Methodes experimentales en_immunologie

Méthodes expérimentales en immunologie
1‐ Techniques de phénotypage
2‐ Analyse fonctionnelle in vitro
3‐ Modèles de souris
Marie‐Alix Poul
Institut de recherche en cancérologie, Montpellier
marie‐alix.poul‐pearson@univ‐montp2.fr
FMBS215

Informations données par la cytométrie en flux sur une
cellule
Informations données par la cytométrie en flux sur une
cellulecellulecellule
taille relative (Forward Scatter ‐ FSC)
granularité relative ou complexité interne (Side
S tt SSC)Scatter ‐ SSC)
intensité relative de fluorescenceintensité relative de fluorescence
(FL1, FL2, FL3 et FL4 voire FL5, FL6, .et plus
encore): marquage anticorps (ou sonde
biochimique)q )

Exemple d’analyse: sang humain hémolysé:
Diagramme en 2 dimensions ou dotblot: 1 cellule = 1 point
té)
1000
Neutrophiles
nularit
800
r(gran
600
Monocytes
Scatter
00400
Lymphocytes
SideS
020
F d Li ht S tt
0 200 400 600 800 1000
Right Angle Light Detector
--> fonction de la complexité cellulaire
Forward Light Scatter
(taille)
Forward Light Detector
--> fonction de la taille de la
cellule
Lumière
Incidente

Analyse cytométrie en fluxAnalyse cytométrie en fluxAnalyse cytométrie en fluxAnalyse cytométrie en flux
• DotBlot (graphe en 2 dimensions)
• Histogramme (1 seul marquage représenté, MFI:
intensité moyenne de fluorescence)intensité moyenne de fluorescence)
• Multimarquages
• Marquage intracellulaire
(perméabilisation/fixation des cellules)(perméabilisation/fixation des cellules)
• Technique des « tétramères »Technique des tétramères

Détection de T spécifiques:
d é è d
Détection de T spécifiques:
d é è d
p q
Principe des tétramères‐MHC peptide
p q
Principe des tétramères‐MHC peptide
•Production de molécule MHC classe I ou 2
biotinylée chez E. coliy
•Dénaturation
•Renaturation en présence de peptide
•Tétramérisation par ajout de streptavidineTétramérisation par ajout de streptavidine
(couplée à un fluorochrome) => forte affinité
« fonctionnelle »
E Mi é id d’ é T CD8Ex: Mise en évidence d’une réponse T CD8
spécifique du cytomégalovirus chez un
patient HLA‐A2
Préparation des PBMC (peripheral blood
mononuclear cells) par gradient de Ficoll
Co‐marquage anticorps anti‐CD8/tétramère q g p
de molécule HLA‐A2‐peptide CMV)

Détection/purification des iNKT
/
Détection/purification des iNKT
/
tétramère de CD1d / α‐Galactosyl‐Ceramide
/p
tétramère de CD1d / α‐GalCer
/p
tétramère de CD1d / α‐GalCer
iNKT
T i lT conventionnelsautres
souris

stratégies de tristratégies de tri
• Cytomètre associé à un système de tri
L i i di bl d é i d l i l èLong mais indispensable pour des séparations sur de multiples paramètres,
possibilité de tri sur un marqueur biochimique. Possibilité d’analyse couplée au tri
de 70 000 cellules/s.
• Séparation par phase solide
(fond en plastique des boîtes de Pétri ou de culture cellulaire, billes de taille et de nature diverse )
– Les cellules sont retenues soit par adhérence spontanée, soit par affinité par
l’intermédiaire d’anticorps monoclonaux ou de lectines.
– « sélection positive » : population d’intérêt retenue par la phase solide
– « sélection négative » : population non retenue ( séparation plus « neutre »
fonctionnellement)
Plus simple, moins couteux, pureté inférieure au tri par cytométrie, pas toujours
applicable

Technique MACS (« Magnetic activated cell sorting ») Technique MACS (« Magnetic activated cell sorting »)
Billes d’oxyde de fer et de polysaccharide, diamètre de 50 nm y p y
couplées à des anticorps
 Colonne de séparation magnétique placée dans un aimant de
très forte puissance.
Le tri est simple, rapide, pureté 50> > 95%, rendement > 90%, tri
rapide de 109 cellules (1 étape; 10 min.). Présence des billes
compatible avec un tri ultérieur en cytométrie de flux.
Ex: Tri négatif: élimination des cellules T dans le cadre des
ll ff d ll ( l lé à tiallogreffes de moelle (sur colonne couplée à un anticorps
monoclonal pan T.

Combinaison tri magnétique/Cytométrie pour lesCombinaison tri magnétique/Cytométrie pour lesCombinaison tri magnétique/Cytométrie pour les
populations rares
Combinaison tri magnétique/Cytométrie pour les
populations rares
Trier à partir de109 cellules totales, une sous‐population qui représente 0,5 %
d l ll l ( 6 ll l à b )de la suspension cellulaire (soit 5,106 cellules à obtenir) :
Enrichissement; moins de 10 minutes de tri avec l’Automacs pour avoir 107
cellules, pures à 50 %, puis 30 minutes pour amener cette pureté à 98 % par
cytométrie en flux sur un trieur à haute vitesse (70 000 cellules).
=> Obtention en 40 min. de 5,106 cellules de la population cible pure à 98 % à
partir d’une population où elle est peu représentée (0,5 %).
Un cytomètre très rapide (70.000 cellules/seconde) demanderait tout de
même environ ........ h de travail...

Stratégies de tri des Tregs pour amplification ex vivoStratégies de tri des Tregs pour amplification ex vivoStratégies de tri des Tregs pour amplification ex vivoStratégies de tri des Tregs pour amplification ex vivo
Tri magnétique des CD4 puis Tri par cytométrie
CD4+, CD127‐, CD25high
7
, ,
CD12
CD127CD4
CD4+, CD45RA+, CD25high

Histochimie: Tissue micro‐array‐TAMHistochimie: Tissue micro‐array‐TAMHistochimie: Tissue micro‐array‐TAMHistochimie: Tissue micro‐array‐TAM
• Tissue micro array TMA: immunohistochimie à haut débit; fragments
(carottage) de tissus d’environ 0,6 mm de diamètre obtenus de tissus
inclus en paraffine, disposition dans un bloc de paraffine en espacement
réguliersréguliers
• Coupes/microtome, montage sur lame pour analyse

Détection de T mémoires CD45R0 dans des biopsies
Biopsies de patients diagnostiqués avec un cancer colorectal de stade I et II (HEGP)Biopsies de patients diagnostiqués avec un cancer colorectal de stade I et II (HEGP)

Analyse des répertoires BcR ou TcRAnalyse des répertoires BcR ou TcRy py p
Amplification PCR
- amorce V spécifique/amorce C spécifique
Electrophorèse capillaireExtraction ARN
- précurseurs nucléotidiques fluorescents
Profil gaussien;
répertoire
poyclonalp y
Amplification d’unp
clone

Répertoire anti‐Flu1 Répertoire anti‐Flu1 pp
... we expand CD4+ T cells from the influenza‐specific memory pool of two HLA‐DR1+
donors (known responders to peptide HA305−320). Ten‐day cultures of 106 peripheral
blood mononuclear cells (PBMCs) with the peptides Flu1 gave ≥5×104 CD4+ HLA‐
DR1/HA305−320 tetramer‐positive cells. We investigated TCR usage by the amplified
populations (FLu1) to establish the repertoire deployed against Flu1 peptide....p p ( ) p p y g p p
N b i di h % f T ll i h TRBVNumbers indicate the % of T cells with TRBV usage

Fl t C ll B diFl t C ll B diFluorescent Cell Bar codingFluorescent Cell Bar coding
Code barre fluorescent
‐ Multi marquage et analyse dans un seul
tube de plusieurs populations:tube de plusieurs populations:
‐Comparaison normalisée des intensités
de signaux
Si li ité idité
Nature Methods 3, 361 ‐ 368 (2006)
‐Simplicité, rapidité

Fl t C ll B diFl t C ll B diFluorescent Cell Bar coding Fluorescent Cell Bar coding
Analyse dans un même tube de plusieurs populations (marquées avec un code barre
d’intensité variable selon le traitement)
C i d i t ité d i d i d h h STAT1 t h h STAT6
Nature Methods 3, 361 ‐ 368 (2006)
Comparaison des intensités de signaux de signaux de phospho‐STAT1 et phospho‐STAT6

Production de cytokinesProduction de cytokines
D d ki d d l• Dosage de cytokines dans un surnageant de culture:
– ELISA
– Cytometric Beads Array (dosage de plusieurs cytokines
possible: analyse multiple)p y p )
• Mesure du nombre de cellules produisant un type de• Mesure du nombre de cellules produisant un type de
cytokines
– ELISPOT
– Marquage intracellulaire de cytokines/FACS (possibilité de
détecter plusieurs cytokines à la fois)

Cytometric Beads Array ImmunoassayCytometric Beads Array Immunoassay
Lecture possible de 100 analytes à la fois

Technique ELISPOT:« Enzyme‐linked immunospot »Technique ELISPOT:« Enzyme‐linked immunospot »
1983, à l’origine, utilisée pour l’activation des cellules B (mesure de la
sécrétion des Ig), en 1996, adaptée pour l’analyse de l’activation des
lymphocytes T.
Détecter et dénombrer les cellules T activés chez un patient, en détectant la
sécrétion de cytokines (l’INFγ notamment).

Caractérisation fonctionnelle d’épitopes T: ELISPOTCaractérisation fonctionnelle d’épitopes T: ELISPOT
Recherche d’une réponse T anti-Ep-CAM:
nombre fixe de PBL d'un patient HLA*0201 atteint d’un colo-
carcinome incubés avec des
Ep-184
(ILYENNVIT)
+ peptides issus d’Ep-CAM
(ILYENNVIT)
4
Ep-184b
(ILYENNVITI)( )
80
Milieu
00
PHA

P lif ti /di i i ll l i / t ll l iP lif ti /di i i ll l i / t ll l iProliferation/division cellulaire/mort cellulaire
(apoptose)
Proliferation/division cellulaire/mort cellulaire
(apoptose)
• Cytometrie de flux:
iodure de propidium (cellules mortes répartition dans les phases du cycle) 7‐AADiodure de propidium (cellules mortes, répartition dans les phases du cycle), 7‐AAD
BrdU, EdU: cellules en phase S
CFSE; carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester: colorant fluorescent permettant de suivre
la division des cellules (diminution des intensités de fluorescence selon les divisions), in vitro
t i i (i j ti i élè t)et in vivo (injection puis prélèvement).
Annexin‐V: affinité pour la phosphatidyl serine , externalisée pendant l’apoptose
• Microscopie: DAPI Hoechsht• Microscopie: DAPI, Hoechsht
• Thymidine tritiée ou BrdU: quantification de l’incorporation dans l’ADN au cours de
la phase Sla phase S

Fonctions effectricesFonctions effectrices
• Cytotoxicité (NK, CTL, NKT): mesure de la
di ti ité é t d l t dradioactivité présente dans le surnageant de
cellules cibles préalablement chargées en 51Crp g
• Méthodes cytométriques équivalentes
• Réponse anticorps: ELISARéponse anticorps: ELISA

Modèles de souris humaniséesModèles de souris humaniséesModèles de souris humaniséesModèles de souris humanisées

Souris immunodéficientesSouris immunodéficientes
pour la reconstitution d’un SI humainpour la reconstitution d’un SI humain
• Souris nude; sans thymus: pas de LT thymodépendants
• Souris SCID (severe combined immunodeficiency, prkdc‐/‐): pas de B et de T ( y, p / ) p
matures, mais des NK
• Souris NOD: diabète, anomalie IFN, anomalie activité NK
• Souris NOD‐SCID: absence de B, T et anomalie activité de NK.
• Souris beige (bg): anomalie des macrophages et neutrophiles, anomalie NK et
CTLCTL
• Souris RAG‐/‐: (recombinaisons activating genes) absence de T et B matures
So ris NSG NOD/SCID IL2R / (2004) absen e de B T et NK• Souris NSG: NOD/SCID‐IL2R‐/‐(2004) absence de B, T et NK.
• Souris BRG: BALB/C, RAGR2‐/‐,IL2R‐/‐ (2005): absence de B, T et NK.

Protocole pour l’étude de pathologies infectieuses Protocole pour l’étude de pathologies infectieuses
chez la souris humaniséechez la souris humanisée

Différences SI homme/sourisDifférences SI homme/sourisDifférences SI homme/sourisDifférences SI homme/souris
Mestas J. et al. 2005

Différences SI homme/sourisDifférences SI homme/sourisDifférences SI homme/sourisDifférences SI homme/souris
• La souris est un modèle pour étudier les réponses
immunitaires et l’immunopathologie de tester desimmunitaires et l immunopathologie, de tester des
médicaments mais pas forcément transposable à
l’hl’homme
• Les souris à lignée hématopoïétique g p q
humaine permettent d’étudier le SI humain et ses
interactionsinteractions
– avec des virus infectant les cellules immunitaires à tropime
strictement humainstrictement humain
– vis à vis de tumeurs humaines

Démarche expérimentale et analyse d’articleDémarche expérimentale et analyse d’article
Marie‐Alix Poul
Institut de recherche en cancérologie, Montpellier
marie‐alix.poul‐pearson@univ‐montp2.fr
FMBS215

Démarche expérimentale canoniqueDémarche expérimentale canoniqueDémarche expérimentale canoniqueDémarche expérimentale canonique
Question dans un contexte:
Est‐ce que l’interaction de la protéine A avec B est impliquée
dans le processus P?
Synthèse des conclusions
Questions ciblées:
Est‐ce que A interagit avec B?
y
q g
Est‐ce que A est impliquée dans le processus P?
Est‐ce que B est impliquée dans le processus P?
Est‐ce que le processus P est affecté si on abolit l’interaction
t A t B?
Conclusions pour chaque
question ciblée
entre A et B?
P h ti ibléPour chaque question ciblée:
Choix d’une stratégie expérimentale permettant de répondre:
Ex: Est‐ce que A interagit avec B?
Interaction de 2 protéines recombinantes in vitro?
Pour chaque expérience:
1) réalisation, 2) description
)
Interaction de 2 protéines recombinantes in vitro?
Interaction in vivo (co‐immunoprécipitation, double hybride...)?
Est‐ce que des mutations dans le gène A peuvent compenser
des mutations dans le gène B?
3) interprétation

Le choix de l’articleLe choix de l’articleLe choix de l articleLe choix de l article
Site PubMEd: http://www ncbi nlm nih gov/pubmed
Titre
Site PubMEd: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
Titre
Auteurs et nom du(des) laboratoire(s)
lé (k d )Mots clés (keywords)
Résumé (abstract)
Introduction
Résultats Tableaux (tables) et figures
Discussion
Matériel et Méthodes
Autres items variables
Données supplémentaires disponibles en ligne (supplementary information ou supplemental data)Données supplémentaires disponibles en ligne (supplementary information ou supplemental data)

Le facteur d’impact d’un articleLe facteur d’impact d’un articleLe facteur d impact d un articleLe facteur d impact d un article
Il d t d l’i t d l té i tifi d’ ( tIl rend compte de l’impact dans la communauté scientifique d’un revue (et
attention, en aucun cas d’un article).
Calcul :
Soit IFn(R) le coefficient d’impact d’une revue « R » (ou « impact factor ») de l’année n.( ) p ( p )
Nombre de citations année n‐2+ année n‐1
IF année n d’une revue:
Nombre d’articles publiés année n‐2 + année n‐1
IF année n d’une revue:
d d b d l él é l lcorrespond donc un nombre moyen de citations court terme. Plus est élevé, plus les
articles publiés par la revue considérée sont cités (à court terme).

50%
d jdes journaux
d’immunologie ont
un facteur d’impact
supérieur à 3supérieur à 3

Etape de l’analyse d’articleEtape de l’analyse d’articleEtape de l analyse d articleEtape de l analyse d article
1) Compréhension
nécessité d’informations complémentaires
2) Analyse critique
3) Restitution

1‐Phase de compréhension de l’article1‐Phase de compréhension de l’article1‐Phase de compréhension de l article1‐Phase de compréhension de l article
C d l dé h l i d dComprendre la démarche et le point de vue des auteurs
Comprendre la problématiquep p q
Comprendre la démarche expérimentale
Comprendre les résultats de chaque expérience
C d l i t ét ti d tComprendre les interprétations des auteurs
Faire une synthèse

1‐1‐ Comprendre la problématique :
Les objectifs :
‐ identifier la (les) question(s) posée(s)
‐ connaître le contexte : qu’est‐ce qui est connu sur le sujet au moment deconnaître le contexte : qu est ce qui est connu sur le sujet au moment de
la publication ?
‐ identifier les principales conclusions
Les sources d’information :
dans l’article : Titre, résumé, introduction, parfois le début de la discussion
h h l dChercher un article de revue
Chercher un autre article de recherche
Choisir un autre article si la question q
posée ne vous paraît pas intéressante
ou pertinente

1‐2‐ Comprendre la démarche expérimentale :
Les objectifsLes objectifs :
pour chaque méthode employée,
connaître le principe (c.a.d. les grandes étapes du protocole),
comprendre sa finalité, si possible, s’interroger sur ses limites
dans l’article : Matériel et méthodes, résultats
vos cours
certains ouvragescertains ouvrages
articles de recherche cités
articles de la série des Methods in…

1‐3‐ Comprendre les résultats de chaque expérience :
Les objectifs : pour chaque figure ou tableau de résultat présenté
‐ identifier les « témoins » et analyser les résultats leur
correspondantcorrespondant,
‐ identifier les « essais » et analyser les résultats leur correspondant,
‐ comprendre les conclusions tirées de l’expérience par les auteurs.
dans l’article uniquement : Matériel Méthodes, Résultats
‐ Distinguer témoins positif et négatif
‐Distinguer témoin positif (négatif) biologique ou témoin positif g p ( g ) g q p
(négatif) d’analyse.
‐Repérer la significativité des résultats

1‐Phase de compréhension de l’article1‐Phase de compréhension de l’article
1‐4‐ Comprendre les interprétations formulées par les auteurs :
1‐Phase de compréhension de l article1‐Phase de compréhension de l article
L’objectif: expérience par expérience, comprendre les interprétations proposées par les
auteurs.auteurs.
Dans l’article uniquement : partie RésultatsDans l article uniquement : partie Résultats.
1 5 Eff hè1‐5‐ Effectuer une synthèse :
L’objectif :
Recenser les différentes conclusions, et s’efforcer de les rassembler
Hiérarchiser les conclusions.
dans l’article uniquement : Résultats, Discussion, Titre, Résumé

2‐Phase d’analyse critique2‐Phase d’analyse critique
« procéder à une analyse critique » signifie « s’interroger »
2‐Phase d analyse critique2‐Phase d analyse critique
procéder à une analyse critique signifie s interroger
1 Questionnement méthodologique
Pour chaque expérience décrite dans l’article :
‐La stratégie expérimentale utilisée permet‐elle de bien répondre à
l ti é ?la question posée ?
‐ Les témoins sont‐ils selon vous suffisants ?
‐Les témoins donnent‐ils bien les résultats attendus ?
2‐ Questionnement sur l’analyse des résultats par les auteurs
Pour chaque expérience décrite dans l’article :
‐Les résultats obtenus vous paraissent‐ils convaincants ?
‐Êtes‐vous convaincu par les interprétations proposées ?Êtes vous convaincu par les interprétations proposées ?

2‐Phase d’analyse critique2‐Phase d’analyse critique
3‐ Questionnement sur les conclusions formulées par les auteurs
2‐Phase d analyse critique2‐Phase d analyse critique
3 Questionnement sur les conclusions formulées par les auteurs
‐Les différentes expériences vous paraissent‐elles cohérentes ou
voyez vous des contradictionsvoyez‐vous des contradictions
‐ Les conclusions tirées sont‐elles cohérentes avec les données de la
litté t d t i ?littérature dont vous avez connaissance ?
4‐Questionnement sur les perspectives ouvertes par l’article
‐ Quelle stratégie expérimentale pourriez‐vous proposer pour
confirmer ou infirmer les conclusions importantes de l’article ?p
‐ Quelle « nouvelle » question suscitent les conclusions de l’article ?

3‐ Restitution (présentation orale)3‐ Restitution (présentation orale)3‐ Restitution (présentation orale)3‐ Restitution (présentation orale)
1‐ Situer la problématique (5 min max)
‐ Donner les connaissances (contemporaines de la publication) essentielles la ( p p )
compréhension (il faut être concis) ;
‐ Formuler de manière explicite la(les) question(s) posée(s) par l’article.
2‐ Présenter et interpréter des résultats choisis
Faut il présenter tous les résultats? Ce n’est pas obligatoire et c’est rarementFaut‐il présenter tous les résultats? Ce n est pas obligatoire, et c est rarement
possible dans le temps qui vous est imparti. Cela implique :
‐ de choisir judicieusement les expériences que vous allez présenter ;
d’ê é i bl d é d à d i‐ d’être néanmoins capable de répondre à des questions concernant
les expériences que vous n’avez pas présentées.
Faut‐il présenter les résultats dans l’ordre de l’article ? Ce n’est pas
obligatoire, il est parfois plus facile de présenter les données dans un
ordre différent de celui de la publication.p

Comment présenter une expérience (et donc d’uneComment présenter une expérience (et donc d’uneComment présenter une expérience (et donc d une
figure)
Comment présenter une expérience (et donc d une
figure)
1‐ Indiquer précisément la question posée.
2‐ Présenter la méthode expérimentale utilisée pour répondre à la question. Si
nécessaire, élaborer un schéma présentant son principe.
3‐ Projeter le résultat de l’expérience (tableau ou figure) ; il doit être accompagné :
‐ d’un titre (qui ne doit pas donner la conclusion de l’expérience) mais faire référence à la
t té i é i t l tili éstratégie expérimentale utilisée ;
‐ d’une légende. Si la légende de l’article est trop sommaire ou difficile à comprendre sur
la publication ne pas hésiter à refaire une légende didactiquela publication, ne pas hésiter à refaire une légende didactique.
4‐ Décrire les résultats obtenus sans les interpréter.
5 C l é l b l é i5‐ Commenter les résultats obtenus pour les témoins.
6‐ Présenter les interprétations des auteurs.
7‐ Effectuer une analyse critique des résultats et de leurs interprétations.

Exemple 1:Exemple 1:Exemple 1:Exemple 1:

Exemple 2:Exemple 2:Exemple 2: Exemple 2:
Impression des 4 premières pages

2015
FMBS215 Immunopathologie 2014-15 première série d'articles
date
présentation
intervenant
superviseur Etudiants
article 1 A germinal center–independent
pathway generates unswitched Justin J J Exp Med Vol 209pathway generates unswitched
memory B cells early in the primary
response
Justin J.
Taylor, et al.
J. Exp. Med. Vol. 209
No. 3 597-606, 2012
12-févr LG/MAP
article 2 Selective depletion of Foxp3+
regulatory T cells induces a scurfy-like Lahl K et al.
J exp MedVol. 204, No.
1 January 22 2007
19-févr LG/MAPg y y
disease
1, January 22, 2007
article 3 Sodium Chloride Drives Autoimmune
Disease by the Induction
of Pathogenic Th17 Cells
Markus
Kleinewietfeld
Nature. 2013 April 25;
496(7446): 518–522.
19-févr TV
article 4
Down-Regulation of Interferon
Signature in Systemic Lupus
Erythematosus Patients by Active
Immunization With Interferon –Kinoid
Bernard R.
Lauwerys,
ARTHRITIS &
RHEUMATISM, Vol. 65,
No. 2, February 2013,
pp 447–456
26-févr TV
Immunization With Interferon Kinoid pp 447 456
article 5 Expression Profiles of MYC Protein
and MYC Gene Rearrangement in
Lymphomas
Karen M.
Chisholm,
Am J Surg Pathol
Volume 00, Number 00,
’’ 2015
05-mars CR
article 6 Exhaustion of bacteria-specific CD4 Ta c e 6 Exhaustion of bacteria specific CD4 T
cells and microbial translocation in
common variable immunodeficiency
disorders
Perreau, M
J. Exp. Med. 2014 Vol.
211 No. 10 2033-2045
19-mars PC
article 7
T helper 17 cells play a critical Seon Hee
5664–5669 | PNAS |
A il 15 2014 | l 111 | 19 MAP
T helper 17 cells play a critical
pathogenic role in lung cancer
Seon Hee
Chang
April 15, 2014 | vol. 111 |
no. 15
19-mars MAP
article 8 Gut Microbiota Elicits a Protective
Immune Response
against Malaria Transmission
Bahtiyar
Yilmaz,
Cell 159, 1277–1289,
December 4, 2014
26-mars PC
against Malaria Transmission
, ,
article 9
Functional expression cloning
identifies COX-2 as a suppressor of
antigen specific cancer immunity Göbel C
Cell Death and Disease(
2014) 5, e1568;
doi:10.1038/cddis.2014.
531
02-avr MAP
antigen-specific cancer immunity Göbel-C 531
article 10
Changes in antigen-specific T-cell
number and function during oral
desensitization in cow ’ s milk allergy
MucosalImmunology |
VOLUME 5 NUMBER 3
09-avr FC

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