Le document aborde les défis et les avancées dans le diagnostic de la maladie de Lyme, en mettant l'accent sur les tests sérologiques et les problèmes de réactivité croisée des antigènes. Il souligne l'importance des peptides spécifiques pour améliorer la sensibilité et la spécificité des diagnostics, tout en évoquant les méthodes d'analyse immunologique et l'évaluation des réponses des lymphocytes T. Enfin, il conclut que la sécrétion d'interféron-gamma pourrait être une alternative prometteuse pour détecter l'infection par Borrelia burgdorferi.

1. DIVULGATION DU CORPS PROFESSORAL/DE L’ANIMATEUR
• Membre du corps professoral :
• Liens avec des intérêts commerciaux :
• La cartographie épitopique présentée a été effectuée par
l’entreprise Biopeptides Corp. , et les droits de propriété
intellectuelle sont détenus par cette dernière.

2. DIVULGATION DU FINANCEMENT COMMERCIAL
• Possibilité de conflits d’intérêts :
• Raymond Dattwyler et Biopeptides Corp. ont reçu des subventions de
National Institutes Health (NIH).
• L’entreprise Bio-Rad possède une technologie brevetée qui a été
élaborée par Biopeptides Corp.
• L’entreprise Qiagen possède une technologie brevetée qui a été
élaborée par Biopeptides Corp.

3. DIAGNOSTICS EN LABORATOIRE DE LA MALADIE DE
LYME POUR LE PASSÉ, LE PRÉSENT ET LE FUTUR :
RAYMOND DATTWYLER, M.D.
PROFESSEUR DE MICROBIOLOGIE/IMMUNOLOGIE ET DE MÉDECINE
NEW YORK MEDICAL COLLEGE, À VALHALLA, NEW YORK (ÉTATS-UNIS)
PRÉSIDENT DE BIOPEPTIDES CORP.

4. DIAGNOSTIC EN LABORATOIRE
DE LA MALADIE DE LYME
1980 1990 2000 2010

5. Tests SÉROLOGIQUES
Cibles antigènes : sonicats de cellules entières Bb ou Bb
• Problèmes :
• Les bactéries entières contiennent bon nombre
d’épitopes qui sont communs parmi les autres espèces
de bactéries – « des épitopes non spécifiques ».
• Les Borrelia de culture peuvent perdre des antigènes
codés par un plasmide.
• Certains antigènes importants ne sont pas
exprimés in vitro.

6. CRITÈRESDU CDC
SÉROLOGIEENDEUXÉTAPES
Premier mois de l’infection :
Première étape : Anticorps IgG et/ou IgM dirigé contre le sonicat de cellule entière par
essai immuno-enzymatique (EIA) ou immunofluorescence des anticorps (IFA)
Deuxième étape : Transfert Western IgG et IgM si la première étape est positive ou
équivoque
2 bandes d’anticorps IgM sur 3 : 23-, 39- et 41-kDa
5 bandes d’anticorps IgG sur 10 : 18-, 23-, 28-, 30-, 39-, 41-, 45-, 58-, 66- et 93-kDa
Après le premier mois :
Première étape : Anticorps IgG dirigé contre le sonicat de cellule entière par essai
immuno-enzymatique (EIA) ou immunofluorescence des anticorps (IFA)
Deuxième étape : Transfert Western IgG si la première étape est positive ou équivoque
5 bandes d’anticorps IgG sur 10 : 18-, 23-, 28-, 30-, 39-, 41-, 45-, 58-, 66- et 93-kDa

7. CRITÈRES LIÉS AUX TRANSFERTS WESTERN
1. Les critères ont été élaborés à l’aide de Bb de culture.
2. À l’époque où ces critères ont été formulés, nombre
de ces antigènes n’étaient pas définis.
3. Les antigènes exprimés in vivo sont mal représentés.
7

8. SENSIBILITÉDESDEUXÉTAPESSTANDARD
• Maladie aiguë au stade précoce : 30 à 40 %
• Maladie en phase de convalescence au stade précoce : 70 %
• Infection neurologique et cardite au stade précoce
(aiguë disséminée) : 85 %
• Maladie au stade tardif : plus de 98 %

9. INFECTION DISSÉMINÉE AU STADE TARDIF CHEZ L’HUMAIN
PAR TRANSFERT WESTERN DE GEL EN 2D
Nowalk, A. J., R. D. Gilmore, Jr. et J. A. Carroll. 2006. Analyse sérologique des protéomes
des protéines associées à la membrane de Borrelia burgdorferi. Infect. Immun.
74:3864–3873.

10. ANTIGÈNES ASSOCIÉS AVEC LE TRANSFERT WESTERN
10
PROTÉINE MK Stade précoce Stade intermédiaire Stade tardif
P93 93 + +
Hsp90 90 +
p66* 66 +
OppA2 58 +
ErpB 58 +
BBK32 47 +
FtsZ 45 +
FlaB* 41 +
BmpA 39 +
BBO323* 30 +
OspF 26 + +
OspC 21 +
LA7 20 + +
ErpP 18 + +
DbpA 18 + +
RevA 18 +

11. RÉACTIVITÉ CROISÉE DES ANTIGÈNES
• La réactivité croisée est un enjeu considérable dans tout essai biologique
de sérodiagnostic, en particulier lors de l’utilisation de préparations
provenant d’organismes complets ou de protéines bien conservées.
• La flagelline de Borrelia génère des réponses positives chez plus de
40 % de personnes en bonne santé sans historique de maladie de
Lyme (Liang, FT, et al., J. Clin. Microbiol., décembre 1999, vol. 37,
no 12 3990-3996.)
• Un antigène de 60 kDa est séropositif chez plus de 16 % des témoins
en santé (Liang, FT, et al., J. Clin. Microbiol., décembre 1999, vol. 37,
no 12 3990-3996.)
• Souche homologue BBO323 avec des protéines de liaison de substrat
périplasmique de microorganismes Gram négatif.
• Les essais immuno-enzymatiques (ELISA) de sonicats de cellules
entières peuvent détecter les anticorps à des taux supérieurs à 90 %
dans des pays tropicaux exempts de la maladie de Lyme (Burkitt TR,
et al., J Infect Dis. (1997) 175 (2): 466-469.)

12. LES PROTÉINES CONTIENNENTDES RÉGIONS DE RÉACTIVITÉ CROISÉE
SEMBLABLES À D’AUTRES BACTÉRIES
LA FLAGELLINE DE LA PROTÉINE P41 DE B.BURGDORFERI
EST UN BONEXEMPLE

13. • P66 est un antigène proéminent
inclus dans la plupart des tests
sérologiques conventionnels de la
maladie de Lyme.
• Nous avons découvert une quantité
importante de liaison des anticorps à
6 peptides différents dans le sérum de
témoins en santé et malades.
• À ce sujet, nous constatons que la
bande p66 de la plupart des transferts
Western est positive quelle que soit la
source du sérum.
P66, une leçon de
réactivité croisée.

14. D’AUTRES ANTIGÈNES POSSÈDENT ÉGALEMENT DES
ÉPITOPES À RÉACTION CROISÉE
• Des peptides ont été générés à partir de séquences
d’épitopes OspC et de sérums de témoins en santé et
chez lesquels la maladie de Lyme a été dépistée.

15. AVANTAGES DES ÉPITOPES DE PEPTIDES
• Préservation de la spécificité par la sélection d’épitopes
propres à Borrelia spp., et élimination d’épitopes à
« réactivité croisée » présents chez d’autres espèces
bactériennes.
• Conceptuellement, ceci améliore la spécificité et la
sensibilité des tests sérologiques.

16. C6
• Le premier peptide approuvé par la Loi sur les aliments et drogue d’après l’essai
de sérodiagnostic.
• Un peptide conservé provenant de la région invariable 6 de la protéine VIsE.
• A donné de bons résultats comme test d’antigène seul; cependant, les résultats
n’étaient pas assez bons pour remplacer le paradigme à deux étapes.
• C6 ne se lie pas bien à IgM, il se lie principalement à IgG.
• La région IR6 de VlsE est plus variable que ce que l’on pensait initialement, et les
diagnostics basés sur les peptides sont extrêmement sensibles aux variances dans la
séquence AA.
• L’antigène VlsE n’est pas exprimé chez la tique (moins de 1 % des bactéries), c’est
pourquoi il doit être régulé à la hausse pour produire une immunité, ce qui limite son
utilité aux interventions très précoces.
• Malgré les inconvénients observés, cela démontre clairement l’utilité des
sérodiagnostics fondés sur les peptides.

17. CARTOGRAPHIE ÉPITOPIQUE de la protéine OppA2
Signorino G, Arnaboldi PM, Petzke MM, Dattwyler RJ. Identification d’épitopes linéaires de OppA2
comme marqueurs de sérodiagnostic pour la maladie de Lyme. Clin Vaccine Immunol.2014
May;21(5):704-11.
• Pour OppA2, de nombreuses séquences ont été déterminées; pour d’autres
protéines, seuls un ou deux épitopes ont été déterminés par protéine.
Tableau 1. Séquences de peptides contenant des épitopes immunodominants de OppA2.
Nom du peptide
Séquence d’acides aminés
OppA (11-25) IFFLTFLCCNNKERK
OppA (191-225) YGQNWTNPENMVTSGPFKLKERIPNEKIVFEKNNK
OppA (276-290) SDYYSSAVNAIYFYS
OppA (276-300) SDYYSSAVNAIYFYSFNTHIKPLD
OppA (286-300) IYFYSFNTHIKPLD
OppA (286-310) IYFYSFNTHIKPLDNVKIRKALTLA
OppA (356-375) LAEAGYPNGNGFPILKLKYN
OppA (381-400) KKICEFIQNQWKKNLNIDVE
OppA (491-505) APIYIYGNSYLFRND

18. • Chaque peptide a été testé dans
un groupe de 114 cas de la
maladie de Lyme au stade
précoce, de 44 témoins en santé,
de 30 témoins atteints de la
polyarthrite rhumatoïde et de 28
tests des anticorps réaginiques
positifs.
• Les seuils de positivité ont été
déterminés à plus de 3 ÉT par
rapport à la moyenne des témoins
en santé (positif) et à plus de 2 ÉT
par rapport à la moyenne des
témoins en santé (équivoque).
ANALYSE ELISA DE
OppA2

19. LEÇONS TIRÉES DE L’ÉLABORATION DES
TESTS SÉROLOGIQUES
• La détermination de nouvelles cibles peptidiques se poursuit afin
d’améliorer la spécificité et la sensibilité par rapport aux essais
immuno-enzymatiques (EIA) actuels de la première étape.
• Cependant, la sélection des antigènes doit être effectuée avec soin.
• Aucune « approche globale » n’est efficace pour la détermination des
épitopes.
• Chaque épitope provenant d’antigènes différents possède des
attributs différents.
• OspC1 se lie mieux à IgM qu’à IgG, DbpA4-DbpB6 ne fonctionne bien
qu’en tant que dipeptide, de nombreux épitopes de p66 ont une
réactivité croisée, p41 possède un épitope utile.

20. • La formation d’anticorps prend du temps.
• Les niveaux de IgG restent élevés pendant des années après
l’infection, les tests sérologiques ne peuvent distinguer une
nouvelle infection d’une exposition préalable.
• Les niveaux d’anticorps n’ont pas de corrélation avec la
réussite du traitement.
Les tests sérologiques présentent des
problèmes impossibles à surmonter

21. NOUVELLES APPROCHES EN MATIÈRE DE DIAGNOSTIC
EN LABORATOIRE
L’AVENIR?
• Métabolomique
• Analyse des transcriptomes
• Suivi de l’activité des lymphocytes T

22. RÉPONSE DES LYMPHOCYTES T
• Cinétique distincte des réponses des lymphocytes T
• Résolution suivante de l’infection :
• La fonction effectrice des lymphocytes T
s’estompe.
• Les nombres de lymphocytes T activés se
contractent.
• La libération de cytokines peut être utilisée comme
mesure indirecte de l’activation des lymphocytes T.

23. TEST DE LIBÉRATION DE CYTOKINES
• La plateforme technologique QuantiFERON
• Sang entier
• Incuber jusqu’au lendemain, prélever du plasma
• Essai d’immuno-absorption enzymatique IFN-γ
Sans objet Maladie de LymeMito

24. ANTIGÈNES CIBLES
• Les séquences pour chaque antigène ont
été évaluées par rapport aux bases de
données de protéines à l’aide du Basic
Local Alignment Search Tool (BLAST) de
NCBI.
• Des bibliothèques de peptides qui se
chevauchent ont été produites pour des
régions avec :
• moins de 50 % d’identité avec d’autres
protéines
et
• plus de 80 % d’identité parmi Borrellia spp.
• Ces données ont été générées à l’aide d’un
mélange de 33 peptides issus de OspC,
DbpB, p66 et FlaB.
Antigènes évalués pour la
réactivité des lymphocytes T :
• OspC
• DbpB
• p66
• FlaB
• CRASP2
• Bbk32
• BmpA
• OppA2
• LA-7
• FlilB
• Bdf2
• RecA

25. CARACTÉRISTIQUES DES PATIENTS
Sujets Âge médian
(intervalle)
Sexe (F/M) Durée
médiane des
symptômes
(intervalle)
Symptômes
d’un ou
plusieurs
érythèmes migrantsb
Erythema
migrans+a
(n=29)
58 (19-74) 9/20 5 j. (2-30) 23/6
céphalées (n=23)
raideur de la nuque (n=15)
myalgie (n=15)
fièvre (n=13)
fatigue (n=13)
arthralgie (n=10)
lymphadénopathie (n=1)
aucun (n=2)
a- lésion ronde de plus de 5 cm, souvent avec un dégagement central partiel
b- les symptômes se sont atténués après un traitement de 10 jours avec la doxycycline
• Le sang a été prélevé lors de la visite initiale (n=29), 2 mois après le traitement (n=27)
et 6 mois après le traitement (n=5).

26. SÉCRÉTION D’INTERFÉRON-GAMMA
• Des IFNγ ont été détectés chez 3,1 % (6 sur 192) des
témoins en santé et des cas d’anaplasmose.
Phase
aiguë
Phase de
convalescence
(2 mois)
Phase de
convalescence
(6 mois)
Positif a
20/29
(69,0 %)
IFNγ
(UI/ml)
1,46 ±
2,26
4/27
(15,3 %)
1/5
(20,0 %)
0,27 ±
0,59
0,13 ±
0,19
a- >3 ÉT (0,33 UI/ml) par rapport à la moyenne d’IFN γ produits dans le
sang de volontaires en santé ( n=187 ) et anaplasmose (n=5).

27. COMPARAISON AVEC LA SÉROLOGIE
QuantiFERON
ELISA
C6
ELISA
Transfert
Western
IFNγ (UI) IgM ou IgG IgM ou IgG
Phase aiguë
(n=29)
69,0 %
(20/29)
58,6 %
(17/29)
17,2 %
(5/29)
• Combinés, les analyses ELISA de C6 et de QuantiFERON ont déterminé
positivement 82,8 % (24/29) des patients atteints de la maladie de
Lyme en phase aiguë.
• L’ajout de peptides provenant d’autres antigènes peut augmenter la
sensibilité de l’essai biologique.

28. RÉSUMÉ
• La sécrétion d’IFNγ peut être utilisée pour détecter l’infection causée par
Borrelia burgdorferi.
• Elle exige de multiples peptides provenant de différentes protéines.
• La sécrétion d’IFNγ est réduite à la suite d’un traitement réussi aux
antibiotiques.
• Aucun patient ne s’est plaint de symptômes persistants à la suite du
traitement à la doxycycline.
• D’autres études garantiraient :
• des valeurs limites définies de façon plus critique;
• l’évaluation de l’inclusion d’autres antigènes;
• l’évaluation de la maladie de Lyme localisée par rapport à la maladie
disséminée;
• l’évaluation du stade tardif de la maladie de Lyme.

29. REMERCIEMENTS
• NIH NIAID pour le financement
• Biopeptides, Corp./NYMC
• Paul M. Arnaboldi, Ph. D.
• Mariya Sambir, maîtrise ès sciences
• NYMC
• Mary Petzke, Ph. D.
• Giacomo Signore, Ph. D.
• Gary Wormser, M.D.
• Gundersen-Lutheran, Wisc.
• Steven Callister, Ph. D.
• Dean Jobe, maîtrise ès sciences
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