Le document aborde la pathogenèse des lésions hépatiques induites par le VHC en se concentrant sur la modélisation animale. Il discute des différents modèles utilisés pour étudier ces pathologies, notamment l'infection chez les primates non-humains et les rongeurs, et analyse les mécanismes moléculaires impliqués dans la carcinogenèse hépatique. Les résultats mettent en évidence le rôle des protéines virales, la modulation du cycle cellulaire et la stéatose hépatique comme facteurs clés dans le développement de lésions hépatiques induites par le VHC.

1. PATHOGENÈSE DES LÉSIONS
HÉPATIQUES DU VHC :
MODÉLISATION ANIMALE
Hervé LERAT
INSERM U955
Département de Virologie Moléculaire et Immunologie
Molé
Physiopathologie et Thérapeutique des Hépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)
Thé Hé
Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.

2. Pathologies viro-induites:
contribution du virus?
Contexte d’un organe entier
dans un animal vivant.
Nécessité de développement de
modèles animaux

3. Modèles animaux pour l’étude des
pathologies induites par le VHC
Modèles d’infection
Primates non-humains
Chimpanzé
Ouistiti
Problème de disponibilité et de coût.

4. Modèles animaux pour l’étude des
pathologies induites par le VHC
Modèles d’infection
Rongeurs (“humanisés”)
uPA/SCID
Trimera
rat

5. Modèles d’infection (rongeurs)
Viremia Duration of infection
Rodent models Humanization Peak viremia
Copies/mL (Months)
Human hepatocyte
uPA/SCID 104 to 8x107 Up to 9 1 month
transplantation
Xenograft of human
Trimera mice 7x104 Around 1 18 days
liver tissues
Immunotolerization and
Rat transplantation of human 1-2x104 Up to 4 3 months
hepatoma cell line
Adapted from Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007
Techniquement très complexes à mettre en œuvre

6. Modèles animaux pour l’étude des
pathologies induites par le VHC
Modèles d’expression des protéines virales
Transgenèse murine
Classique
Conditionnelle (système Cre/Lox)
Avantages :
Facilité d’élevage, technique rodée
Expression chronique à long terme
Pas de réponse immune
Pas de réplication virale

7. The full-length HCV ORF transgenic
mouse model FL-N/35
NS4a
Albumin promoter core E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b FL-N
p7
SV40 PolyA
Genotype 1b
micro-injections
C57Bl6J x C3H/HeJ
Liver FL-N/35
DNA HCV + RNA HCV +
X C57BL6J X C57BL6J
Lerat et al., Gastroenterology 2002

8. The full-length HCV ORF transgenic
mouse model FL-N/35
NS4a
Albumin promoter core E1 E2 NS2 NS3 NS4b NS5a NS5b FL-N
p7
SV40 PolyA
Genotype 1b
micro-injections
C57Bl6J x C3H/HeJ
Carcinoma
Liver
Steatosis
DNA HCV + RNA HCV +
X C57BL6J X C57BL6J
+CCl4
Co-fibrogenic
Co-
Lerat et al., Gastroenterology 2002

9. Hepatocellular Carcinomas
1 cm
FL-N/35-171UNC
FL-N/35-170UNC
1 cm
A
1 cm FL-N/35-102CERFE
Lerat et al., Gastroenterology 2002.

10. Visualisation en IRM des CHC chez la souris VHC
Tumeur
(H. Lerat, A. Luciani et T. Décaens, données personnelles.)

11. CHC induits par le VHC:
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?

12. CHC viro-induits: mécanismes moléculaires?

13. Modulation du cycle cellulaire dans le foie des souris transgéniques
ARNm
Incorporation de BrdU Détection PCNA
Cyclin B1 MYC
9
7
mRNA (Fold increase)
5
3
1
Non TG HCV TG Non TG HCV TG Non TG HCV TG Non TG HCV TG
-> Les mécanismes restent à définir.
Lerat et al., Gastroenterology 2002.
Keasler, Virology 2006.
M. Higgs (données personnelles)

14. Inhibition de l’apoptose dans le foie des souris transgéniques
50
P<0.05
% apoptotic hepatocytes
+ 40 P<0.01
Fluorescence intensity
Hoechst
30
20
- 10
Non TG HCV TG
0
in vivo ex vivo
non TG
HCV TG
(Disson et al., Gastroenterology, 2004)

15. Inhibition de l’apoptose dans le foie des souris transgéniques
Activated
caspase 8
Bid-t
Bid- Bid
14 kD
Bid 1.2
24 kD
+
1
Bi d protein level (AU)
Bid-N
Bid- p<0.01
10 kD 0.8
Cytochrome C
0.6
Apoptosis
0.4
Bid
0.2
N=10 N=13
LIVER KIDNEY
HCV tg - + - + 0
WT HCV tg
Bid
GAPDH
(Disson et al., Gastroenterology, 2004)

16. Résumé : inhibition de la voie FAS dans le foie des souris VHC
FasL
Membrane cellulaire
Fas
VHC (NS5A)
calpaïne
mitochondrie
caspase 8 Bid
cytochrome C
caspase 3 caspase 9
CIDE-B
Etape vers le APOPTOSE CIDE-B
cancer VHC Annexin V
(NS2)
fragmentation ADN
HCV TG - +
Erdtmann et al., J Biol Chem 2003.

17. Diminution de l’expression de bid chez les patients infectés par le VHC
Patients #1 #2 #3
Tissus NT CHC NT CHC NT CHC
Bid (21 kD)
GAPDH
NT= tissu adjacent au CHC
(Simonin et al., Hepatology 2009)

18. Diminution de l’expression de bid chez les patients infectés par le VHC
3
Bid/GAPDH
2
1
*
0
VHC - + + - + +
Cirrhose - - + - - +
Tissus NT CHC
n 15 9 8 15 9 8
Simonin et al., Hepatology, 2009

19. Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes
(Disson et al., Gastroenterology, 2004)
Ad βGal
108 pfu/g
Day 3
D +3 Liver biopsy
(sacrifice)
D +21 Liver and spleen
removal
Day 21
β-gal histology
+ enzymatic assay
non TG HCV TG

20. Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes
(Disson et al., Gastroenterology, 2004)
Ad βGal 10+ 7 10+ 6
108 pfu/g
ßGAL activity in the spleen (RLU)
ßGAL activity in the liver (RLU)
10+ 6 10+ 5
D +3 Liver biopsy
p<0.05
(sacrifice)
D +21 Liver and spleen 10+ 5 10+ 4
N.S.
removal
β-gal histology
10+ 4 10+ 3
+ enzymatic assay +3 +21 +3 +21
LIVER SPLEEN

21. Production de ROS dans les souris VHC, implication sur la
carcinogenèse hépatique.
Electron transport
Complex (1) CORE
NS3-NS5A
DHE
Glutathion
Nox4
ROS
HCV-tg inflammation
Non tg
Surcharge en FER DNA damage
700
600
Relative ROS levels (%)
fibrosis
500
400
CHC
300
200
100
0
Non tg HCV tg
n=4 n=4
Age= 17 mo
(M. Higgs, H. Lerat, données personnelles)

22. Lésions de l’ADN – La famille GADD
GADD34 GADD153 GADD45α
GADD45α GADD45γ
GADD45γ
GADD45β
GADD45β
Senseurs de stress
G0
CyclinB1 M
G2 G1
Cdc2
GADD45
Lésions de
l’ADN Nucleotide excision repair
Q
S
P
Histone H3
P
Histone H1
Arrêt du cycle
P
Lamine cellulaire (G2/M)
Gadd45β
Gadd45β
La surexpression de GADD45 entraine un arrêt de la transition G2/M.

23. Indexe mitotique des hépatocytes VHC+
wt FL-N/35
NS
NS
+/- Gadd45β
+/- Gadd45β +/- UV-C 40
p = 0.0001
siRNA
30
% mitosis
20
10
Phos-
Phos-histone H3 (Ser 10)
(Ser
0
wt FL-N/35 wt FL-N/35 wt
UV-
UV-C + + +
Gadd45β siRNA
Gadd45β +
(Higgs, Lerat et al. Soumis)

24. Régulation épigénique du promoteur de GADD45b dans les
hépatocytes VHC+
p = 0.0014
wt FL-N/35
30 p = 0.0001
25 p = 0.0003
20
% mitosis
+/- 5-aza
+/- + UV-C
15
10
5
0
wt FL-N/35 FL-N/35 FL-N/35
Phos-
Phos-histone H3 (Ser 10)
(Ser UV-
UV-C + + + +
5-aza + +
Gadd45β siRNA +
(Higgs, Lerat et al. Soumis)

25. L’expression de GADD45b est diminuée dans le foie des patients
infectés par le VHC
HCV -
HBV -
HCV +
HBV +
Groupes de patients étudiés
NT NT T NT T NT T
T Gadd45β >
HCV+ Actin >
NT
120
T 100
Relative Gadd45β protein
HBV+
80 Non tumoral tissue
expression (%)
Tumoral tissue
NT 60
40
T
20
HBV- HCV-
0
HBV - HBV -
HBV + HCV + HBV + HCV +
HCV - HCV -
(Higgs, Lerat et al. Soumis)

26. Vers un mécanisme de la carcinogenèse hépatique viro-induite?
Expression VHC
Expression VHC
Chronicité infection
Chronicité infection
Inhibition
Inhibition
réponse immune
réponse immune
Diminution de
Diminution de
Surexpression des
Surexpression des protéines pro
protéines pro
cyclines et oncogènes
production ROS
production ROS
cyclines et oncogènes apoptotiques
apoptotiques
Multiplication
Multiplication Lésions ADN
Lésions ADN Inhibition apoptose
Inhibition apoptose
cellulaire
cellulaire
Réparation ADN
Réparation ADN
CANCER du FOIE
CANCER du FOIE

27. Stéatose induite par le VHC:
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?

28. Stéatose micro-vésiculaire
Non TG VHC TG
VHC TG VHC TG
Lerat et al., Gastroenterology 2002.

29. Stéatose micro-vésiculaire
coloration Oil Red O
p<0.001
25
20
n=12
% de l’aire total
12.5 ± 0.4
15
10
n=12 n=10
13 ± 0.8 14.4 ± 0.8
5
M
0
n=7
14.1 ± 0.3 F
HCV TG
NON TGM
analyse in silico

30. Stéatose viro-induite: mécanismes moléculaires?
HEPATOCELLULAR STEATOSIS
de novo TG TG secretion TG degradation Increased TG
synthesis default default (oxydation) serum uptake
? ?
?
?
VIRAL
ER Stress PROTEINS
?

31. Défaut d’exportation des triglycérides.
La sécrétion des VLDL hépatiques chez la souris à jeun a été mesurée par
l’augmentation des triglycérides plasmatiques (A et B) et de l’apolipoprotéine
B (C) après inhibition de la lipoprotéine lipase par le triton WR1339 (B et C).
1,2 14 6
A B C
12 5
1,0
Plasmatic ApoB (g/L)
Plasmatic TG (g/L)
Plasmatic TG (g/L)
10 4
0,8
8 3
0,6
6 2
0,4 4 1
WT HCV-tg WT HCV-tg WT HCV-tg
n 14 14 n 13 13 n 13 13

32. Inhibition de la « Microsomal Transfer Protein »
Activité MTP
500
450
pmoles/100µg/4h
400
350
300
250
200
150
WT HCV-tg

33. Stimulation de la lipogenèse
RT-qPCR
Citrate 9 ** p=0.02 **
WT
ATP-CL HCV-tg
ARNm (augmentation relative)
Acetyl-CoA
4
Lipogenèse
** p=0.02
ACC
* p=0.01 **
Malonyl-CoA
*
FAS
2
Acyl-CoAs
SCD1
0
TG
ACL ACC FAS EM SCD1
n 11 8 11 8 14 16 11 8 11 8

34. Stimulation de la lipogenèse
Western Blot
2.5
Citrate
* p=0.01 *
ATP-CL
2.0
Acetyl-CoA
FAS/GAPDH
Lipogenèse
ACC
1.5
Malonyl-CoA
FAS
1.0
Acyl-CoAs
SCD1
0.5
TG
WT HCV-tg
n 4 9

35. Régulation de la lipogenèse
SREBP1c SREBP1c
Domaine de transactivation Précurseur
(Noyau) (RE puis Golgi)
Citrate
ATP-CL
Acetyl-CoA
Lipogenèse
ACC
Malonyl-CoA
FAS
Acyl-CoAs
SCD1
TG

36. Régulation de la lipogenèse
SREBP1c SREBP1c
Domaine de transactivation Précurseur
(Noyau) (RE puis Golgi)
Citrate
ATP-CL
Acetyl-CoA
Western Blot
Lipogenèse
ACC
SREBP1c (clivé)
Malonyl-CoA
noyau
FAS Lamine A/C
Acyl-CoAs SREBP1c (précurseur)
microsomes
SCD1 Actine
TG WT HCV-tg

37. Régulation de la lipogenèse
SREBP1c SREBP1c
Domaine de transactivation Précurseur
(Noyau) (RE puis Golgi)
Citrate
ATP-CL
RT-qPCR
Acetyl-CoA
ARNm (augmentation relative)
Lipogenèse
4
ACC
3
Malonyl-CoA
2
FAS
1
Acyl-CoAs
SCD1 0
WT HCV-tg
TG n 14 16

38. Lipogenèse induite par le stress du RE?
SREBP1c SREBP1c
Domaine de transactivation Précurseur
(Noyau) (RE puis Golgi)
Citrate
ATP-CL
Stress RE
Acetyl-CoA RE
Lipogenèse
ACC PERK IRE-1
ATF6
Malonyl-CoA
P-eiF2α Epissage ARNm XBP1
FAS
Arrêt traduction Dégradation protéique
Acyl-CoAs
SCD1
TG

39. Lipogenèse induite par le stress du RE?
SREBP1c SREBP1c
Domaine de transactivation Précurseur
(Noyau) (RE puis Golgi)
Citrate
ATP-CL
Stress RE
Acetyl-CoA RE
Lipogenèse
ACC PERK IRE-1
ATF6
Malonyl-CoA
P-eiF2α Epissage ARNm XBP1
FAS
Arrêt traduction Dégradation protéique
Acyl-CoAs Western blot
4
SCD1
3 RT-PCR
eIF2-P/eIF2
2 ARNm XBP1
TG Non-épissé
1
Epissé
0 Non-Tg HCV Tg +
WT HCV-tg

40. Lipogenèse induite par le stress du RE?
SREBP1c SREBP1c
Domaine de transactivation Précurseur
(Noyau) (RE puis Golgi)
Citrate
ATP-CL
Stress RE
Acetyl-CoA RE
Lipogenèse
ACC IRE-1
PERK ATF6
Malonyl-CoA
P-eiF2α Epissage ARNm XBP1
FAS
Arrêt traduction Dégradation protéique
Acyl-CoAs
Western Blot
SCD1 3
Phospho-Perk / PERK
2
TG
1
0
Phospho-Perk
4 9

41. Lipogenèse induite par le stress du RE?
SREBP1c SREBP1c
Domaine de transactivation Précurseur
(Noyau) (RE puis Golgi)
Citrate
ATP-CL
Stress RE
Acetyl-CoA RE
Lipogenèse
ACC PERK IRE-1
ATF6
Malonyl-CoA
P-eiF2α Epissage ARNm XBP1
FAS
Arrêt traduction Dégradation protéique
Acyl-CoAs
RT-QPCR
SCD1
ARNm (augmenation relative)
12
WT
HCV-tg
6
TG
4
2
0
GRP78 EDEM PDI CHOP TRB3
n 16 15 11 8 7 4 7 4 15 18

42. Résumé
SREBP1c SREBP1c =
Domaine de transactivation Précurseur
(Noyau) (RE puis Golgi)
Citrate
ATP-CL
Stress RE
Acetyl-CoA RE
Lipogenèse
ACC = PERK IRE-1
ATF6
Malonyl-CoA
P-eiF2α Epissage ARNm XBP1
FAS
Arrêt traduction Dégradation protéique
Acyl-CoAs
SCD1
TG STEATOSE
Accumulation TG intracellulaires
HEPATIQUE
ApoB
MTP VLDL
Exportation TG

43. Towards mechanisms for HCV-induced steatosis?
HEPATOCELLULAR STEATOSIS
de novo TG TG secretion TG degradation Increased TG
synthesis default default (oxydation) serum uptake
YES ?
YES
?
VIRAL
ER Stress PROTEINS
NO

44. Fibrose induite par le VHC?
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?

45. Stellate cell activation
and absence of fibre deposition in HCV mice
Non-Tg HCV-Tg
Non Tg
HCV-Tg
anti-αSMA antibody
Picrosirius red staining

46. Enhanced fibre deposition in CCl4-treated HCV mice
Non Tg Non Tg + CCl4 HCV-Tg + CCl4

47. Quantification of fibre deposition
Picrosirius Red Staining
Non-Tg + CCl4
Non- Tg + CCl4
P=0.0036*
3,0
2,5
Area of fibers (%)
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Non-Tg Tg Non-Tg Tg
n 5 5 13 17
- CCl4 + CCl4
in silico Analysis
* = Mann Whitney test

48. Conclusions
Modèle reproduisant les principales pathologies induites par le
VHC
Niveau d’expression similaire à l’infection chronique chez l’homme
Absence de réponse immunitaire (pas d’inflammation ni de cirrhose)
La cirrhose n’est pas un pré requis au développement de CHC :
en accord avec données cliniques (méta-analyse, Maisonneuve
2009)
Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines
virales en absence de cirrhose.
Inhibition de l’apoptose (voie FAS)
Inhibition de l’expression du suppresseur de tumeur GADD45b
Inhibition de la sécretion des VLDL (MTP)
Stimulation de la lipogenèse
Action co-fibrogène