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LA REPONSE IMMUNITAIRE CELLULAIRE
ET LES MESURES IN VITRO
HAMMA IBRAHIM MAIGA, MD
Malaria Research & Training Center/
Département D’Épidémiologie des Affections Parasitaires/
Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontostomatologie.
Bamako, Mali (Afrique de l’Ouest).
BP: 1805 TEL: 223 222 81 09
EVALUATION
par les FACILITATEURS
Plan
• Introduction
• Réponse de l’immunité cellulaire à chaque stade de l’infestation du
parasite (malaria)
• Reproduction in vitro de la réponse cellulaire
• Intérêt
1
Introduction
Immunité cellulaire:
1- Lymphocyte T détecte & reconnaît l’Ag immédiatement
2- Plusieurs populations de lymphocytes T CD4 – CD8
3- La cible n’est pas directement l’Ag mais la cellule qui le porte et alors
reconnue comme non-soi
In vitro : Qualifie un processus biologique observé/étudié en
éprouvette ou en laboratoire, dans des conditions artificielles, par
opposition à in vivo.
Réponse de l’immunité cellulaire à chaque stade de
l’infestation du parasite
2
L'hépatocyte au sein duquel se développe Plasmodium est la seule cible vis à vis de laquelle
peuvent opérer des cellules T CD8[+] et T CD4[+].
Cela implique que ces cellules peuvent reconnaître des peptides dérivés de protéines parasitaires
présentés en surface de l'hépatocyte parasité en association avec les molécules du Complexe
Majeur d'Histocompatibilité (CMH).
Une séquence peptidique leurs a conduit à l'identification d'un peptide présentant des motifs
d'ancrage de l'haplotype H-2K[d]
Ce peptide est capable d'induire des mécanismes de cytotoxicité dépendant des cellules T CD8[+]
dirigés contre l'hépatocyte infecté in vitro.
Phase hépatique [Pétour Pascal ; Mazier Dominique] 3
• Les cellules NK purifiées des donneurs de sang n’ayant eu aucune exposition préalable au paludisme avant
le prélèvement sanguin, inhibent la croissance des parasites après 48h de co-culture en présence de sérum
de sujets semi immuns.
• Cette situation est abolie lorsque les cellules NK sont préalablement incubées avec un anticorp monoclonal
anti-CD95 (anti-fas) humain ou avec la protéine chimère composé par la fusion de la molécule fas et du
fragment Fc d’immunoglobuline humaine soluble.
- le niveau de l’inhibition de la croissance des parasites est également substantiellement réduit par le
prétraitement des cellules avec un anticorp anti-CD56.
• D’autre part la destruction direct des érythrocytes parasités par les cellules NK, en l’absence de tout sérum
a été observée par le test standard de mesure de cytotoxicité par la libération de chrome radioactif.
Phase Érythrocytaire [Pr Elie Mavoungou] 4
Technique in vitro
Préparation des cellules effectrices:
- PBMC : Peripheral blood mononuclear Cells; Monocytes et lymphocytes
L’obtention des cellules NK humaines
En utilisant le système de purification MACS (Magnetic Activated Cell Sorter).
1- Sélection positive, les cellules NK contenues dans le mélange de PBMCs sont reconnues par leur
marqueur majeur, l’antigène CD56. Cette reconnaissance sélective est réalisée par l’utilisation
d’anticorps dirigés contre cet antigène. L’anticorps est artificiellement couplé aux billes
magnétiques.
Le mélange cellulaire est ensuite passé dans un champ magnétique qui va piéger les billes
magnétiques et donc le couplage anticorps CD56-cellules NK.
Après lavage des cellules dans du milieu complet frais, les cellules sont placées dans un incubateur
à CO2 réglé à 37°C pendant environ 16 heures afin de permettre le détachement des billes
magnétiques.
2- Sélection négative est basée sur le même principe, mais dans ce cas, ce sont tous les autres
types cellulaires, autre que les cellules NK,
Toutes ces cellules sont retenues dans le champ magnétique à l’exception des cellules NK qui
sont recueillies librement. Les anticorps spécifiques utilisés dans ce cas sont
essentiellement :
• l’anticorps anti-CD3, marqueur sélectif de tous les lymphocytes T,
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Stimulation des PBMC par des hématies parasitées par Plasmodium falciparum.
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par cytométrie en flux.
Prélèvements
Héparine
sodium Ficoll
PBMC
Plasma
Ajuster à
1.106
¢/ml dans du
RPMI-0
Répartition
…
600µl pour
0,6.106
¢
6ml pour
6.106
¢
Le plasma servira
pour la mise en
culture en système
autologue…
Centrifugati
on pour
mettre en
culot
Incubation avec
le CFDA
Re-centrifugation
pour mettre en
culot
Ajouter 360µl
de RPIM-0 +
240µl de plasma
autologue
Ajouter 3,6ml
de RPIM-0 +
2,4ml de plasma
autologue
RBC
PRBC6 puits avec
100µl/puit
3 puits
avec
2ml/puit
+100µl/puit de
RBC ou PRBC
+ 2ml/puit de
RBC ou PRBC
…voir le
protocole pour
les plans de
plaques…
Préparation des
suspensions de
globules rouges de
manière à avoir
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Intérêt
Compréhension des mécanisme in vivo
Relation hôte/parasite
Essais vaccinaux
GRAND MERCI A LA CULTURE IN VITRO QUI NOUS PERMET
D’AVOIR UNE BANQUE CELLULAIRE
*********
MERCI DE VOTRE AIMABLE ATTENTION
*******
QUESTIONS
Références Bibliographiques
1- http//www.ifmt.auf.org/IMG/pdf/IFMT MB1 Immunité anti-infectieuse.pdf
2- Olivier Silvie, Dominique Mazier, Eric Rubinstein et Claude Boucheix
« CD81: une tétraspanine impliquée dans l’infection par Plasmodium ». M/S médecine sciences Volume 19,
numéro 2, Février 2003
3- Pétour Pascal ; Mazier Dominique
Isolement et identification de nouveaux épitopes exprimés en surface de l'hépatocyte infecté par des
Plasmodies : modèle de la souris BALB/c infectée par Plasmodium yoelii (Isolation and identification of
news epitopes expressed at the surface of the infected hepatocytes by Plasmodium spp : model of the
BABL/c mice infected by Plasmodium yoelii) 1997, [Note(s) : , 173] (341 ref.) Travaux universitaires
(Année de soutenance : 1997) (No : 97 PA06 6503) Université de Paris 06, Paris, FRANCE
4- Elie Mavoungou
La cytolyse des érythrocytes au cours du paludisme: L’implication des cellules NK
In European cytokine network vol. 14, N°3, pp. 134-142, 2003.
5- Olivier Domarle (Anonyme).
Protocole de recherche de l’unité d’immunologie, Institut Pasteur de Madagascar.

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La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitro

  • 1. LA REPONSE IMMUNITAIRE CELLULAIRE ET LES MESURES IN VITRO HAMMA IBRAHIM MAIGA, MD Malaria Research & Training Center/ Département D’Épidémiologie des Affections Parasitaires/ Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontostomatologie. Bamako, Mali (Afrique de l’Ouest). BP: 1805 TEL: 223 222 81 09 EVALUATION par les FACILITATEURS
  • 2. Plan • Introduction • Réponse de l’immunité cellulaire à chaque stade de l’infestation du parasite (malaria) • Reproduction in vitro de la réponse cellulaire • Intérêt
  • 3. 1 Introduction Immunité cellulaire: 1- Lymphocyte T détecte & reconnaît l’Ag immédiatement 2- Plusieurs populations de lymphocytes T CD4 – CD8 3- La cible n’est pas directement l’Ag mais la cellule qui le porte et alors reconnue comme non-soi In vitro : Qualifie un processus biologique observé/étudié en éprouvette ou en laboratoire, dans des conditions artificielles, par opposition à in vivo.
  • 4. Réponse de l’immunité cellulaire à chaque stade de l’infestation du parasite 2
  • 5. L'hépatocyte au sein duquel se développe Plasmodium est la seule cible vis à vis de laquelle peuvent opérer des cellules T CD8[+] et T CD4[+]. Cela implique que ces cellules peuvent reconnaître des peptides dérivés de protéines parasitaires présentés en surface de l'hépatocyte parasité en association avec les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH). Une séquence peptidique leurs a conduit à l'identification d'un peptide présentant des motifs d'ancrage de l'haplotype H-2K[d] Ce peptide est capable d'induire des mécanismes de cytotoxicité dépendant des cellules T CD8[+] dirigés contre l'hépatocyte infecté in vitro. Phase hépatique [Pétour Pascal ; Mazier Dominique] 3
  • 6. • Les cellules NK purifiées des donneurs de sang n’ayant eu aucune exposition préalable au paludisme avant le prélèvement sanguin, inhibent la croissance des parasites après 48h de co-culture en présence de sérum de sujets semi immuns. • Cette situation est abolie lorsque les cellules NK sont préalablement incubées avec un anticorp monoclonal anti-CD95 (anti-fas) humain ou avec la protéine chimère composé par la fusion de la molécule fas et du fragment Fc d’immunoglobuline humaine soluble. - le niveau de l’inhibition de la croissance des parasites est également substantiellement réduit par le prétraitement des cellules avec un anticorp anti-CD56. • D’autre part la destruction direct des érythrocytes parasités par les cellules NK, en l’absence de tout sérum a été observée par le test standard de mesure de cytotoxicité par la libération de chrome radioactif. Phase Érythrocytaire [Pr Elie Mavoungou] 4
  • 7. Technique in vitro Préparation des cellules effectrices: - PBMC : Peripheral blood mononuclear Cells; Monocytes et lymphocytes
  • 8. L’obtention des cellules NK humaines En utilisant le système de purification MACS (Magnetic Activated Cell Sorter). 1- Sélection positive, les cellules NK contenues dans le mélange de PBMCs sont reconnues par leur marqueur majeur, l’antigène CD56. Cette reconnaissance sélective est réalisée par l’utilisation d’anticorps dirigés contre cet antigène. L’anticorps est artificiellement couplé aux billes magnétiques. Le mélange cellulaire est ensuite passé dans un champ magnétique qui va piéger les billes magnétiques et donc le couplage anticorps CD56-cellules NK. Après lavage des cellules dans du milieu complet frais, les cellules sont placées dans un incubateur à CO2 réglé à 37°C pendant environ 16 heures afin de permettre le détachement des billes magnétiques.
  • 9. 2- Sélection négative est basée sur le même principe, mais dans ce cas, ce sont tous les autres types cellulaires, autre que les cellules NK, Toutes ces cellules sont retenues dans le champ magnétique à l’exception des cellules NK qui sont recueillies librement. Les anticorps spécifiques utilisés dans ce cas sont essentiellement : • l’anticorps anti-CD3, marqueur sélectif de tous les lymphocytes T, • l’anticorps anti-CD4, lymphocytes T helper, les monocytes et les macrophages, • l’anticorps anti-CD14, monocytes, • l’anticorps anti-CD15 marqueur des neutrophiles et des éosinophiles,
  • 10. Stimulation des PBMC par des hématies parasitées par Plasmodium falciparum. Mesure de la prolifération des lymphocytes T, de la stimulation des sous populations, et activation des CPA par cytométrie en flux. Prélèvements Héparine sodium Ficoll PBMC Plasma Ajuster à 1.106 ¢/ml dans du RPMI-0 Répartition … 600µl pour 0,6.106 ¢ 6ml pour 6.106 ¢ Le plasma servira pour la mise en culture en système autologue… Centrifugati on pour mettre en culot Incubation avec le CFDA Re-centrifugation pour mettre en culot Ajouter 360µl de RPIM-0 + 240µl de plasma autologue Ajouter 3,6ml de RPIM-0 + 2,4ml de plasma autologue RBC PRBC6 puits avec 100µl/puit 3 puits avec 2ml/puit +100µl/puit de RBC ou PRBC + 2ml/puit de RBC ou PRBC …voir le protocole pour les plans de plaques… Préparation des suspensions de globules rouges de manière à avoir 1.106PRBC/ml Prélèvements Héparine sodium Ficoll PBMC Plasma Ajuster à 1.106 ¢/ml dans du RPMI-0 Répartition … 600µl pour 0,6.106 ¢ 6ml pour 6.106 ¢ Le plasma servira pour la mise en culture en système autologue… Centrifugati on pour mettre en culot Incubation avec le CFDA Re-centrifugation pour mettre en culot Ajouter 360µl de RPIM-0 + 240µl de plasma autologue Ajouter 3,6ml de RPIM-0 + 2,4ml de plasma autologue RBC PRBC6 puits avec 100µl/puit 3 puits avec 2ml/puit +100µl/puit de RBC ou PRBC + 2ml/puit de RBC ou PRBC …voir le protocole pour les plans de plaques… Préparation des suspensions de globules rouges de manière à avoir 1.106PRBC/ml 5
  • 11. Test de prolifération (CFDA) Phénotypages et stimulations cellulaires Stimulation… LyT α/β et γ/δ LyT Helper, Cytotox. et Reg. DC, MØ et LyB PBMC + RBC PBMC + PRBC PBMC PRBC PBMC PRBC monensin PBMC RBC monensin Prolifération… Ratio PRBC/RBC Profil… Th1/Th2 Test de prolifération (CFDA) Phénotypages et stimulations cellulaires Stimulation… LyT α/β et γ/δ LyT Helper, Cytotox. et Reg. DC, MØ et LyB PBMC + RBC PBMC + PRBC PBMC PRBC PBMC PRBC monensin PBMC RBC monensin Prolifération… Ratio PRBC/RBC Profil… Th1/Th2
  • 12. Intérêt Compréhension des mécanisme in vivo Relation hôte/parasite Essais vaccinaux
  • 13. GRAND MERCI A LA CULTURE IN VITRO QUI NOUS PERMET D’AVOIR UNE BANQUE CELLULAIRE ********* MERCI DE VOTRE AIMABLE ATTENTION ******* QUESTIONS
  • 14. Références Bibliographiques 1- http//www.ifmt.auf.org/IMG/pdf/IFMT MB1 Immunité anti-infectieuse.pdf 2- Olivier Silvie, Dominique Mazier, Eric Rubinstein et Claude Boucheix « CD81: une tétraspanine impliquée dans l’infection par Plasmodium ». M/S médecine sciences Volume 19, numéro 2, Février 2003 3- Pétour Pascal ; Mazier Dominique Isolement et identification de nouveaux épitopes exprimés en surface de l'hépatocyte infecté par des Plasmodies : modèle de la souris BALB/c infectée par Plasmodium yoelii (Isolation and identification of news epitopes expressed at the surface of the infected hepatocytes by Plasmodium spp : model of the BABL/c mice infected by Plasmodium yoelii) 1997, [Note(s) : , 173] (341 ref.) Travaux universitaires (Année de soutenance : 1997) (No : 97 PA06 6503) Université de Paris 06, Paris, FRANCE 4- Elie Mavoungou La cytolyse des érythrocytes au cours du paludisme: L’implication des cellules NK In European cytokine network vol. 14, N°3, pp. 134-142, 2003. 5- Olivier Domarle (Anonyme). Protocole de recherche de l’unité d’immunologie, Institut Pasteur de Madagascar.