étape suivante, la fusion.
Le modèle rat peut également être utilisé. En 1970, Bazin et Beckers ont entrepris d’élever
des rats, qui présentaient la caractéristique de produire des anticorps après une injection
intraveineuse d’antigène au niveau de la rate. De plus, le volume d’ascite obtenu chez un rat
est environ dix fois plus important que chez la souris
Protocole d’immunisation
L’immunisation est réalisée par une injection de fortes doses d’antigène par voie
intraveineuse ou péritonéale sur quatre semaines environ, ainsi les lymphocytes B qui
réagissent à l’antigène choisi sont chaque fois plus fortement stimulés.
Afin de stimuler le système immunitaire de l’animal, la première injection est effectuée en
présence d’adjuvant complet de Freund (mélange d’huile minérale, qui a pour but de freiner la
diffusion de l’antigène prisonnier dans l’huile, produisant ainsi un effet retard, et mélange de
mycobactéries tuées qui génèrent une réaction inflammatoire avec granulome .Une injection
intraveineuse de quatre à cinq fois la dose initiale d’antigène est administrée trois jours avant
la fusion, afin d’amplifier et de stimuler le système immunitaire de l’animal.
3-3 Fusion :
Toutes les étapes suivantes doivent être réalisées dans des conditions stériles pour prévenir
toute contamination bactérienne et fongique. Le but de cette étape est de fusionner une cellule
de souris productrice d’un anticorps monoclonal avec une lignée de cellules humaines «
immortelles » ayant la particularité de se diviser indéfiniment. Après le sacrifice de l’animal,
la rate est extraite puis broyée, et les cellules sont mises en suspension dans un milieu
dépourvu de sérum. L’élimination des érythrocytes s’effectue par centrifugation sur gradient
de densité, à 400 g pendant 30 minutes. Les globules rouges et les 24 cellules mortes se
localisent au fond du tube, tandis que les lymphocytes demeurent à l’interface, formant un
anneau blanc pâle. Au-dessus de l’anneau des lymphocytes figurent un milieu contenant les
cellules spléniques. Les lymphocytes peuvent être prélevés à l’aide d’une pipette pasteur et
lavés ; par centrifugation On obtient 1.107 à 1.108 cellules par rate de souris. Les
lymphocytes sont ensuite mélangés avec les cellules de myélome préparées extemporanément.
Les cellules de myélome sont des cellules cancéreuses, non sécrétrices d’anticorps, qui ont la
capacité de se multiplier de façon indéfinie in vitro. Au moment de la fusion, elles doivent
être en phase de croissance exponentielle. Généralement, la cellule myélomateuse utilisée a
subi, au préalable, une double mutation qui lui fait perdre la capacité de secréter des
immunoglobulines et la prive de la faculté de produire l’enzyme hypoxanthine guanosine
phosphoribosyl transférase (HGPRT), enzyme qui intervient dans la synthèse d’ADN et ARN
par la voie exogène.
L’étape de fusion se fait selon deux méthodes principales : l’utilisation d’un agent fusionnant,
ou l’électrofusion cellulaire.
3-3-1Utilisation d’un agent fusionnant
En 1960, H. Harris découvrit le pouvoir de fusion du virus de SENDAI. Ce paramyxovirus,
sous l’action soit de rayons ultraviolets, soit traité à la b-propiolactone, perd son pouvoir
infectieux et létal sans modification de ses pouvoirs hémagglutinant et fusionnant. Afin de
prévenir tout risque de prolifération du virus SENDAI, il est actuellement remplacé par le
polyéthylène glycol (PEG), polymère qui a l’avantage d’induire une fusion rapide (2 min à
37°C) et d’être dépourvu d’impureté toxique pour les cellules. Il agit par diminution des
charges négatives de surface, ce qui provoque l’affaiblissement des forces de répulsion et
donc, un meilleur contact entre les cellules.
3-3-2 L’électrofusion cellulaire
Le principe de l’électrofusion cellulaire repose sur la formation de pores transitoires dans la
membrane cellulaire sous l’effet d’un champ électrique alternatif de haute fréquence. Si les
cellules sont au préalable en contact étroit, la fusion cellulaire peut avoir lieu sous l’action
d’une brève impulsion d’un courant continu de haute tension. Dans le cas des hybridomes, un
contact plus spécifique entre la cellule myélomateuse et le lymphocyte peut être tenté par une
liaison dirigée grâce à un complexe avidine-biotine. Les rendements en hybridomes
viables sont moins satisfaisants que ceux obtenus par le polyéthylène glycol. Ainsi, la fusion
par le PEG est celle utilisée en laboratoire.
3-4 Sélection des cellules hybrides :
La sélection des hybridomes met à profit le déficit enzymatique des cellules de myélome en
hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transférase. L’addition de l’aminoptérine bloque la
synthèse endogène des bases puriques et pyrimidiques. En l’absence de l’enzyme HGPRT, les
cellules de myélome ne peuvent utiliser l’hypoxanthine exogène pour synthétiser les purines,
donc elles meurent, alors que les hybridomes, non déficitaires en cette enzyme qui est
apportée par les lymphocytes B sensibilisés, peuvent utiliser l’hypoxanthine et la thymidine
dans la voie exogène afin de synthétiser l’ADN et l’ARN nécessaires à la vie et à la
multiplication des cellules d’hybridome. De même, les cellules immunocompétentes sont
incapables de se multiplier en culture et meurent rapidement. Le supplément sélecteur
hypoxanthine aminopterine thymidine (HAT) est additionné au milieu de micro culture
pendant la première phase après la fusion. Il sera remplacé par l’hypoxanthine thymine après
élimination des cellules de myélome. Suite à une période de sélection dans le milieu HAT, les
hybridomes se développent en colonies. Le taux de succès d’une fusion est plutôt faible et
varie selon le protocole utilisé (de 5% à 50%).
3-5 Screening des cellules productrices d’anticorps :
Les puits de culture positifs contiennent une série entière d’hybridomes secrétant des
anticorps tous différents. La lignée de cellule de l’hybridome réellement productrice
d’anticorps monoclonal doit être isolée avant sa mise en culture. La sélection des hybridomes
producteurs d’anticorps monoclonaux spécifiques se fait par des tests d’activité anticorps dans
le surnageant de la culture. Les méthodes utilisées sont la radioimmunologie (RIA), la
révélation immunoenzymatique (ELISA), l’hémagglutination, l’immunofluorescence
indirecte. Ces tests sont généralement effectués entre 9 et 11 jours après la fusion.
On constate que même avec le meilleur schéma d’immunisation contre un antigène puissant,
moins de 5% des cellules spléniques produisent des anticorps spécifiques.
3-6 Clonages des hybridomes sécréteurs
3-6-1 Clonage par dilution limite
Le principe de la méthode est de diluer le mélange de telle manière que, lors de la distribution
de la suspension cellulaire dans des plaques multi puits, on puisse s’attendre statistiquement à
une seule cellule par puits. Cette méthode est une procédure en trois temps. La première série
de dilutions permet de sélectionner les cellules qui sécrètent en grande quantité l’anticorps. La
deuxième série de dilutions permet de sélectionner les lignées cellulaires à partir d’une seule
cellule. La troisième série de dilutions permet de vérifier le clonage.
3-6-2 Clonage sur gel d’agarose
Le but est de faire croître les cellules dans un milieu solide. Il existe une variété de gels qui
permet la croissance des cellules après addition de facteurs appropriés (sérum, acides aminés,
antibiotiques…). Les cellules se divisent et forment des foyers sur le gel d’agarose qui
ressemblent à des petites sphères. Comme le milieu est semi solide, ces petites boules peuvent
être prélevées à l’aide d’une pipette et placées dans une plaque de puits de culture.
3-7 Production de masse des anticorps monoclonaux
Le but à atteindre ensuite est de faire proliférer l’hybridome sélectionné dans les meilleures
conditions afin de produire suffisamment d’anticorps. La production à grande échelle
d’anticorps monoclonaux repose sur la culture des hybridomes soit in vivo, soit in vitro.
3-7-1 Production in vivo : procédéde l’ascite
Le procédé de l’ascite implique l’injection intrapéritonéale ou sous-cutanée tout d’abord de
pristane (huile minérale) chez une souris ou un rat, provoquant ainsi une irritation de la cavité
abdominale mais pas encore d’ascite. Une à trois semaines après, les hybridomes (106 à 107
cellules) sont injectés dans le péritoine des souris. Au cours des 10 à 25 jours suivants, la
tumeur se développe dans toute la région péritonéale sous forme d’ascite et, durant le
processus de multiplication, les cellules produisent des quantités importantes d’anticorps
monoclonaux. Lorsque l’ascite a atteint un certain volume, l’abdomen est ponctionné avec
une aiguille. Une seule souris produira 10 à 20 mL de liquide d’ascite contenant environ 10
mg/ml d’anticorps monoclonaux.
L’histocompatibilité entre l’hybride et la souris productrice d’ascite est requise. A chaque
passage sur souris ou rat, la production d’anticorps monoclonaux doit être vérifiée pour
s’assurer de la persistance de la capacité sécrétoire d’hybridome.
La culture en ascite permet une production flexible de petites quantités d’anticorps
monoclonaux. Cette production in vivo présente cependant plusieurs inconvénients,
notamment la petite taille de la souris et la présence de nombreuses enzymes protéolytiques
dans l’ascite.
De plus, le liquide de l’ascite contient un mélange de protéines dont certaines sont des
immunoglobulines. Il se pose aussi le problème éthique de l’utilisation des animaux et de
l’injection de cellules cancéreuses. La production in vivo devient de plus en plus une
technique obsolète.
3-7-2 Production in vitro : procédépar culture cellulaire
Pour diverses applications, il est nécessaire de produire des quantités plus importantes
d’anticorps. Pour l’imagerie in vivo, on doit disposer de quelques centaines de microgramme
d’anticorps par patient. Pour la thérapie in vivo, plusieurs centaines de milligramme sont
requises par patient.
La production in vitro est basée sur la culture des hybridomes dans des milieux de culture
définis. Le milieu ajouté pour la nutrition des cellules contient du sérum de veau foetal. Après
l’adaptation des lignées de cellules, on peut utiliser un milieu exempt de sérum, et donc
éliminer le risque de contaminations accidentelles par des micro-organismes présents dans le
sérum. Afin d’accélérer la division, des cellules nourricières sont incorporées au milieu.
La culture de cellules peut être effectuée dans des flacons d’un contenu de 0,5 à 1 litre dans
des flacons pour cultures selon Spinner d’un contenu de 1 à 10 litres, dans des réacteurs
capillaires (principe de la dialyse) ou dans des fermenteurs de capacités diverses (10 à 1000
litres).
Les opérations de type batch ou discontinu, constituent le mode de gestion le plus simple et le
plus flexible de conduite des cultures. Après inoculation, celles-ci se poursuivent jusqu’à
épuisement du milieu et récolte du produit. Elles sont réalisées dans des cytoculteurs, le plus
souvent des bioréacteurs à agitation mécanique dérivés des fermenteurs microbiens. Le plus
important pour la survie des cellules, comme pour le contrôle de la culture, est de maintenir
toutes les cellules en suspension, avec une bonne homogénéisation du liquide. Les
bioréacteurs à agitation pneumatique sont une alternative satisfaisante aux dispositifs
d’agitation mécanique pour des cultures allant jusqu’à 1000 litres. C’est alors l’introduction
d’air comprimé qui provoque l’agitation et l’oxygénation du milieu. Un inconvénient des
opérations discontinues est que le milieu de culture s’épuise au fur et à mesure que les cellules
l’utilisent, ce qui limite tant la croissance cellulaire que la production. Les opérations de type
fed-batch représentent ainsi une amélioration des procédés batch. Elles consistent à apporter
de manière contrôlée des nutriments en cours de route, pour prévenir leur épuisement. Un
nouveau perfectionnement de la culture des cellules animales consiste à passer aux opérations
réellement continues, avec apport permanent de nutriments et retrait simultané du milieu
usagé et des produits formés, le volume de culture restant constant. D’autres systèmes de
perfusion utilisent des microporteurs poreux sur lesquels les cellules sont immobilisées. Par
exemple, le procédé Celli-Gen Plus comprend un agitateur à haut débit qui permet de faire
circuler le fluide nutritif et l’oxygène à travers un lit de supports fibreux sur lesquels les
cellules sont fixées en grand nombre
3-8 Purification et conservation des anticorps monoclonaux
La purification peut se faire de différentes manières, comme par exemple la chromatographie
par filtration sur gel, chromatographie par échange d’ions ou par précipitation au sulfate
d’ammonium.
La conservation des anticorps monoclonaux est obtenue par congélation d’une partie du clone
dans une ampoule placée dans l’azote liquide. L’autre partie du clone est maintenue en
activité ; sa durée de vie est de plus de 20 ans.
4-L’utilisation des anticorpsmonoclonauxdans la
thérapie :
4-1 L’anti IgE :
L’IgE joue un rôle important dans l’expression de l’inflammation des voies respiratoire aussi
dans l’apparition des réactions allergiques chez les maladies asthmatiques.
L’anti IgE est un anticorps monoclonal humanisé agit soit :
 Par la liaison avec l’IgE présent sur la surface des mastocytes ou les basophiles donc
l’inhibition de la fixation de l’allergène et par la suite la disparition des symptômes de
l’asthme
 Par sa liaison avec l’IgE libre donc formation du complexe immun qui va empêcher la
liaison de l’IgE avec les cellules mastocytaires et les basophiles.
4-2 L’anti CD20 :
le CD20 est exprimé sur la surface des cellules LB dans la plus part de leur stade de
développement à l’exception des plasmocytes et les stades tout à fait initiaux.
L’anti CD20 est un anticorps monoclonal qui a montré son efficacité chez les patients de
tumeur maligne lymphoïde (lymphome non hodgkinien).
C’est une IgG chimérique qui cible l’Ag CD20 présent sur les cellules LB maligne et
normaux donc il induit comme un effet secondaire la lymphopénie.
Il agit via trois mécanismes :
 Liaison directe.
 Activation de cascade su complément CDC.
 ADCC.
L’anti CD20 a un effet antiprolifératif pour les cellules donc induction de la mort cellulaire.
4-3 L’anti HER2 :
HER2 est un récepteur du facteur de croissance surexprimé dans les cellules tumorales du
sein.
L’anti HER2 se lie au HER2 et induit donc l’inhibition de transmission du signal de
prolifération.
4-4 L’anti VGEFR2 :
Le VGEF facteur de croissance endothéliale vasculaire permet la vascularisation accrue des
tumeurs et la métastase.
TTAC-0001 anticorps monoclonal humain contre le VGEFR2 inhibe la liaison du VGEF et
induit un signal d’inhibition pour les cellules.
L’activité anti tumorale de TTAC-0001 a été montrée dans un modèle préclinique en
corrélation avec l’arrêt de croissance de la tumeur, induction de l’apoptose et inhibition de
l’angiogenèse
5-Diagnostic par les anticorpsmonoclonaux
5-1 Diagnostic des infections respiratoires :
La recherche des antigènes viraux consiste à identifier l’infection virale directement au sein
des cellules infectées présentes dans les prélèvements des patients. Le meilleur exemple est
celui du diagnostic des infections respiratoires. A partir des prélèvements nasopharyngés, on
peut rechercher les antigènes viraux dans les cellules du nez ou de la gorge. Les virus para-
influenzae s’accumulent dans le cytoplasme des cellules infectées.
Les antigènes viraux peuvent être visualisés par technique d’immuno-fluorescence, en
utilisant des anticorps spécifiques de chaque virus marqués par la fluorescéine.
On utilise des anticorps monoclonaux. Cette technique est simple et rapide (une à deux
heures), elle permet de rechercher simultanément plusieurs virus sur un même prélèvement.
5-2 Recherche des anticorps, Sérologies Virales :
L’infection virale est le plus souvent suivie par une réponse immunitaire humorale traduite pa
r
la production d’anticorps spécifiques des antigènes du virus (immunoglobulines IgG et IgM).
La connaissance d’un statut sérologique présente différents intérêts : elle permet de connaître
l’état immunitaire du sujet : un titre positif permet d’affirmer que le sujet est immunisé et a
rencontré une fois le virus dans sa vie (CMV, HIV, Rubéole) ou bien qu’il est vacciné (hépatit
e B). Elle permet aussi de suivre l’évolution de l’infection virale (anticorps anti HBc et HBs).
Les anticorps sont présents dans les différents liquides biologiques de l’organisme et
notamment dans le sang périphérique (plasma ou sérum selon que le sang est prélevé avec
ou sans anticoagulant). Cinq à dix millilitres de sang veineux suffisent pour effectuer la
recherche de plusieurs marqueurs ou faire plusieurs sérologies. Les échantillons de plasmas
ou de sérums se conservent au congélateur et doivent être gardés un an par le laboratoire.
Différentes techniques sont utilisées : ELISA, agglutination, Western blot et immunoblot.
L’ELISA est devenue la technique la plus utilisée car elle est rapide simple spécifique.
6-Pharmacologie :
6-1 Administration :
L'administration se fait par voie parentérale (intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire),
Les anticorps monoclonaux diffusent dans tout l'organisme mais ne passent pas la barrière
hémato-encéphalique.
6-2 Distribution
La phase de distribution apparaît déterminante pour les anticorps à visée tissulaire c.à.d. les
anticorps utilisés en oncologie. La distribution dépend de la physiologie tumorale et des
caractéristiques de l'anticorps. Le principal facteur limitant la diffusion tumorale des
anticorps apparaît être l'affinité pour l'antigène membranaire cible et l'intensité de
l'expression antigénique.
6-3Elimination
L'élimination se fait soit après fixation à l'antigène cible (endocytose du complexe anticorps-
antigène et dégradation par les lysozomes), soit de manière non spécifique par le système
réticulo-endothélial.
L'élimination urinaire d'un anticorps monoclonal radiomarqué administré représentait 22 % de
la dose injectée.
L’excrétion rénale des anticorps monoclonaux actuellement commercialisés n'est pas
documentée sinon de manière indirecte. Par exemple, l'insuffisance rénale ne semble pas avoir
d'impact sur l'élimination du trastuzumab.
7- Les effets secondaires des anticorps monoclonaux
Une hausse de la pression artérielle.
 Des maux de tête.
 Une présence de protéine dans les urines.
 Des réactions allergiques.
 Une confusion.
 Des douleurs musculaires légères.
 La formation de caillots de sang (rare)
 Une perforation de l’intestin (rare).
Ces effets secondaires sont temporaires et disparaissent à la fin du traitement.
8-Anticorpsmonoclonauxbiosimilaires :
Un biosimilaire est similaire à un médicament biologique (produit à partir d’une cellule ou
d’un organisme vivant) de référence, qui a déjà été autorisé, Ce médicament doit avoir des
propriétés physico-chimiques et biologiques similaires, la même substance pharmaceutique et
la même forme pharmaceutique que la référence.
Comme pour tout médicament issu de la biotechnologie, il est possible de développer un
AcMo biosimilaire à un AcMo de référence.
L’objectif principal reste de démontrer la comparabilité chez une population homogène de
sujets afin de réduire au maximum toute variabilité dans la réponse au traitement et d’en
simplifier l’interprétation.
En 2011 aucun anticorps monoclonal biosimilaire n’était autorisé mais elles ne représentent
actuellement que 1% du marché des produits biologiques au niveau mondial et leur croissance
reste conditionnée par plusieurs facteurs.
Quelques exemples des Anticorps monoclonaux biosimilaires :
• Reditux (dirigé contre la molécule de surface CD20 présente sur la plupart des cellules
B) est un biosimilaire de rituximab (Mabthera ™) approuvé en Inde en 2007.
• Clotinab (inhibe l'agrégation plaquettaire en se liant au récepteur de fibrinogène GP
IIb / IIIa) est un biosimilaire de abciximab est approuvé en Corée du Sud.
9- Economie des anticorpsmonoclonaux:
La commercialisation du premier anticorps monoclonal a été évaluée à 18 milliards de
dollars EU en 2006, le marché des anticorps monoclonaux avait atteint 40 milliards en 2010.
Sur la période 2010- 2016, le taux de croissance annuel moyen devrait dépasser les 8%, ce qui
en fait le segment le plus dynamique du marché des médicaments.
Ce succès s’explique en particulier par la possibilité de concevoir ces médicaments de façon
rationnelle, avec une grande spécificité pour leur cible, ce qui limite les effets secondaires.
Le marché français des anticorps monoclonaux est estimé à 7,9 milliards de dollars en 2018.
Etant donné que le nombre d’antigènes à cibler est très grand voire infini, ces médicaments
devraient pouvoir répondre à un grand nombre de maladies, dont certaines aujourd’hui
incurables : maladie de Crohn, asthme, cancer, DMLA (Dégénérescence Maculaire Liée à
l’Age), maladie coronarienne…
10-Conclusion:
• Le succès des Ac Mo est le résultat d’un long cheminement depuis la découverte de leur
technique de fabrication.
• Les anticorps monoclonaux sont donc une voie d'avenir précieuse notamment pour des
pathologies qui n'ont pas de traitement ou des traitements peu satisfaisants. Certains sont
aujourd'hui en cours de développement notamment dans le rejet de greffe de rein, les
leucémies aiguës myéloïdes et les leucémies lymphoïdes chroniques.
11- Bibliographie :
-Journal Scientifique Biologie René Descartes N°1 septembre 2002
-Immunoanalyse & Biologie Spécialisée Volume 19, n° 5 pages 250254 (octobre 2004)
Serum Her2 marker, breast cancer and trastuzumab (Herceptine®)
-American Journal of Transplantation. 2006; 6: 859866 Le rituximab, un anticorps
monoclonal antiCD20 Anticorps : Histoire et Mécanisme d'action M. D. Pescovitz.
-Nancy-université : université HENRI POINCARE faculté de pharmacie .Thèse sur « les
anticorps monoclonaux ; de la production à l’utilisation en oncologie » présentée le
23 /10/2009
SCHINDELE A, Thèse, les anticorps monoclonaux, de la production a l’utilisation en
oncologie, 23 octobre 2009.
-Université de Tokyo professeur de sciences Ken Ota
http://medical.radionikkei.jp/suzuken/final/090409html/index.html: L'asthme bronchique
thérapeutique anti-IgE anticorps monoclonal omalizumab
-Alexandre m et al, Afssaps, DES médicaments issus DES biotechnologies aux médicaments
biosimilaires : état DES lieux, juillet 2 011.
LE PEN C, Rapport, Les biosimilaires, Avril 2014.
www.microbes-edu.org, Le diagnostic virologique des infections virales.
-2015 Sep 3;7(5):957-68. doi: 10.1080/19420862.2015.1045168. Epub 2015 May 5. TTAC-
0001, a human monoclonal antibody targeting VEGFR-2/KDR, blocks tumor angiogenesis.
Lee WS1 et all.

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tous sur les anticorps monoclonaux

  • 1. REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique Université des Sciences et de la Technologie HOUARI BOUMEDIENE Faculté des Sciences Biologiques Master : Biotechnologie et Pathologie Moléculaire. M1 G2 . Les anticorps monoclonaux Année universitaire : 2015/2016 Présenté par : Dirigépar : HAMDIKEN Souad Dr.MEZIOUG BEN RAIS Amina BOUACHIBA Hadjira BOUKHALF Hakima DJELLIEL Nabila
  • 2. Sommaire : 1-Introduction 1-1 Définition 1-2 Objectif 1-3 Historique 1-4 La différence entre un anticorps monoclonal et polyclonal 1-5 Les différents types d’anticorps monoclonaux 1-5-1 L’anticorps Murins 1-5-2 L’anticorps chimérique 1-5-3 L’anticorps humanisé 1-5-4 L’anticorps humain 1-5-4-1 Technique des souris transgéniques 1-5-4-2 Technique de phage display 2-Mode d’action des anticorps monoclonaux 2-1 Blocage 2-2 Signalisation 2-3 Ciblage 3- production des anticorps monoclonaux 3-1 Définition d’un hybridome 3-2 Immunisation des animaux 3-3 Fusion 3-3-1 fusion chimique 3-3-2 fusion physique 3-4 Sélection des cellules hybrides 3-5 Screening des cellules productrices d’anticorps : 3-6 Clonages des hybridomes sécréteurs 3-6-1 Clonage par dilution limite 3-6-2 Clonage sur gel d’agarose 3-7 Production en masse des anticorps monoclonaux 3-7-1 Production in vivo
  • 3. 3-7-2 Production in vitro 3-8 Purification et conservation des anticorps monoclonaux 4- Utilisation des anticorps monoclonaux dans la thérapie 4-1 Anti IgE 4-2 Anti CD20 4-3 Anti HER2 4-4 Anti VGEFR2 5- Diagnostic par les anticorps monoclonaux 5-1 Diagnostic des infections respiratoire 5-2 Recherche des anticorps, Sérologies Virales 6- Pharmacologie 6-1 Absorption 6-2 Distribution 6-3 Métabolisme 6-4 Elimination 7- Les effets secondaires des anticorps monoclonaux 8- Les anticorps monoclonaux biosimilaires 9- Economie des anticorps monoclonaux 10- Conclusion 11- Bibliographie
  • 4. 1-Introduction : La biotechnologie permet de créer les médicaments de demain comme la synthèse de molécule naturelle : anticorps monoclonaux largement utilisés en biologie et en médecine à la fois comme outil de diagnostic et dans des buts thérapeutiques. 1-1 Définition : Les anticorps monoclonaux sont immunoglobuline(IgG) caractérisées par un poids moléculaire important (Environ 150.000 daltons) Ils ne reconnaissent qu’un seul type d’épitope sur un antigène donné. Ils sont tous identiques et produits par un seul clone de plasmocyte. 1-2 Objectifs :  Étudier la production des biomolécules à partir de systèmes eucaryotes.  Utilisation des biomolécules dans le diagnostic et dans la thérapie. 1-3 Historique  En 1888 :l’invention de la sérothérapie par CHARLES RICHET  En 1928 : le premier antibiotique PENICILLINE a été découvert par ALEXANDER FLEMING en étudiant les champignons  En 1959 : la structure des antibiotiques a été décrite par PORTER et EDEIMAN  En 1975 : la première production d’anticorps monoclonaux par CESAR MILSTEN et GEORGES KHOLER la technique d’hybridome 1-4 Comparaison des principales caractéristiques des ACM et ACP : ACM ACP Temps et cout de fabrication Rapide et moins cher Lent et plus cher Reproductibilité Variable Constante Affinité Variable Constante Concentration et degré de pureté Faible Elevé Stabilité de pH Plus stable Moins stable Disponibilité Limitée Illimitée
  • 5. 1-5 Les différents types d’anticorps monoclonaux : 1-5-1 Murins (MOMAB) : en 1975 100 % murin Mais ces anticorps monoclonaux ont présenté des effets indésirables sérieux : -La formation d’Anticorps humains anti Ig murin ou HAMA (humain anti mouse anti bodies) -Les anticorps murins ont une demi-vie courte dans le sérum -Capacité limitée de recruter des effecteurs cellulaires comme le complément 1-5-2 Chimérique (XIMAB) : 25% MURIN Les régions constantes des chaines lourdes et légères des anticorps murin sont remplacées par les régions constantes des chaines lourdes et légères des anticorps humains par la technique d’ADN recombinant 1-5-3 Humanisé : ZUMAB Afin d’augmenter les parties humaines des anticorps on a greffé les parties hyper variables CDR (complementarity determining regions) d’anticorps murin par technique de greffe des CDR 1-5-4 Humain (MUMAB) : 100% HUMAIN par deux techniques : 1-5-4-1 Souris transgénique : Les gènes de souris peuvent être remplacés L’obtention de ces souris nécessite trois grandes étapes 1- inactiver les gènes codants pour les chaines légères et lourdes de l’anticorps considéré .cette étape a été réalisé dans des cellules souches embryonnaires 2 - transfecter chez les souris les locus correspondants aux gènes des anticorps humains Le clonage de ces locus a été facilité par l’utilisation des chromosomes artificiels de levure (yac : yeast artificial chromosom) Les yac ont été introduits dans des cellules souches 3-après plusieurs portés ; la souris transgénique peut produire des anticorps d’origine humaine 1-5-4-2 Technique du phage display : Les bactériophages ou phages sont des virus qui doivent infecter une bactérie hôte afin de se multiplier en reproduisant leur ADN en grand nombre de copies ; puis sont libérés sous forme de particules virales comportant un assemblage de protéines virales entourant cet ADN On peut introduire dans le génome des phages ; des séquences d’ADN codant les anticorps de telle façon que ceux-ci se retrouvent joints au domaine N-terminal des protéines de surface du phage sous forme de fragments Fc Fab Cette technique de présenter des protéines recombinantes à la surface de phage filamenteux est appelée « technique de phage display »
  • 6. 2-Moded’action : Les anticorps monoclonaux peuvent fonctionner selon trois principaux modes d’action : Blocage, Signalisation, Ciblage. 2-1 Blocage : est une premier voie d’action directe , les ACM vont empêcher l’action de facteur de croissance, de cytokine ou d’autre médiateurs solubles en se liant directement au facteur soluble lui-même ou à son récepteur. 2-2 La signalisation : Est une voie d’action indirecte qui recrute d’autres effecteurs. L’anticorps, par l’effet de sa plurivalence antigénique permet de regrouper au niveau de la membrane de la cellule cible les marqueurs antigénique reconnus. Ce phénomène peut alors induire au niveau intracellulaire l’activation de signalisation de l’apoptose via des cascades des phosphorylations aboutissant à l’arrêt de cycle cellulaire et donc à la mort de la cellule cible. 2-3 Le ciblage : Est une troisième voie d’action directe. En cas d’invasion microbienne, les anticorps sont capables de reconnaître des structures antigéniques de l’agent pathogène et cette reconnaissance induit directement l'élimination de ce pathogène par deux mécanismes principaux : 2-3-1 La CDC (complement dependent cytotoxicity) : La fixation de l’Ac sur l’Ag active le système de complément, cette activation entraine la destruction de la cellule cible par la formation de complexe d’attaque membranaire (CAM) au niveau de la membrane du la cellule cible. 2-3-2 L’ADCC (Anti body Dependent Cellular Cytotoxicity): Les anticorps, fixés spécifiquement sur une structure antigénique par leur région variable, sont reconnus au niveau de leur région constante (fragment FC) par différentes cellules effectrices, comme les macrophages ou les cellules NK (naturel killer…). Cette reconnaissance se fait par l'intermédiaire de récepteurs particuliers pour ce fragment FC. Cette interaction FC-RFc déclenche l’activité cytotoxique de ces cellules sur la cible antigénique. 2-3-3 la phagocytose : Par la fixation d’Ac monoclonal sur le récepteur par sa partie FC par le biais de macrophage. 3-Productiondes anticorps monoclonaux(in vitro /in vivo) : Afin de produire des lignées stables de cellules produisant l'anticorps désiré, Kohler et Milstein ont élaboré l'idée et la méthode de fusion de deux types de cellules. Ainsi, des cellules B (produisant les anticorps), dont l'incapacité de se reproduire est palliée par des myélomes (des cellules cancéreuses immortelles) résulte en un hybridome secrétant des anticorps et ayant à la fois la propriété de se reproduire indéfiniment
  • 7. Cette technique compte 5 étapes : -L’obtention de lymphocytes sensibilisés -La fusion des lymphocytes B sensibilisés avec des cellules de myélome -La sélection des cellules hybrides - Le clonage des hybridomes sécréteurs - Le screening des cellules productrices d’anticorps 3-1 Définition d’un hybridome : Un hybridome est une cellule qui provient de l'hybridation entre des cellules lymphoïdes normales de mammifères et des cellules myélomateuses de tumeurs malignes du système immunitaire. L'intérêt est de cumuler les propriétés des deux cellules de départ : production spécifique d'anticorps pour le lymphocyte et immortalité pour la cellule cancéreuse. Les hybridomes donnent des lignées immortalisées stables productrices d'anticorps monoclonaux. 3-2Immunisation des animaux : Choix de l’animal La souris reste l’animal le plus utilisé, car le génome des souris présente environ 95% d’homologie avec celui de l’homme. De plus, les souris sont des animaux de petites tailles et faciles à élever, ont une durée de vie courte et se reproduisent facilement. L’utilisation de souris permet d’obtenir à la fois des cellules de myélome et des lymphocytes B compatibles entre eux pour l’étape suivante, la fusion. Le modèle rat peut également être utilisé. En 1970, Bazin et Beckers ont entrepris d’élever des rats, qui présentaient la caractéristique de produire des anticorps après une injection intraveineuse d’antigène au niveau de la rate. De plus, le volume d’ascite obtenu chez un rat est environ dix fois plus important que chez la souris Protocole d’immunisation L’immunisation est réalisée par une injection de fortes doses d’antigène par voie intraveineuse ou péritonéale sur quatre semaines environ, ainsi les lymphocytes B qui réagissent à l’antigène choisi sont chaque fois plus fortement stimulés. Afin de stimuler le système immunitaire de l’animal, la première injection est effectuée en présence d’adjuvant complet de Freund (mélange d’huile minérale, qui a pour but de freiner la diffusion de l’antigène prisonnier dans l’huile, produisant ainsi un effet retard, et mélange de mycobactéries tuées qui génèrent une réaction inflammatoire avec granulome .Une injection intraveineuse de quatre à cinq fois la dose initiale d’antigène est administrée trois jours avant la fusion, afin d’amplifier et de stimuler le système immunitaire de l’animal. 3-3 Fusion : Toutes les étapes suivantes doivent être réalisées dans des conditions stériles pour prévenir toute contamination bactérienne et fongique. Le but de cette étape est de fusionner une cellule de souris productrice d’un anticorps monoclonal avec une lignée de cellules humaines «
  • 8. immortelles » ayant la particularité de se diviser indéfiniment. Après le sacrifice de l’animal, la rate est extraite puis broyée, et les cellules sont mises en suspension dans un milieu dépourvu de sérum. L’élimination des érythrocytes s’effectue par centrifugation sur gradient de densité, à 400 g pendant 30 minutes. Les globules rouges et les 24 cellules mortes se localisent au fond du tube, tandis que les lymphocytes demeurent à l’interface, formant un anneau blanc pâle. Au-dessus de l’anneau des lymphocytes figurent un milieu contenant les cellules spléniques. Les lymphocytes peuvent être prélevés à l’aide d’une pipette pasteur et lavés ; par centrifugation On obtient 1.107 à 1.108 cellules par rate de souris. Les lymphocytes sont ensuite mélangés avec les cellules de myélome préparées extemporanément. Les cellules de myélome sont des cellules cancéreuses, non sécrétrices d’anticorps, qui ont la capacité de se multiplier de façon indéfinie in vitro. Au moment de la fusion, elles doivent être en phase de croissance exponentielle. Généralement, la cellule myélomateuse utilisée a subi, au préalable, une double mutation qui lui fait perdre la capacité de secréter des immunoglobulines et la prive de la faculté de produire l’enzyme hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transférase (HGPRT), enzyme qui intervient dans la synthèse d’ADN et ARN par la voie exogène. L’étape de fusion se fait selon deux méthodes principales : l’utilisation d’un agent fusionnant, ou l’électrofusion cellulaire. 3-3-1Utilisation d’un agent fusionnant En 1960, H. Harris découvrit le pouvoir de fusion du virus de SENDAI. Ce paramyxovirus, sous l’action soit de rayons ultraviolets, soit traité à la b-propiolactone, perd son pouvoir infectieux et létal sans modification de ses pouvoirs hémagglutinant et fusionnant. Afin de prévenir tout risque de prolifération du virus SENDAI, il est actuellement remplacé par le polyéthylène glycol (PEG), polymère qui a l’avantage d’induire une fusion rapide (2 min à 37°C) et d’être dépourvu d’impureté toxique pour les cellules. Il agit par diminution des charges négatives de surface, ce qui provoque l’affaiblissement des forces de répulsion et donc, un meilleur contact entre les cellules. 3-3-2 L’électrofusion cellulaire Le principe de l’électrofusion cellulaire repose sur la formation de pores transitoires dans la membrane cellulaire sous l’effet d’un champ électrique alternatif de haute fréquence. Si les cellules sont au préalable en contact étroit, la fusion cellulaire peut avoir lieu sous l’action d’une brève impulsion d’un courant continu de haute tension. Dans le cas des hybridomes, un contact plus spécifique entre la cellule myélomateuse et le lymphocyte peut être tenté par une liaison dirigée grâce à un complexe avidine-biotine. Les rendements en hybridomes viables sont moins satisfaisants que ceux obtenus par le polyéthylène glycol. Ainsi, la fusion par le PEG est celle utilisée en laboratoire. 3-4 Sélection des cellules hybrides : La sélection des hybridomes met à profit le déficit enzymatique des cellules de myélome en hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transférase. L’addition de l’aminoptérine bloque la synthèse endogène des bases puriques et pyrimidiques. En l’absence de l’enzyme HGPRT, les cellules de myélome ne peuvent utiliser l’hypoxanthine exogène pour synthétiser les purines, donc elles meurent, alors que les hybridomes, non déficitaires en cette enzyme qui est apportée par les lymphocytes B sensibilisés, peuvent utiliser l’hypoxanthine et la thymidine dans la voie exogène afin de synthétiser l’ADN et l’ARN nécessaires à la vie et à la multiplication des cellules d’hybridome. De même, les cellules immunocompétentes sont incapables de se multiplier en culture et meurent rapidement. Le supplément sélecteur hypoxanthine aminopterine thymidine (HAT) est additionné au milieu de micro culture pendant la première phase après la fusion. Il sera remplacé par l’hypoxanthine thymine après
  • 9. élimination des cellules de myélome. Suite à une période de sélection dans le milieu HAT, les hybridomes se développent en colonies. Le taux de succès d’une fusion est plutôt faible et varie selon le protocole utilisé (de 5% à 50%). 3-5 Screening des cellules productrices d’anticorps : Les puits de culture positifs contiennent une série entière d’hybridomes secrétant des anticorps tous différents. La lignée de cellule de l’hybridome réellement productrice d’anticorps monoclonal doit être isolée avant sa mise en culture. La sélection des hybridomes producteurs d’anticorps monoclonaux spécifiques se fait par des tests d’activité anticorps dans le surnageant de la culture. Les méthodes utilisées sont la radioimmunologie (RIA), la révélation immunoenzymatique (ELISA), l’hémagglutination, l’immunofluorescence indirecte. Ces tests sont généralement effectués entre 9 et 11 jours après la fusion. On constate que même avec le meilleur schéma d’immunisation contre un antigène puissant, moins de 5% des cellules spléniques produisent des anticorps spécifiques. 3-6 Clonages des hybridomes sécréteurs 3-6-1 Clonage par dilution limite Le principe de la méthode est de diluer le mélange de telle manière que, lors de la distribution de la suspension cellulaire dans des plaques multi puits, on puisse s’attendre statistiquement à une seule cellule par puits. Cette méthode est une procédure en trois temps. La première série de dilutions permet de sélectionner les cellules qui sécrètent en grande quantité l’anticorps. La deuxième série de dilutions permet de sélectionner les lignées cellulaires à partir d’une seule cellule. La troisième série de dilutions permet de vérifier le clonage. 3-6-2 Clonage sur gel d’agarose Le but est de faire croître les cellules dans un milieu solide. Il existe une variété de gels qui permet la croissance des cellules après addition de facteurs appropriés (sérum, acides aminés, antibiotiques…). Les cellules se divisent et forment des foyers sur le gel d’agarose qui ressemblent à des petites sphères. Comme le milieu est semi solide, ces petites boules peuvent être prélevées à l’aide d’une pipette et placées dans une plaque de puits de culture. 3-7 Production de masse des anticorps monoclonaux Le but à atteindre ensuite est de faire proliférer l’hybridome sélectionné dans les meilleures conditions afin de produire suffisamment d’anticorps. La production à grande échelle d’anticorps monoclonaux repose sur la culture des hybridomes soit in vivo, soit in vitro. 3-7-1 Production in vivo : procédéde l’ascite Le procédé de l’ascite implique l’injection intrapéritonéale ou sous-cutanée tout d’abord de pristane (huile minérale) chez une souris ou un rat, provoquant ainsi une irritation de la cavité abdominale mais pas encore d’ascite. Une à trois semaines après, les hybridomes (106 à 107 cellules) sont injectés dans le péritoine des souris. Au cours des 10 à 25 jours suivants, la tumeur se développe dans toute la région péritonéale sous forme d’ascite et, durant le processus de multiplication, les cellules produisent des quantités importantes d’anticorps monoclonaux. Lorsque l’ascite a atteint un certain volume, l’abdomen est ponctionné avec une aiguille. Une seule souris produira 10 à 20 mL de liquide d’ascite contenant environ 10 mg/ml d’anticorps monoclonaux. L’histocompatibilité entre l’hybride et la souris productrice d’ascite est requise. A chaque passage sur souris ou rat, la production d’anticorps monoclonaux doit être vérifiée pour s’assurer de la persistance de la capacité sécrétoire d’hybridome. La culture en ascite permet une production flexible de petites quantités d’anticorps monoclonaux. Cette production in vivo présente cependant plusieurs inconvénients, notamment la petite taille de la souris et la présence de nombreuses enzymes protéolytiques dans l’ascite.
  • 10. De plus, le liquide de l’ascite contient un mélange de protéines dont certaines sont des immunoglobulines. Il se pose aussi le problème éthique de l’utilisation des animaux et de l’injection de cellules cancéreuses. La production in vivo devient de plus en plus une technique obsolète. 3-7-2 Production in vitro : procédépar culture cellulaire Pour diverses applications, il est nécessaire de produire des quantités plus importantes d’anticorps. Pour l’imagerie in vivo, on doit disposer de quelques centaines de microgramme d’anticorps par patient. Pour la thérapie in vivo, plusieurs centaines de milligramme sont requises par patient. La production in vitro est basée sur la culture des hybridomes dans des milieux de culture définis. Le milieu ajouté pour la nutrition des cellules contient du sérum de veau foetal. Après l’adaptation des lignées de cellules, on peut utiliser un milieu exempt de sérum, et donc éliminer le risque de contaminations accidentelles par des micro-organismes présents dans le sérum. Afin d’accélérer la division, des cellules nourricières sont incorporées au milieu. La culture de cellules peut être effectuée dans des flacons d’un contenu de 0,5 à 1 litre dans des flacons pour cultures selon Spinner d’un contenu de 1 à 10 litres, dans des réacteurs capillaires (principe de la dialyse) ou dans des fermenteurs de capacités diverses (10 à 1000 litres). Les opérations de type batch ou discontinu, constituent le mode de gestion le plus simple et le plus flexible de conduite des cultures. Après inoculation, celles-ci se poursuivent jusqu’à épuisement du milieu et récolte du produit. Elles sont réalisées dans des cytoculteurs, le plus souvent des bioréacteurs à agitation mécanique dérivés des fermenteurs microbiens. Le plus important pour la survie des cellules, comme pour le contrôle de la culture, est de maintenir toutes les cellules en suspension, avec une bonne homogénéisation du liquide. Les bioréacteurs à agitation pneumatique sont une alternative satisfaisante aux dispositifs d’agitation mécanique pour des cultures allant jusqu’à 1000 litres. C’est alors l’introduction d’air comprimé qui provoque l’agitation et l’oxygénation du milieu. Un inconvénient des opérations discontinues est que le milieu de culture s’épuise au fur et à mesure que les cellules l’utilisent, ce qui limite tant la croissance cellulaire que la production. Les opérations de type fed-batch représentent ainsi une amélioration des procédés batch. Elles consistent à apporter de manière contrôlée des nutriments en cours de route, pour prévenir leur épuisement. Un nouveau perfectionnement de la culture des cellules animales consiste à passer aux opérations réellement continues, avec apport permanent de nutriments et retrait simultané du milieu usagé et des produits formés, le volume de culture restant constant. D’autres systèmes de perfusion utilisent des microporteurs poreux sur lesquels les cellules sont immobilisées. Par exemple, le procédé Celli-Gen Plus comprend un agitateur à haut débit qui permet de faire circuler le fluide nutritif et l’oxygène à travers un lit de supports fibreux sur lesquels les cellules sont fixées en grand nombre 3-8 Purification et conservation des anticorps monoclonaux La purification peut se faire de différentes manières, comme par exemple la chromatographie par filtration sur gel, chromatographie par échange d’ions ou par précipitation au sulfate d’ammonium. La conservation des anticorps monoclonaux est obtenue par congélation d’une partie du clone dans une ampoule placée dans l’azote liquide. L’autre partie du clone est maintenue en activité ; sa durée de vie est de plus de 20 ans. 4-L’utilisation des anticorpsmonoclonauxdans la thérapie : 4-1 L’anti IgE :
  • 11. L’IgE joue un rôle important dans l’expression de l’inflammation des voies respiratoire aussi dans l’apparition des réactions allergiques chez les maladies asthmatiques. L’anti IgE est un anticorps monoclonal humanisé agit soit :  Par la liaison avec l’IgE présent sur la surface des mastocytes ou les basophiles donc l’inhibition de la fixation de l’allergène et par la suite la disparition des symptômes de l’asthme  Par sa liaison avec l’IgE libre donc formation du complexe immun qui va empêcher la liaison de l’IgE avec les cellules mastocytaires et les basophiles. 4-2 L’anti CD20 : le CD20 est exprimé sur la surface des cellules LB dans la plus part de leur stade de développement à l’exception des plasmocytes et les stades tout à fait initiaux. L’anti CD20 est un anticorps monoclonal qui a montré son efficacité chez les patients de tumeur maligne lymphoïde (lymphome non hodgkinien). C’est une IgG chimérique qui cible l’Ag CD20 présent sur les cellules LB maligne et normaux donc il induit comme un effet secondaire la lymphopénie. Il agit via trois mécanismes :  Liaison directe.  Activation de cascade su complément CDC.  ADCC. L’anti CD20 a un effet antiprolifératif pour les cellules donc induction de la mort cellulaire. 4-3 L’anti HER2 : HER2 est un récepteur du facteur de croissance surexprimé dans les cellules tumorales du sein. L’anti HER2 se lie au HER2 et induit donc l’inhibition de transmission du signal de prolifération. 4-4 L’anti VGEFR2 : Le VGEF facteur de croissance endothéliale vasculaire permet la vascularisation accrue des tumeurs et la métastase. TTAC-0001 anticorps monoclonal humain contre le VGEFR2 inhibe la liaison du VGEF et induit un signal d’inhibition pour les cellules. L’activité anti tumorale de TTAC-0001 a été montrée dans un modèle préclinique en corrélation avec l’arrêt de croissance de la tumeur, induction de l’apoptose et inhibition de l’angiogenèse 5-Diagnostic par les anticorpsmonoclonaux 5-1 Diagnostic des infections respiratoires :
  • 12. La recherche des antigènes viraux consiste à identifier l’infection virale directement au sein des cellules infectées présentes dans les prélèvements des patients. Le meilleur exemple est celui du diagnostic des infections respiratoires. A partir des prélèvements nasopharyngés, on peut rechercher les antigènes viraux dans les cellules du nez ou de la gorge. Les virus para- influenzae s’accumulent dans le cytoplasme des cellules infectées. Les antigènes viraux peuvent être visualisés par technique d’immuno-fluorescence, en utilisant des anticorps spécifiques de chaque virus marqués par la fluorescéine. On utilise des anticorps monoclonaux. Cette technique est simple et rapide (une à deux heures), elle permet de rechercher simultanément plusieurs virus sur un même prélèvement. 5-2 Recherche des anticorps, Sérologies Virales : L’infection virale est le plus souvent suivie par une réponse immunitaire humorale traduite pa r la production d’anticorps spécifiques des antigènes du virus (immunoglobulines IgG et IgM). La connaissance d’un statut sérologique présente différents intérêts : elle permet de connaître l’état immunitaire du sujet : un titre positif permet d’affirmer que le sujet est immunisé et a rencontré une fois le virus dans sa vie (CMV, HIV, Rubéole) ou bien qu’il est vacciné (hépatit e B). Elle permet aussi de suivre l’évolution de l’infection virale (anticorps anti HBc et HBs). Les anticorps sont présents dans les différents liquides biologiques de l’organisme et notamment dans le sang périphérique (plasma ou sérum selon que le sang est prélevé avec ou sans anticoagulant). Cinq à dix millilitres de sang veineux suffisent pour effectuer la recherche de plusieurs marqueurs ou faire plusieurs sérologies. Les échantillons de plasmas ou de sérums se conservent au congélateur et doivent être gardés un an par le laboratoire. Différentes techniques sont utilisées : ELISA, agglutination, Western blot et immunoblot. L’ELISA est devenue la technique la plus utilisée car elle est rapide simple spécifique. 6-Pharmacologie : 6-1 Administration : L'administration se fait par voie parentérale (intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire), Les anticorps monoclonaux diffusent dans tout l'organisme mais ne passent pas la barrière hémato-encéphalique. 6-2 Distribution La phase de distribution apparaît déterminante pour les anticorps à visée tissulaire c.à.d. les anticorps utilisés en oncologie. La distribution dépend de la physiologie tumorale et des caractéristiques de l'anticorps. Le principal facteur limitant la diffusion tumorale des anticorps apparaît être l'affinité pour l'antigène membranaire cible et l'intensité de l'expression antigénique. 6-3Elimination
  • 13. L'élimination se fait soit après fixation à l'antigène cible (endocytose du complexe anticorps- antigène et dégradation par les lysozomes), soit de manière non spécifique par le système réticulo-endothélial. L'élimination urinaire d'un anticorps monoclonal radiomarqué administré représentait 22 % de la dose injectée. L’excrétion rénale des anticorps monoclonaux actuellement commercialisés n'est pas documentée sinon de manière indirecte. Par exemple, l'insuffisance rénale ne semble pas avoir d'impact sur l'élimination du trastuzumab. 7- Les effets secondaires des anticorps monoclonaux Une hausse de la pression artérielle.  Des maux de tête.  Une présence de protéine dans les urines.  Des réactions allergiques.  Une confusion.  Des douleurs musculaires légères.  La formation de caillots de sang (rare)  Une perforation de l’intestin (rare). Ces effets secondaires sont temporaires et disparaissent à la fin du traitement. 8-Anticorpsmonoclonauxbiosimilaires : Un biosimilaire est similaire à un médicament biologique (produit à partir d’une cellule ou d’un organisme vivant) de référence, qui a déjà été autorisé, Ce médicament doit avoir des propriétés physico-chimiques et biologiques similaires, la même substance pharmaceutique et la même forme pharmaceutique que la référence. Comme pour tout médicament issu de la biotechnologie, il est possible de développer un AcMo biosimilaire à un AcMo de référence. L’objectif principal reste de démontrer la comparabilité chez une population homogène de sujets afin de réduire au maximum toute variabilité dans la réponse au traitement et d’en simplifier l’interprétation. En 2011 aucun anticorps monoclonal biosimilaire n’était autorisé mais elles ne représentent actuellement que 1% du marché des produits biologiques au niveau mondial et leur croissance reste conditionnée par plusieurs facteurs. Quelques exemples des Anticorps monoclonaux biosimilaires : • Reditux (dirigé contre la molécule de surface CD20 présente sur la plupart des cellules B) est un biosimilaire de rituximab (Mabthera ™) approuvé en Inde en 2007. • Clotinab (inhibe l'agrégation plaquettaire en se liant au récepteur de fibrinogène GP IIb / IIIa) est un biosimilaire de abciximab est approuvé en Corée du Sud.
  • 14. 9- Economie des anticorpsmonoclonaux: La commercialisation du premier anticorps monoclonal a été évaluée à 18 milliards de dollars EU en 2006, le marché des anticorps monoclonaux avait atteint 40 milliards en 2010. Sur la période 2010- 2016, le taux de croissance annuel moyen devrait dépasser les 8%, ce qui en fait le segment le plus dynamique du marché des médicaments. Ce succès s’explique en particulier par la possibilité de concevoir ces médicaments de façon rationnelle, avec une grande spécificité pour leur cible, ce qui limite les effets secondaires. Le marché français des anticorps monoclonaux est estimé à 7,9 milliards de dollars en 2018. Etant donné que le nombre d’antigènes à cibler est très grand voire infini, ces médicaments devraient pouvoir répondre à un grand nombre de maladies, dont certaines aujourd’hui incurables : maladie de Crohn, asthme, cancer, DMLA (Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age), maladie coronarienne… 10-Conclusion: • Le succès des Ac Mo est le résultat d’un long cheminement depuis la découverte de leur technique de fabrication. • Les anticorps monoclonaux sont donc une voie d'avenir précieuse notamment pour des pathologies qui n'ont pas de traitement ou des traitements peu satisfaisants. Certains sont aujourd'hui en cours de développement notamment dans le rejet de greffe de rein, les leucémies aiguës myéloïdes et les leucémies lymphoïdes chroniques. 11- Bibliographie : -Journal Scientifique Biologie René Descartes N°1 septembre 2002 -Immunoanalyse & Biologie Spécialisée Volume 19, n° 5 pages 250254 (octobre 2004) Serum Her2 marker, breast cancer and trastuzumab (Herceptine®) -American Journal of Transplantation. 2006; 6: 859866 Le rituximab, un anticorps monoclonal antiCD20 Anticorps : Histoire et Mécanisme d'action M. D. Pescovitz. -Nancy-université : université HENRI POINCARE faculté de pharmacie .Thèse sur « les anticorps monoclonaux ; de la production à l’utilisation en oncologie » présentée le 23 /10/2009 SCHINDELE A, Thèse, les anticorps monoclonaux, de la production a l’utilisation en oncologie, 23 octobre 2009. -Université de Tokyo professeur de sciences Ken Ota http://medical.radionikkei.jp/suzuken/final/090409html/index.html: L'asthme bronchique thérapeutique anti-IgE anticorps monoclonal omalizumab -Alexandre m et al, Afssaps, DES médicaments issus DES biotechnologies aux médicaments biosimilaires : état DES lieux, juillet 2 011. LE PEN C, Rapport, Les biosimilaires, Avril 2014. www.microbes-edu.org, Le diagnostic virologique des infections virales.
  • 15. -2015 Sep 3;7(5):957-68. doi: 10.1080/19420862.2015.1045168. Epub 2015 May 5. TTAC- 0001, a human monoclonal antibody targeting VEGFR-2/KDR, blocks tumor angiogenesis. Lee WS1 et all.