Cours de techniques d'analyse

2020
Mme Hamini Faiza
Université Ammar Thelidji
Laghouat
01/01/2020
Techniques d’analyse

1
Licence agroalimentaire
Semestre 6
Unité d’enseignement Fondamentale 1 (UEF 3.2.1)
Crédits : 6
Coefficient : 3
VHS : 67h30 (3h C et 1h30 TP)
Objectifs de l’enseignement
La matière vise à développer aux étudiants les concepts des méthodes instrumentalisées
impliquées dans le contrôle alimentaire. Cet enseignement repose sur 3 aspects :
1. Théories succinctes de la méthode
2. Description et fonctionnement de l’appareillage
3. Interprétation des résultats
Les méthodes instrumentales d’analyse étant nombreuses, il sera développé dans le cadre
de ce cours celles qui sont très utilisées dans les industries agro-alimentaires.
Connaissances préalables recommandées
Chimie, Physique et optique, Instrumentation…etc.
Mode d’évaluation : (type d’évaluation et pondération)
Compte rendu et Examen semestriel

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Contenu de la matière
Introduction
Chapitre 1 : Rappel des notions élémentaires
1. Généralités sur les méthodes d’analyse
1.1. Analyses immédiates
1.2. Classification des analyses
1.3. Choix de la méthode
1.4. Procédures de contrôle de la qualité
2. Généralités sur les bonnes pratiques au laboratoire
2.1. Mesures organisationnelles
2.2. Produits
2.3. Matériels
2.4. Opérations classiques
2.5. Locaux
2.6. Comportemental
3. Généralités sur les solutions
3.1. Définitions (soluté, solvant, concentrations)
3.2. Unités de concentration
4. Méthodes de préparations des solutions
4.1. Méthode par pesée
4.2. Méthode par dilution
Chapitre 2 : Méthodes physico-chimiques et chimiques d’analyses
A. Méthodes physico-chimiques
1. pH-métrie
2. Conductimétrie
3. Polarographie
B. Méthodes chimiques
1. Gravimétrie
2. Volumétrie
Chapitre 3 : Méthodes Physiques d’analyses
1. Méthodes spectrophotométriques : UV- Visible
2. Méthodes chromatographiques : Couche mince, CPG et HPLC.
3. Electrophorèse
4. Emission à flamme et absorption atomique
5. Réfractométrie
6. Polarimétrie

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Introduction
A l’heure de la mondialisation et face aux récents scandales de contamination
alimentaire ou de contrefaçon, l’eau, les produits alimentaires et leurs ingrédients (dont les
produits agricoles) sont devenus suspects, pouvant provenir de producteurs et de fabricants de
différentes régions du monde. Les pouvoirs publics ont réagi en mettant en place des
réglementations pour la transparence de l’étiquetage. Mais il est devenu essentiel pour les
industriels de tester et de prouver l’authenticité des matières premières et produits
alimentaires pour protéger les consommateurs. En outre, la mention de l’origine et la
référence à la région de production sont devenues des garanties de qualité et un vrai argument
de vente.
Il est à noter que les aliments insalubres sont à l’origine de près de deux millions de
décès par an dans le monde, dont de nombreux enfants. Les aliments contenant des bactéries,
des virus, des parasites ou des substances chimiques sont responsables de plus de 200
maladies, allant de la diarrhée aigüe aux cancers.
En Algérie, malgré la mise en place de multiples points de contrôle stricts et rigoureux
depuis des décennies, le nombre de cas de TIAC (toxi-infection alimentaire collective) oscille
entre 3000 à 3500 cas entre 1998 à 2014, avec notamment deux pics de 4500 cas en 1999 et
3838 cas en 2014. Notons également, que ces cas de TIAC se sont soldés par une moyenne de
5 décès par an avec deux pics également, l’un en 1998 avec 50 décès et l’autre en 2008 avec
neuf décès.
La traçabilité agro-alimentaire est suivie grâce à différentes analyses :
 Analyses de composition et nutritionnelles
 Analyses de contaminants (dioxines, HAP, pesticides, métaux toxiques, radioactivité,
allergènes ...)
 Analyses d'authentification des produits (provenance, processus de fabrication,…)
 Analyses microbiologiques (par culture, PCR et MALDI-TOF)
 Analyses d'OGM, des espèces de viandes et poissons ou plantes
 Analyses sensorielles
Au cours de ce module nous traiterons de plusieurs principes et méthodes qui peuvent servir à
ces analyses.

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Chapitre 1.
Rappel des notions élémentaires

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1. Généralités sur les méthodes d’analyse
Le mot « analyse » comporte le suffixe « lyse » qui signifie « décomposer » (exp:
pyrolyse, hydrolyse, électrolyse, celui qui analyse étant l’analyste. Il est commode de
distinguer dans tout échantillon quel qu'il soit les deux termes suivants : ce que l'on cherche à
déterminer : l'analyte ; tout le reste : la matrice. Jusqu'au début du XXe siècle, la chimie
analytique consistait à faire réagir le produit inconnu avec des produits connus pour
déterminer sa nature. L'introduction de méthodes quantitatives, en utilisant les concepts de la
chimie physique, a marqué un renouvellement de la chimie analytique.
1.1. Analyses immédiates
Avant d'analyser un composé, on en prélève un échantillon, puis on sépare les différents
constituants du mélange. Si le mélange est constitué de plusieurs phases, on commence par
séparer ces phases. Par exemple, on peut séparer la phase solide de la phase liquide par
filtration ou tamisage.
La séparation d'un mélange homogène utilise les différences de propriétés physiques entre
les constituants. Par exemple, on extrait facilement le sel d'un mélange sel-sable au moyen de
l'eau, car le sel est soluble dans l'eau et le sable ne l'est pas. Par contre, la limaille de fer et le
sable sont tous deux insolubles dans l'eau : Cependant, seule la limaille de fer est magnétique,
on pourra donc la récupérer par triage magnétique. On peut séparer des constituants liquides
par distillations successives ou fractionnées. Dans certains cas, des cristallisations successives
permettent de séparer les constituants solides. Nous pouvons aussi utiliser la centrifugation
pour séparer le culot du surnageant.
La chromatographie permet de purifier un corps ou un constituant avant son dosage ou
d'éliminer les composés qui gêneraient son dosage. Il est de mémé pour l’électrophorèse.
L'approche moderne des méthodes dites « non destructives » où l'échantillon est traité
comme un tout dont la consommation reste négligeable vis-à-vis de la masse totale de celui-
ci, offre évidemment l'économie de l'analyse immédiate, conserve cet échantillon aux fins de
contre analyse si nécessaire, mais se heurte à des difficultés redoutables telles les effets de
matrice et les problèmes de l'étalonnage.

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1.2. Classification des analyses
Les analyses peuvent donc être classées :
 Selon le type : analyse qualitative ou quantitative.
 Selon le produit cible : analyse organique ou analyse minérale.
 Selon la quantité d’échantillons utilisée : macro- ou microanalyse. La quantité peut
être de l’ordre de quelques grammes ou des fractions de milligramme.
 Selon l’automaticité : analyse manuelle ou automatique. L’analyse automatique est
beaucoup utilisée dans l’industrie pour suivre et orienter les paramètres d’un procédé.
 Selon le matériel utilisé : L'analyse peut être par des méthodes classiques ou
instrumentales.
 Les méthodes classiques, incluant la séparation des différents composants de
l’échantillon, se classent en:
 Précipitation
 Extraction
 Distillation
- L’analyse quantitative dans les méthodes classiques peut être faite par:
 Gravimétrie – poids d’un composant résultant d’une réaction ou variation de poids
pendant la réaction
 Titration – mesure critique d’un volume pour obtenir la valeur de la concentration
 Par contre dans les méthodes instrumentales on utilise des équipements qui mesurent
une propriété physique ou chimique d’une substance ou un facteur qui permet la
détermination d’une propriété de cette substance.
- Les méthodes instrumentales se divisent en trois catégories ;
 Méthodes spectroscopiques – qui utilisent comme mesure la radiation
électromagnétique avec différentes gammes du spectre électromagnétique.
 Méthodes de séparation – qui séparent les composants d’un échantillon avant la
mesure d’une des propriétés d’un de ces composants.
 Méthodes électro analytiques – l’application d’un signal électrique et/ou
l’enregistrement d’une propriété électrique.

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Les différentes méthodes analytiques s’appliquent à différentes gammes de concentrations.

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1.3. Choix de la méthode
1.3.1. Spécifications en matière de performance
Les méthodes doivent être choisies sur la base de leurs performances compte tenu des
spécifications convenues. Les principales spécifications techniques sont les suivantes:
Précision: absence d'erreur systématique, étroitesse de l'accord entre les résultats de
plusieurs dosages et la valeur "vraie", en particulier lorsqu'ils sont proches
de la concentration qui déclenche une intervention - ou, pour une enquête,
lorsqu'ils sortent de la fourchette des concentrations prévues.
Fidélité: étroitesse de l'accord entre les dosages indépendants répétés concernant
une même substance.
Limite de
détection:
spécifiée soit à un niveau de confiance donne pour détecter la présence
d'une substance qui devrait être absente ou exprimée en concentration
"moins de" qui doit être au moins inférieure de 3 points au niveau
d'intervention.
Limite de
dosage:
exprimée comme le plus faible niveau auquel une concentration peut être
mesurée avec un degré de confiance donné.
Sensibilité: modification de la réponse par unité de concentration - généralement
spécifiée aux concentrations proches du niveau d'intervention.
Spécificité: mesure dans laquelle d'autres substances (connues) peuvent donner lieu à
un signal parasite.
Champ
d'application:
gamme de matrices auxquelles s'appliquent les caractéristiques de
performance.
Propriétés
pratiques:
gamme d'utilisation, pertinence.
Fiabilité: solidité, non-dépendance relative à l'égard des compétences de l'opérateur.
D'autres caractéristiques qu'on peut être amené à prendre en compte sont la simplicité, la
rapidité et le coût.

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1.3.2. Spécification en matière de référence
o Méthode de référence
Méthode reconnue comme référence par la doctrine ou la pratique quand plusieurs
méthodes sont admises.
o Méthodes courantes/officielles
Elles peuvent elles aussi être stipulées par des organisations commerciales ou par des
autorités réglementaires et sont considérées comme des méthodes qui peuvent être utilisées
quotidiennement pour les travaux ordinaires. Elles auront fait l'objet d'un grand nombre
d'essais comparatifs inter-laboratoires et bien qu'elles ne donnent généralement pas les mêmes
caractéristiques de performance et de qualité que les méthodes de référence, elles sont plus
rapides, plus pratiques et moins coûteuses et elles ont une fidélité et une précision suffisantes
pour la plupart des substances à analyser.
o Méthodes courantes/du laboratoire
II peut s'agir de méthodes d'analyse qui ont été mises au point à l'intérieur du laboratoire;
bien que certaines puissent être nouvelles, elles sont plus souvent fondées sur une méthode
officielle qui a été simplifiée de manière à être plus facile, plus rapide, plus économique, plus
avantageuse à utiliser.
1.4. Procédures de contrôle de la qualité
La métrologie est la science de la mesure. Elle définit les principes et les méthodes
permettant de garantir et maintenir la confiance envers les mesures résultant des processus de
mesure. Il s'agit d'une science transversale qui s'applique dans tous les domaines où des
mesures quantitatives sont effectuées. Nous allons voir quelques procédés et outils :
1.4.1. Contrôles d'échantillonnage
Dans certains cas, il peut être important de s'assurer que la prise d'essai est représentative
de l'échantillon reçu.
1.4.2. Dosages multiples
De préférence, les essais multiples doivent être rendus aléatoires dans le lot et l'idéal serait
que l'analyste n'en soit pas informé.
1.4.3. Témoins positifs
Lorsqu'il est prévu que la plus grande partie des prises d'essai ne contiendront pas de
quantités significatives de la substance recherchée, il est important d'analyser une prise d'essai
à laquelle la matière recherchée a été ajoutée et de montrer que l'analyse donne le résultat
attendu.

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1.4.4. Témoins négatifs
Dans la situation inverse, où la plupart des prises d'essai contiennent des quantités
significatives de la substance recherchée, il importe d'incorporer un nombre de prises d'essai
qui sont essentiellement exemptes de cette substance afin de donner des garanties que les
niveaux de contamination au laboratoire sont suffisamment faibles pour être acceptables.
1.4.5. Etalonnage
Vérification de la graduation et du réglage d'un appareil de mesure par comparaison avec
l'étalon.
1.4.6. Substances de référence certifiées
II s'agit de matières à analyser homogènes dans lesquelles la substance recherchée a été
dosée avec grand soin, en général par un certain nombre de laboratoires spécialisés et de
préférence à l'aide de différentes techniques analytiques.
1.4.7. Graphiques de contrôles
En réalisant un grand nombre de dosages sur une substance étalon, lorsque la méthode
semble fonctionner correctement, on peut calculer la moyenne et l'écart type pour la
concentration de la substance recherchée.
1.4.8. Répétition
Pour confirmer le résultat.
2. Généralités sur les bonnes pratiques au laboratoire
Télécharger le cours format ppt :
https://drive.google.com/open?id=1NIxT4NL1fatCvg
vADQUVNBOQbpcrg3VY

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3. Généralités sur les solutions
3.1. Définition
Une solution peut être définie comme un mélange homogène dont les constituants
sont divisés et dispersés l'un dans l'autre au niveau moléculaire. Une solution est toujours
constituée :
 D’un solvant (constituant majoritaire),
 D’un ou plusieurs solutés.
Les solutions sont liquides (ou aqueuses lorsque le solvant est l'eau). Les solutés
peuvent être :
 un gaz (CO2 dans les boissons gazeuses, O2, HCl,…),
 un liquide : éthanol, …
 un solide : sel.
3.2. Unités de concentration
La concentration molaire
C'est le rapport de la quantité de matière de (en mol) contenue dans un certain volume de
solution divisée par ce volume de solution exprimé en . C'est donc également la quantité de
matière de contenue dans un litre de la solution. La concentration molaire a donc pour unité
la mol.L-1
. La concentration molaire est souvent également appelée molarité ; elle est alors
symbolisée par la lettre M. Ainsi une solution de sulfate de sodium 0,2 M contient 0,2 mol de
sulfate de formule dans un litre ; on dit qu'il s'agit d'une solution à 0,2 mol.L-1
ou
encore 0,2 fois molaire.
On utilise souvent les « crochets » pour noter une concentration molaire :
ainsi signifie qu'un litre de solution contient de
dichlore dissous.

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La concentration massique
C'est le rapport de la masse de composé contenu dans un certain volume de solution divisée
par ce volume de solution. La masse est exprimée en kg ou en g et le volume souvent exprimé
en L et parfois en m3. Le terme concentration désigne souvent soit la concentration molaire
soit la concentration massique sans que cela soit précisé; il convient de bien noter l'unité
correspondante qui seule permet de différencier les deux types de concentration.
1 m3
(mètre cube) = 1 000 L (litres)
Le pourcentage en masse ou fraction massique
C'est le rapport de la masse de composé contenu dans un certain volume de solution divisée
par la masse de ce volume de solution. Ce rapport est obligatoirement compris entre 0 et 1. On
a pris l'habitude de l'exprimer en % pour manipuler des nombres compris entre 0 et 100 : par
exemple une solution de à 10% contient 10g de composé pour 100g de solution. Le
pourcentage en masse ne présente d'intérêt que lorsque l'on utilise des solutions très
concentrées.
La fraction molaire
C'est le rapport de la quantité de matière de contenue dans un certain volume de
solution divisée par la somme des quantités de matière de tous les constituants présents dans
ce volume de solution. Une fraction molaire est un nombre sans dimension. Si on note la
quantité de matière du composé i et sa fraction molaire, cette dernière se calculera à partir
de la relation ci-dessous.
La fraction molaire est peu utilisée pour exprimer les concentrations des solutés dans des
solutions diluées ; en revanche, elle sert pour exprimer la composition des mélanges.

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La normalité
Cette unité de concentration qui a été largement utilisée présente l'inconvénient de dépendre
de la réaction par laquelle on va utiliser cette solution... Ainsi, on définit la normalité d'une
solution acide dans l'eau comme le nombre de mol d'ion susceptible d'être libérés par
un litre de solution. De même, la normalité oxydo-réductrice d'une solution correspond au
nombre de mol d'électrons susceptibles d'être libérés par un litre de solution : dans ce dernier
cas, la normalité dépend de la nature de espèce chimique avec laquelle on peut faire réagir la
solution.
La masse volumique
La masse volumique d’une solution est définie par le rapport de la masse de solution (m) au
volume total qu’elle occupe (V).
𝛒 = 𝐦/ 𝐕 (unité : g/L, kg/L, kg/m3…)
La densité
La densité est le rapport de la masse volumique de la solution à la masse volumique de l’eau.
𝐝 = 𝛒/ 𝛒 𝐞𝐚𝐮
(La masse volumique de l'eau valant, à 3,98 °C, 1 g/cm3 ou 1kg/L,)
La densité de l'huile d'olive est 0.916 kg/litre donc elle flotte sur l’eau.
Cette densité correspond à une température ambiante de 16 ou 17 ° C. L'huile d'olive se dilate
lorsque la température augmente et donc sa densité diminue.
Degré d’acidité
Degré d’acidité est le nombre de gramme de l’acide par 100ml.
Exp : Dans un flacon de HCl à 37° il y a 37 g de l’acide dans 100 ml de solvant.

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4. Méthodes de préparations de solutions
4.1. Méthode par pesée
A. Préparation des solutions aqueuses par mise en solution d’un solide
Détermination de la masse de soluté à peser
Pour préparer un volume V d’une solution contenant l’espèce X, de masse molaire
M(X), à la concentration [X]. Il faut, en général, déterminer la masse de l’espèce X à peser.
Soit m(X).
Mise en pratique
Exemple : Calculer la masse de soude NaOH nécessaire pour préparer 50 mL d’une
solution 0,01M. On donne M(NaOH)=40 g/mol.

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4.2. Méthode par dilution
On prélève un volume V0 de la solution mère de concentration C0 que l’on dilue avec
de l’eau distillée pour obtenir une solution diluée de volume V1 et de concentration désirée
C1. La solution fournie est en général appelée solution mère.
Détermination du volume V0 à prélever
La quantité de matière de soluté dans le volume V0 est: n(X)=C0.V0. Cette quantité
de matière se retrouve dans la solution après dilution. Cela traduit la conservation de la
matière, donc: n(X)=C1.V1 On en déduit la relation suivante (qu’on appellera par la suite
formule de dilution ou équation de conservation de la matière):
Le volume à prélever est donc:
Lors d’une dilution le facteur de dilution est le rapport de la concentration de la solution mère
sur celle de la solution fille :
Mise en pratique
C0×V0=C1×V1

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Exemple :
On prélève un volume V0 = 20 mL d’une solution aqueuse de sulfate de cuivre II de
concentration C0=5×10-2 mol.L-1 Ce volume est introduit dans une fiole jaugée de 500 mL,
on complète avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge, puis on homogénéise.
a. Comment prélève t on le volume V0 de la solution mère.
b. Quelle est la concentration de la solution fille ?
c. Calculer le facteur de dilution F effectué.
Solution
Solution a. Pour prélever le volume V0 de solution mère on utilise une pipette jaugée car le
prélèvement est plus précis.
Solution b. Concentration de la solution fille On sait que la concentration de la solution fille
C1 et celle de la solution mère C0 sont reliée par la relation de dilution C0×V0=C1×V1 où V0
et V1 désignent respectivement le volume de solution mère prélevé et le volume final de la
solution fille.
Solution c. Calcul du facteur de dilution F On rappelle que

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Chapitre 2.
Méthodes physico-chimiques et chimiques d’analyses

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A. Méthodes physico-chimiques
1. pH métrie
1.1. Définition
Le potentiel hydrogène, noté pH, est une mesure de l'activité chimique des hydrons
(appelés aussi couramment protons ou ions hydrogène) en solution. Notamment, en solution
aqueuse, ces ions sont présents sous la forme de l'ion hydronium.
Plus souvent, le pH mesure l’acidité ou la basicité d’une solution. Ainsi, dans un milieu
aqueux à 25 °C :
o une solution de pH = 7 est dite neutre ;
o une solution de pH < 7 est dite acide ; plus son pH diminue, plus elle est acide ;
o une solution de pH > 7 est dite basique ; plus son pH augmente, plus elle est
basique.
1.2. Calcul du pH
Selon Sørensen le pH est défini comme étant le logarithme négatif de la concentration en
ions H3O+, hydronium, issus de la dissociation de molécule:
Lorsque la concentration en ions H3O+ change d’un facteur dix, le pH change d’une
unité.
1.3. Echelle du pH
Les acides et bases ne sont pas seuls à se dissocier pour former des ions hydronium ou
hydroxyle, l’eau pure se dissocie elle aussi en formant ces ions :
pH = –log [H3O+
]
2 H2O ⇔ H3O+ + OH–

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L'eau contient normalement un nombre équivalent d'ions hydroxydes (OH-) et d'ions
hydroniums (H30+). Lorsqu'une substance acide ou alcaline est ajoutée dans de l'eau, elle
modifie la proportion d'ions hydroxydes et d'ions hydroniums.
Kw est la constante de dissociation de cette réaction ou produit ionique de l’eau :
La solution est neutre pour des quantités égales de H3O+ et d’OH–.
Or c’est le cas lorsque la concentration de [H3O+] et [OH–] est de 10–7
mol/L, soit à pH 7.
L'eau pure devrait avoir un pH de 7, mais l'eau du robinet a généralement un pH entre 5,5
et 6. L'eau très acide (avec un faible pH) est plus susceptible de dissoudre les produits
toxiques. Ceux-ci peuvent contaminer l'eau et la rendre impropre à la consommation humaine.
Kw = [H3O+][OH–] = 10–14
mol/L (25 ºC)

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1.4. Mesure du pH
A. Les indicateurs de pH
De nombreuses substances chimiques prennent en solution une couleur qui dépend des
conditions de pH. Cette propriété est mise à profit pour déterminer les caractéristiques des
solutions en y introduisant l’indicateur.
Le choix du bon indicateur permet également de repérer l’équivalence au cours des
titrages.
Les principaux indicateurs colorés acido-basiques utilisés au laboratoire ainsi que leurs
caractéristiques :
Sous forme de solution : Dans le titrage colorimétrique acido-basique, on utilise en
général un indicateur coloré assez diluée pour que l’équilibre acido-basique mis en jeu ne
perturbe pas trop la solution. Cette méthode se base sur le changement de couleur du milieu
lorsqu’on atteint le point d'équivalence. Il est introduit directement dans l’échantillon de la
solution à titrer.

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Sous forme de papier-pH et bandelettes : l’indicateur est absorbé sur une bandelette ou un
bout de papier sur laquelle on dépose une goutte de la solution à tester. L’intérêt est de
couvrir tout le domaine de pH. Pour arriver à ce résultat, il suffit d’absorber plusieurs
indicateurs colorés en même temps.
Un indicateur universel est un mélange d'indicateurs dont les points de virage sont étalés
de manière à ce que la couleur de la solution varie graduellement sur une large gamme de pH.
Rouleau de papier-pH et bandelettes

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B. Le pH mètre
Le principe
Pour mesurer le pH on a besoin d’un outil de mesure sensible aux ions hydronium qui
déterminent le pH. Il s’agit d’un voltmètre. Le principe de la mesure consiste à prendre
un capteur avec une membrane en verre sensible aux ions hydronium (électrode pH) et à
observer la réaction entre la membrane et l’échantillon : mesure d’un potentiel. Ce potentiel
est comparé à un potentiel de référence délivré par une électrode insensible au pH, par
diffusion d’électrolyte vers l’échantillon au travers d’un diaphragme : électrode de référence
(Ag/AgCl). Pour un usage plus simple, les 2 électrodes sont combinées en une seule électrode.
Le pH d’une solution est alors la différence de potentiel entre les deux électrodes
selon l’équation de Nernst :
E = potentiel mesuré
E0 = constante
R = constante des gaz parfaits
T = température en degrés Kelvin
n = charge ionique
F = constante de Faraday
E = E0 + 2.3RT / nF * log [H3O+
]

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Etalonnage
1) Sélectionner le mode calibration.
2) Sélectionner la température correcte pour les tampons si une correction
automatique de température n’est pas effectuée.
3) Préparer les solutions tampons prévues pour l’étalonnage en versant un volume
suffisant de solution dans des récipients propres.
4) Rincer l’électrode avec de l’eau distillée ou déminéralisée. Essuyer avec un papier
doux sans frotter.
5) Prendre la première solution tampon, agiter doucement et immerger l’électrode.
Ouvrir l’orifice de remplissage de l’électrolyte pendant la mesure. Veiller à utiliser les
solutions tampons dans le bon ordre pour l’étalonnage.
Presser le bouton étalonnage (ou son équivalent) sur le pH-mètre.
6) Attendre que la mesure se stabilise.
7) Retirer l’électrode de la solution tampon et la rincer.
8) Prendre la seconde solution tampon, agiter doucement et immerger l’électrode.
9) Presser le bouton d’étalonnage (ou son équivalent) sur le pH-mètre.

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10) Attendre que la mesure se stabilise. L’étalonnage peut se faire sur 2, 3 points de
pH.
11) Si étalonnage correct appuyer sur ok et choisir le mode pH.
Mesure
1) Verser un volume suffisant de solution échantillon dans un récipient propre de sorte
que la jonction liquide de l’électrode (diaphragme) soit immergée dans l’échantillon.
2) S’assurer que la température de l’échantillon est connue ou qu’elle est mesurée
pendant la détermination du pH par un capteur de température intégré ou séparé.
4) Agiter doucement l’échantillon et plonger l’électrode de pH dans la solution.
5) Presser le bouton mesure du pH-mètre et attendre une valeur stable.
6) Retirer l’électrode de la solution et la rincer à l’eau distillée ou déminéralisée.
Après la mesure, rincer l’électrode à l’eau distillée ou déminéralisée et la conserver
dans un capuchon humidificateur rempli d’électrolyte de référence.
Influence de l’environnement
 Il est important que la calibration soit faite à la température de mesure car la
température a un effet sur la dissociation de la molécule. Il est a noté aussi que les
électrodes ont des températures max d’utilisation.
 Si le solvant n’est de l’eau alors la gamme de pH habituelle ne s’applique pas.
 Le milieu peut causer un colmatage de l’électrode et fausser le résultat (protéines,
matière grasse, Ag2S, AgCl) alors il est nécessaire de l’entretenir.

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2. Conductimétrie
2.1. Définition de la conductivité
La conductivité (notée σ « sigma ») quantifie l'aptitude d'une solution à conduire le
courant électrique (laisser se déplacer librement les charges électriques).
2.2. Conductivité ionique
La conductivité est directement liée à la mobilité (notée ui) des ions i présents au
sein de la solution, qui est la part de la conductivité indépendante de la concentration. La
propriété de conduction électrique (ou de résistance) est relative au déplacement des ions
(mobilité ionique des ions ui).
Plus un ion est volumineux, plus sa mobilité est faible, et plus sa conductivité est
faible. Il s'ensuit que les cations métalliques possèdent généralement des λ°i (Lamda)
relativement faibles. Pour chaque ion, on définit de plus la conductivité
molaire ionique λi (Ai
Z
i) par :
Les conductivités ioniques peuvent être exprimées en mS.m2
.mol-1
(m S= milli-simens)
ou en mS.m2
.éq-1
. Pour les ions monochargés (Na+
, Cl-
, etc.), il n'y a pas de différence. Pour
les ions polychargés (Ni2+
etc.) la conductivité molaire ionique est égale à la conductivité
équivalente ionique multipliée par la valeur absolue de la charge de l'ion. Dans le tableau ci-
dessous, les valeurs sont en équivalents de charge, d'où l'unité et la notation du type 1/2Fe2+
,
1/3Fe3+
, etc.

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2.3. Le conductimètre
Un conductimètre est un appareil qui permet de mesurer la conductivité σ (exprimée en
S.m-1
) ou la résistivité ρ « Rho » exprimée en Ω.m (ohms par mètre) d’une solution.
En pratique, l’appareil mesure une conductance G (exprimée en Siemens. Ω-1
) ou
une résistance R (exprimée en Ω « Omega ») (R = 1/G).
Une tension alternative (100-1000Hz) de faible amplitude (pour éviter les phénomènes
d'électrolyse et de polarisation des électrodes) est appliquée entre les deux plaques. La
résistance est alors déterminée grâce à un montage électronique complexe (pont de
Wheatstone). On définit la conductance comme l'inverse de la résistance R d'une solution et
celle-ci se note G :
La conductivité notée σ est proportionnelle à G avec k un facteur de proportionnalité
appelé constante de cellule qui dépend de la cellule de conductimètre utilisée :
où k = I/S (recommandation I.U.P.A.C) représente la constante de cellule en rapport
avec les caractéristiques physiques de la cellule de mesure conductimétrique (I la distance
entre les deux plaques et S la surface réelle des deux plaques).
σ = kG

27
Étalonnage
La conductivité σ se déduit de la mesure de G à condition de connaître la constante de
cellule k. Il est donc nécessaire de déterminer celle-ci car sa valeur peut varier au cours du
temps notamment à causes de phénomènes d’adsorption d’analytes qui tendent à en diminuer
la surface active. Pour cela, on procède à une phase d’étalonnage au moyen d’une solution
étalon dont la conductivité 𝜎 est tabulée pour chaque température : il s’agit souvent d’une
solution de KCl à 0,1 mol.L-1
. Pratiquement, l’expérimentateur ajuste la constante k afin
d’obtenir à l’écran la valeur de la conductivité tabulée à la température d’étude. Une fois
étalonné, on lit directement la valeur de σ sur le conductimètre.
Valeurs de conductivité pour une solution de KCl à 0,1 mol.L-1
Expérimentalement, on procède comme suit :
1. Placer la cellule conductimétrique dans une solution étalon de KCl à 0,1 mol.L-1
2. Sélectionner la température adéquate

28
3. Appuyer sur le bouton Cal pour commencer la calibration. Faire varier la valeur de la
constante de cellule k pour obtenir la valeur de 𝜎 adéquate à la température de mesure.
4. Valider la valeur de k en appuyant sur ok. Le conductimètre affiche alors 𝜎 et est prêt
à être utilisé.
5. Rincer la cellule avec de l’eau distillée.
Mesure
1. Verser un volume suffisant de solution « échantillon » dans un récipient propre de
sorte que les plaques de la cellule conductimétrique soient totalement immergées dans
l’échantillon.
2. S’assurer que la température de l’échantillon est connue ou qu’elle est mesurée
pendant la détermination de la conductivité (par un capteur de température intégré ou
séparé).
3. Rincer la cellule avec un peu de la solution initiale (afin que les premières mesures ne
soient pas faussées) avant de la plonger dans la solution.
4. Agiter doucement l’échantillon pour l’homogénéiser et plonger la cellule
conductimétrique dans la solution.
5. Arrêter l’agitation afin de ne pas perturber la mesure entre les plaques. Si l’agitation
du milieu est nécessaire, il est préférable de légèrement décaler la cellule par rapport à
l’agitateur et d’agiter modérément.
6. Presser le bouton « mesure » du conductimètre et attendre une valeur stable.
7. Une fois la mesure effectuée, retirer l’électrode de la solution et la rincer à l’eau
distillée ou déminéralisée. Conserver l’électrode dans l’eau distillée.
Influence de l’environnement
La conductimétrie est en relation directe avec la quantité d’ions en solution. Toute
variation de cette quantité aura donc une influence sur la conductance ou résistance de la
solution.
La conductance G varie de façon très importante avec la température. Il est donc
préférable de thermostater le milieu et d’éviter de faire des titrages de solutions concentrées
par conductimétrie lorsque la réaction est exothermique.
Conductivité de l’eau
La conductivité de l’eau donne une indication de sa qualité comme illustré ci-dessous.
La conductivité de l'eau ultra-pure est d'environ 0,055 mS/cm à 25°C.

29
3. Polarographie
3.1. Introduction
La conductimétrie étant faite pour les composés non électro-actifs, pour les composés
électro-actifs on utilise les méthodes statiques comme la potentiomètrie (mesure du potentiel
de manière passive comme le pH-mètre) ou dynamiques (mesure du courant électrique en
fonction du potentiel imposé par l’appareil) comme la voltamètrie ou la polarographie.
Rappel
Un composé électro-actif est un composé qui peut s’oxyder ou se réduire par voie
électrochimique. L’électroactivité d’un composé dépend de sa structure chimique, de la nature
de l’électrode et autres facteurs expérimentaux.
3.2. Définition
La polarographie est une méthode électrochimique d'analyse, inventée en 1922
par Jaroslav Heyrovsky, de l'université Charles de Prague. Pour sa découverte, il reçut le prix
Nobel de chimie en 1959 en raison des possibilités très variées de cette méthode tant en
chimie minérale qu'en chimie organique.
De nombreuses variantes ont été conçues et on parle aujourd'hui des polarographies.
Ces méthodes ont en commun l'utilisation d'une électrode particulière appelée électrode à
gouttes de mercure (Hg) à la surface de laquelle on réalise une oxydation ou une réduction
électrochimique en appliquant un potentiel selon un programme pré-établi. La mesure du
courant d'électrolyse permet d'accéder à la concentration de la substance électrolysée.

30
Les spécificités propres à l'électrode à goutte de mercure comparées aux électrodes
conductrices solides viennent des propriétés particulières de ce métal qui, liquide à
température ambiante, permet un renouvellement de la surface active de l'électrode, qui
conduit aisément à la formation d'un certain nombre d'amalgames avec les métaux et qui
permet des réductions à des potentiels très négatifs (réductions impossibles à réaliser sur
électrode de platine ou de carbone vitreux). En oxydation, par contre, l'exploration des
potentiels en polarographie est limitée par l'oxydation du mercure, ce qui explique qu'une
grande partie des applications a concerné des composés électroréductibles.
Dans le cas d'un cas d'un cation métallique, par exemple, la réaction électrochimique
mise en jeu est la suivante :
Mn+
+ ne-
+ (Hg) ---> M(Hg)
Elle se différencie de sa descendante, la voltampérométrie, essentiellement par la
nature de l'électrode puisque les méthodologies sont bien souvent identiques. Ses avantages
sont nombreux notamment en termes de coûts (analyse et appareillage), de simplicité de
l'appareillage et de performances analytiques (limites de détection, analyse multiélémentaire).
Les techniques polarographiques sont utilisables lorsque la solution à étudier contient
une ou plusieurs espèces réductibles ou oxydables à une électrode, les concentrations des
espèces à analyser étant inférieures à 10-3
M.
3.3. Principe du polarographe

31
On dispose dans la cellule d'électrolyse de 3 électrodes qui plongent dans la solution à
étudier :
o une électrode de référence : électrode au calomel saturé.
o une électrode auxiliaire (anode) : électrode de platine.
o une électrode de travail (cathode) : électrode à goutte de mercure constituée
par un capillaire de faible diamètre (20 à 50 mm) alimenté par une colonne de
mercure.
Le barbotage dans l’Azote N2 est utiliser pour se débarrasser de l’oxygène qui pourrait
réagir avec les électrodes et altérer la mesure.

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Un avantage important du mercure réside dans le fait qu'à chaque goutte correspond
une nouvelle électrode, identique à la précédente du point de vue géométrique, mais ne
gardant pas mémoire du phénomène électrochimique ayant affecté les gouttes antécédentes.
Il est possible de procéder aux analyses avec un milieu aqueux, mais aussi en milieu
organique. Dans le premier cas, on utilise majoritairement du KCl, mais il existe bien d’autres
électrolytes efficaces. C’est la même chose pour le milieu organique. On peut faire l’analyse
dans de l’alcool, acide acétique, acide sulfurique et bien plus.
En pratique, il résulte de l'application des méthodes d'analyse polarographiques la
mesure d'une intensité de courant ou parfois d'une quantité de charges, à un potentiel
caractéristique de l'analyte (id) ou (i), proportionnel à sa concentration en solution. Pour les
analyses quantitatives, on procède, soit à l'établissement d'une droite d'étalonnage à partir de
concentrations connues du soluté à laquelle on se reporte pour la détermination d'une
concentration inconnue, soit pour éviter des erreurs de mesures dues aux effets de matrices, à
la méthode des ajouts dosés, en effectuant des ajouts de concentrations connues dans la
solution contenant le ou les solutés à analyser.
Lois régissant la polarographie classique
 Partant de la Loi de Fick relative à la diffusion plane et de la variation de la surface de
la goutte en fonction du temps, ILKOVIC a établi l'expression mathématique du
courant de diffusion (s=seconde et A=Amper) :
 id = intensité du courant de diffusion (mA)
 n = nombre d'électrons mis en jeu dans la réaction
 D = coefficient de diffusion de l'espèce (cm2
.s-1
)
 m = débit du capillaire (mg.s-1
)
 t = durée de vie de la goutte de mercure (s)
 C = concentration de l'espèce (millimole.l-1
)
id = 607 n D1/2
m2/3
t1/6
C = K C

33
 Les courbes obtenues ci-dessous, se présentent sous forme de " vagues " dont la
hauteur du palier de diffusion est proportionnelle à la concentration de l'espèce
tandis que le potentiel de demi-palier est caractéristique de cette espèce.
 C'est donc une méthode d'analyse quantitative et qualitative.
 Lorsque le potentiel devient très négatif, on observe finalement la réduction du
solvant.
Courbe de la solution KCl (10-1
M) i=f(E)
Courbe du Nikel Ni2+
(10-3
M) en solution dans KCL (10-1
M) i=f(E)

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3.4. Applications de la polarographie
Les techniques polarographiques couvrent un large domaine d'applications en analyse
et peuvent être utilisées en particulier dans les domaines de l'environnement, de l'analyse de
l'eau et des eaux résiduaires (exp : métaux lourds), de l'industrie pharmaceutique, alimentaire,
cosmétique, pétrolière et nucléaire, de la galvanoplastie, de l'analyse des fluides biologiques
et de l'industrie des plastiques et des polymères. Elles sont appliquées à l'analyse de
constituants principaux et à l'analyse de traces et d'ultratraces. Elles concernent l'analyse en
solution de métaux, de molécules inorganiques, organométalliques ou organiques ou des
molécules d'intérêt biologique et biochimique. Elles permettent des analyses
multiélémentaires et sont non destructives des solutions analysées puisque les quantités de
solutés impliqués dans les mesures polarographiques sont négligeables par rapport aux
quantités en solution, permettant ainsi des mesures répétitives sur une même solution.
3.5. Limites de la polarographie classique
 Sensibilité
La polarographie classique est limitée vers les faibles concentrations de l'ordre de 10-5
à
10-6
M.
 Pouvoir de séparation
Pour que deux vagues polarographiques soient dissociables, il faut que la différence entre
les potentiels de demi-vague soit supérieure à 100 à 200 mV.

35
B. Méthodes chimiques
1. Gravimétrie
1.1. Définition
L'analyse gravimétrique est un type de technique de laboratoire qui permet de déterminer
la masse ou la concentration d'une substance en mesurant une variation de masse.
Il existe deux types courants d'analyse gravimétrique. Les deux reposent sur une
modification de l'analyte pour le séparer du reste du mélange, provoquant ainsi une variation
de la masse.
1.2. Analyse gravimétrique par volatilisation
Cette méthode permet de séparer les composants d'un mélange par chauffage ou par
décomposition chimique de l'échantillon. Cela permet de séparer n'importe quel composé
volatil et conduit à une variation de masse que l'on mesure.
 Exemple : Déterminer la pureté d'un hydrate de métal à l'aide de la gravimétrie
par volatilisation
Problème
Par accident, Une bouteille de chlorure de baryum (Sa forme hydratée la plus fréquente
est BaCl2.2H2O.), vient d’être contaminée par une quantité inconnue de KCl en poudre.
Quelle est le pourcentage massique de chlorure de baryum hydraté dans le flacon ?
Solution
Pour déterminer la pureté de notre composé on prélève un échantillon et on procède a un
chauffage qui va éliminer les molécules d’eau. Nous avons prélevé 9,51 g et après chauffage
nous abstenons 9,14g.
1. Calcul de la masse de l’eau :
Masse de H2O=Masse initiale de l’échantillon−Masse finale de l’échantillon
=9,51g−9,14g=0,37g H2O
2. Convertir la masse d'eau évaporée en nombre de moles :
On divise tout simplement par la masse molaire qui est de 18g/mol

36
On obtient :
0,37/18= 2,05x 10-2
mol d’eau
3. Calculer le pourcentage massique de BaCl2. 2H2O dans l'échantillon contaminé :
Selon l’équation bilan suivante :
Nous avons une mole de chlorures de baryum pour 2 moles d’eau.
Donc pour avoir le nombre de moles de ce composé on divise par 2
On obtient : 2,05x 10-2
mol / 2 = 1,025 x10-2
mol de BaCl2. 2H2O
On la converti en masse grâce à la masse molaire (Ba =208 et H2O= 18 donc =244) :
1,025 x10-2
x 244 = 2,5 g
On calcule le pourcentage massique ou la pureté de BaCl2. 2H2O :
(2,5 / 9,51) * 100 = 26,3 %
 Conseils
Voici quelques conseils utiles pour réaliser des expériences de gravimétrie et faire les calculs
associés :
 La superficie est toujours un facteur à prendre en compte lorsqu'on élimine des
composés volatils présents dans un échantillon. Travailler avec une plus grande
superficie permet d'augmenter le taux d'évaporation. On peut augmenter la superficie
de l'échantillon en l'étalant en couche aussi mince que possible sur la surface
chauffante ou en brisant les plus gros morceaux du solide, puisque l'humidité peut
rester piégée dans ces fragments.
 Revérifier la stœchiométrie et s'assurer d'avoir équilibré correctement les équations-
bilans
 Lorsqu'on évapore des composés volatils d'un échantillon, s'assurer d'avoir sécher
jusqu'à obtenir une masse constante.
 Toujours tarer la verrerie !

37
1.3. Analyse gravimétrique par précipitation
La gravimétrie par précipitation est une technique d'analyse qui permet de séparer les ions
d'une solution grâce à une réaction de précipitation. L'espèce chimique qu'on ajoute pour
induire la réaction de précipitation, est appelé précipitant ou réactif de précipitation. Le
précipité formé est ensuite séparé des autres composants liquides par filtration, et on utilise la
masse de ce solide, ainsi que l'équation-bilan de la réaction, pour calculer la quantité ou la
concentration en composés ioniques dans la solution.
 Exemple : Déterminer la pureté d'un mélange composé de MgCl2 et de NaNO3
Problème
On se retrouve avec 0,7209 g d'un mélange contaminé composé de MgCl2 et de NaNO3.
On aimerait connaître les quantités respectives de chaque composé du mélange qui totalement
dissous dans l'eau.
Solution
On ajoute alors en excès un agent de précipitation, le nitrate d'argent AgNO3 (aq), et on
observe la formation d'un précipité. Après avoir filtré et séché ce précipité, on obtient un
solide d'une masse égale à 1,032g.
Selon l’équation-bilan :
Selon cette équation-bilan, on s'attend à produire 2 moles de précipité AgCl2 pour chaque
mole de MgCl2 (aq), le composé qu'on cherche à quantifier.
1. Convertir la masse du précipité AgCl2 en mol grâce à la masse molaire (143g/mol) :
1,032g¨/143= 7,21 x 10-3
mol.
2. Calculer le nombre de moles et la masse du MgCl2 :
Pour le nombre de moles on divise par 2 :
7,21 x 10-3
/2 = 3,6 x 10-3
mol
Pour avoir la mase on multiplie par la masse molaire (95g/mol)
3,6 x 10-3
x 95 = 0,34 g

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3. Calcule de la fraction massique :
(0,34 g/0,7209) x100 = 47,44 %
 Conseils
Voici quelques conseils utiles pour réaliser des expériences de gravimétrie par précipitation et
faire les calculs associés :
 Revérifier la stœchiométrie et s'assurer d'avoir équilibré correctement les équations-
bilans.
 S'assurer d'avoir sécher le précipité jusqu'à obtenir une masse constante.
 Ajouter un excès d'agent de précipitation.
1.4. Exemple d’utilisation de la gravimétrie dans l’agro-alimentaire
La détermination de la concentration des huiles et graisses totales s’effectue
principalement en deux étapes :
 Les huiles et graisses totales contenues dans l'échantillon sont d’abord extraites à
l’aide d’hexane. Cet extrait est par la suite asséché avec du sulfate de sodium.
 L'extrait de l'échantillon est ensuite évaporé à sec et pesé pour déterminer la
concentration des huiles et graisses totales par gravimétrie.

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2. Volumétrie
2.1. Définition
Le dosage volumétrique est une technique où la concentration d'une solution inconnue est
déduite de la mesure d'un certain volume d'une autre solution de concentration connue.
2.2. Principe
Appelons l'espèce chimique dont on recherche la teneur dans une solution de
concentration inconnue . Lors d'un dosage volumétrique, pour déterminer , on
provoque une réaction chimique entre le composé et un autre composé : cette réaction
doit être totale (la constante associée à la réaction entre et doit être très grande) et
instantanée.
En pratique, on introduit progressivement des quantités croissantes d'une solution du
composé de concentration connue, dans un volume connu de la solution de , cela
jusqu'à ce que toutes les molécules de soient consommées. Lorsque la quantité de versée
correspond exactement à ce qu'il fallait introduire pour que toutes les molécules de aient
disparu, on dit que l'on a atteint l'équivalence du dosage. Le volume de solution de versé
pour atteindre l'équivalence, s'appelle le volume équivalent. La concentration se
déduit alors de la relation de bilan associée à la réaction du dosage.
Il existe différents types de titrage : titrage acido-basique, titrage par oxydo-réduction,
titrage par compléxations, titrage par précipitation,…, etc.

40
Chapitre 3.
Chapitre 3 : Méthodes Physiques d’analyses

41
1. Méthodes spéctro-photométriques : UV- Visible
1.1. Définition de la spectrométrie
Le spectromètre UV visible mesure l'absorption de la lumière par un échantillon en
solution, à une longueur d'onde donnée comprise entre 200 nm et 800 nm. Il s'emploie de
deux manières :
 Mesure de l'absorbance A à longueur d'onde fixée ; la loi de Beer-Lambert relie cette
absorbance à la concentration des espèces en solution et à plusieurs constantes
physiques. Cette méthode est très employée pour l'analyse quantitative, y compris en
détection chromatographique, elle porte le nom de spectrophotométrie.
 Mesure, sur un échantillon de concentration donnée, de l'absorbance donnée en
fonction de longueur d'onde : le graphe obtenu est le spectre UV-visible de la
molécule en solution. Il dépend de sa structure moléculaire.
1.2. Principe du spectromètre
Une source polychromatique fournit de la lumière "blanche" dont un monochromateur
extrait le rayonnement aux longueurs d'onde demandée par l'utilisateur. L'intensité de ce
rayonnement est mesurée après qu'il a traversé l'échantillon à analyser. Cette intensité est
comparée à une valeur de référence. La valeur affichée par l'appareil rend compte de cette
comparaison.

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1.3. Fonctionnement du spectromètre
Pour pouvoir utiliser un spectromètre, il faut repérer un certain nombre d'éléments :
 le cas échéant, l'interrupteur "marche/arrêt"
 le compartiment de l'échantillon
 le sélecteur de longueur d'onde et, éventuellement, le sélecteur de source
 l'écran de lecture
 la commande de réglage du blanc, c'est-à-dire de l'absorbance A=0 ou de la
transmittance T=100%.
Tout ou une partie des commandes peuvent être regroupées dans un clavier ou en
quelques touches qui permettent de naviguer dans des menus affichés sur un écran de
contrôle. Certains spectrophotomètres sont complètement pilotés par un logiciel installé sur
un ordinateur personnel ; dans ce cas, il faut se référer au mode d'emploi du programme.
ATTENTION : certains spectromètres plus sophistiqués possèdent deux canaux de
mesure qui fonctionnent simultanément. Ce sont les instruments "à double faisceau".
Les valeurs de I0 et I sont déterminées en même temps et comparées pour fournir le
résultat recherché.

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1.4. Equation de Beer-Lamber
La mesure est fondée sur l'utilisation de la loi de Beer-Lambert :
Elle comporte généralement deux étapes :
1. Détermination de ε : c'est l'étalonnage. Pratiquement, la longueur L est fixée par les
cuves dans quoi est mesurée l'absorbance. La mesure de l'absorbance de plusieurs
solutions de concentrations variées fournit un jeu de valeurs Ai et Ci qui permettent de
tracer le graphe, en principe linéaire. Sa pente vaut εL.
2. Contre-étalonnage : la mesure de l'absorbance donne une valeur Ax qui, reportée sur le
graphe d'étalonnage, conduit à la concentration Cx recherchée.
1.5. Protocole de mesure
1. Choisir la cuve :
La cuve est choisie en fonction de la longueur d'onde : le verre ne permet pas d'analyse en
dessous de 330 nm, le PMMA en dessous de 300 nm et le polystyrène en dessous de 340 nm.
Les cuves en polymères sont jetables. Le quartz (en fait de la silice SiO2 fondue) permet de
travailler jusqu'à 200 nm. L'épaisseur de le cuve est choisie en fonction de la sensibilité
recherchée (mais plus de 95% des analyses sont faites avec une épaisseur L égale à 1 cm. Si le
volume de l'échantillon est limité, on pourra choisir une cuve rétrécie.
2. Allumer, s'il ne l'est pas, le spectromètre
S’assurer que la bonne source est connectée. Deux sources sont nécessaires pour
couvrir le domaine 200 - 800 nm : une lampe dite "tungstène" (symbole W) couvre le proche
UV, à partir de 330 nm et le visible ; une lampe au deutérium (symbole D2) couvre
l'ultraviolet en dessous de 330 nm.

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La figure ci-dessous montre, sur deux spectromètres différents, le genre d'instruction
qu'il faut chercher pour accéder à l'allumage de la source quand un interrupteur dédié n'est pas
présent sur l'appareil.
Les spectromètres sont souvent dotés de compteurs qui permettent de mesurer la
durée de vie des lampes ; un changement automatique de lampe est aussi souvent prévu vers
320-340nm. Il faut ensuite vérifier que le spectromètre est en mode "photométrie".
3. Sélectionner la longueur d'onde de travail :
La longueur d'onde λtravail est fournie par le protocole. Sur le panneau de contrôle du
spectromètre, régler la longueur à la valeur voulue.

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4. Mesure de I0 ou "blanc" :
Vérifier qu'il n'y a pas d'échantillon, fermer le capot du compartiment de l'échantillon,
appuyer sur la touche : "100%T" ou "zéro".
Faire le blanc : remplir une cuve avec une solution homogénéisée de tous les
constituants du mélange à analyser, sauf l'espèce à doser. Autrement dit, remplir une cuve
avec le solvant, le tampon, les éventuels réactifs qui interviennent pendant le dosage. Vérifier
l'absence de coulure sur les faces optiques (non dépolies) de la cuve et la placer sur le trajet du
faisceau lumineux. Fermer le capot. La lumière qui émerge de cette cuve permet au
spectromètre d'évaluer I0 envisagée non pas comme intensité lumineuse fournie par la source
du spectromètre, mais comme intensité arrivant au détecteur lorsque toute les conditions
d'analyse sont réunies, sauf la présence de l'espèce chimique qu'il s'agit de doser. Si
l'absorbance dépasse 1, les constituants du blanc absorbent déjà plus de 90% de l'intensité
lumineuse. Les conditions d'analyse deviennent discutables. Sinon, appuyer sur le touche
100%T ou "zéro".
5. Mesure de I et A
Remplir une cuve avec une solution homogénéisée de tous les constituants du mélange à
analyser, y compris l'espèce à doser. L'intensité de la lumière qui émerge de cette cuve
correspond à I0 diminuée de l'absorption due à la l'espèce à doser. Relever l'absorbance lue et
la reporter sur la courbe d'étalonnage ; en déduire la concentration recherchée.
 Si la valeur de l'absorbance dépasse 1, il existe un risque que cette grandeur soit sortie
de la zone de linéarité de la loi de Beer-Lambert. Il est préférable de renouveler la
mesure en diluant ou en préparant à nouveau l'échantillon. Refaire le blanc, si
nécessaire.
 Si l'absorbance évolue : le contenu de la cuve évolue aussi. Une réaction a lieu, qui
conduit à la formation de davantage de composé coloré (cas fréquent lorsqu'il faut
ajouter un réactif) ou au contraire à la décomposition de la molécule qui absorbe.

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2. Méthodes chromatographiques
A. Généralités
1. Définition
La chromatographie est une méthode physique d’analyse basée sur la séparation de
constituants d’un mélange ; les différents constituants de ce mélange appelés solutés sont
séparés et entraînés par un fluide (un liquide ou gaz) que l’on appelle phase mobile ; ils
interagissent ou au contraire n’interagissent pas avec une phase fixe que l’on appelle phase
stationnaire qui exerce sur eux un effet retardateur. L'origine du mot chromatographie vient
peut-être de la séparation de composés colorés puisque chroma () en grec, signifie
couleur et graphein signifie écrire.
2. Classification des techniques chromatographiques
2.1. Classification selon la nature physique des phases
Selon la nature de la phase mobile on distingue: la chromatographie en phase liquide
(CPL) la chromatographie en phase gazeuse (CPG) la chromatographie en phase supercritique
(CPS).
Selon la nature de la phase stationnaire on distingue: la chromatographie liquide/solide
(CLS) la chromatographie liquide/liquide (CLL) la chromatographie gaz/solide (CGS) la
chromatographie gaz/liquide (CGL).
2.2. Classification selon le mécanisme de rétention
Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec
les molécules à séparer. On distingue ainsi: la chromatographie d'adsorption, de partage,
d'échange d'ions, d'exclusion et la chromatographie d'affinité.
2.3. Classification selon la technique mise en jeu
Selon la technologie mise en jeu on distingue: la chromatographie sur colonne la
chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou chromatographie sur couche
mince).

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3. Choix de la technique
Les différentes techniques sont complémentaires plutôt que concurrentes. Le choix de
l’une ou l’autre dépend :
1. de la nature du soluté : gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide,
macromolécule, espèce organique, polaire, ionique,…
2. du but de l’analyse : identification, contrôle de pureté, purification de produits
(colonnes préparatives), suivi de réaction en continu pour optimiser des paramètres, dosages,
quantification…
La chromatographie d’exclusion correspond à la séparation des molécules de masses
moléculaires supérieures à 2000 Échantillon de MM  2000 L’existence de structures
particulières dans la molécule exige l’utilisation de la chromatographie d’affinité.
La chromatographie en phase gazeuse convient aux molécules gazeuses ou
volatilisables. Chromatographie en phase supercritique utilisée pour séparer les molécules
thermolabiles et de masses moléculaires élevées.
Les méthodes électro-phorétiques conviennent aux molécules soumises à un champ
électrique.
4. Terminologie
Chromatogramme
Un chromatogramme est un diagramme montrant l’évolution du signal du détecteur
(par rapport à la concentration en soluté) en fonction du temps d’élution (plus rarement du
volume d’élution). Ce graphique est utilisé à la fois en analyse qualitative et quantitative.
 Analyse qualitative : permet l’identification des composés par la position du
pic
 Analyse quantitative : évaluer la concentration ou la masse d’un composé en
utilisant l’aire des pics.

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Elution
L’élution est l’entraînement d’un soluté à travers la phase stationnaire par le
mouvement de la phase mobile. En chromatographie liquide solide, la phase mobile peut être
appelée éluant.
Le temps mort
Le temps mot (tm) est le temps mis par un composé non retenu par la phase
stationnaire de la colonne, pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne (ou
temps mis par la phase mobile pour traverser la colonne).
Le temps de rétention
Le temps de rétention (tr) est le temps mis par les molécules d’un composé à analyser
(soluté) pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne. Le temps de rétention
est caractéristique d’une espèce pour des conditions d’analyse données et peuvent servir à
l’analyse qualitative. La surface et la hauteur d’un pic est fonction de la quantité du
constituant. Le temps de rétention est indépendant de la quantité d’échantillon injectée. Il est
fonction de la nature et la vitesse de la phase mobile.
Le temps de rétention réduit
Le temps de rétention réduit (tr’) représente le temps passé par le soluté dans la phase
stationnaire.

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Le volume de rétention
Connaissant le débit D de la phase mobile, supposé maintenu constant, on définit le
volume de rétention (Vr)
 u: vitesse linéaire moyenne de la phase mobile
 s : sélection droite de la colonne
 : Porosité de la phase stationnaire (0,75 pour la silice poreuse)
Etalonnage
Lors d'un étalonnage externe, on prépare une ou des solutions étalon(s) de
concentration(s) connue(s) en l'espèce que l'on veut analyser. On injecte la (les) solution(s) et
on note la valeur de la "réponse" (aires des pics du chromatogramme). On peut ainsi connaitre
le lien entre l'aire des pics et la concentration de la solution. Pour plus de précision on fait en
général une courbe d'étalonnage donnant la concentration des étalons en fonction de l'aire des
pics. Tu obtiens une droite dont tu peux avoir l'équation. On injecte alors la solution inconnue
à analyser et grâce à la courbe d'étalonnage (et de l'équation) on peut en déduire la
concentration recherchée.
Lors d'un étalonnage interne, on va ajouter dans chaque solution étalons la même quantité
d'un autre composé qui servira de référence. Cette fois on s'intéresse au rapport entre les aires
de l'espèce à analyser et de la référence. Cela permet de palier aux problèmes de non linéarité
entre l'air des pics et la concentration ainsi qu'au fait qu'à chaque injection ce n'est pas
toujours rigoureusement la même quantité qui est injectée. On trace également une courbe
d'étalonnage donnant la concentration des étalons en fonction du rapport aire du composé à
analyser/aire de la référence. On injecte ensuite la solution à analyser, à laquelle on ajoute
aussi la mémé quantité de référence, et grâce à la courbe d'étalonnage on peut en déduire la
concentration recherchée.

50
B. Chromatographie liquide classique
1. Chromatographie sur colonne
La chromatographie sur colonne est basée sur le même principe que
la chromatographie sur couche mince, sauf que la silice ne se trouve pas sur une plaque mais
dans une colonne. Cette technique est très utilisée dans la purification en chimie organique.
La séparation des composés est provoquée par l'écoulement continu d'un éluant passant dans
la colonne par gravité ou sous l'effet d'une faible pression. Les composés sont entraînés par
l’éluant à des vitesses différentes en fonction de leurs affinités avec la silice et avec l’éluant.
Ce procédé permet de séparer les différents composants d’un produit mais aussi de purifier le
produit d’une réaction.
2. Chromatographie sur couche mince
La chromatographie sur couche mince (CCM, en anglais TLC pour Thin layer
chromatography) est une technique de chromatographie planaire dont la phase mobile
est liquide. Elle est couramment utilisée pour séparer des composants dans un but d'analyse
(CCM analytique) ou de purification (CCM préparative). Elle comprend :
 une phase stationnaire : une couche mince de matériel adsorbant (usuellement
du gel de silice, de l'oxyde d'aluminium ou de la cellulose) ;
 une phase liquide, dite phase mobile ou éluant : un solvant ou un mélange de
solvants qui va entraîner les composés à se séparer le long de la phase
stationnaire.

51
Le phénomène d’adsorption est prépondérant (mais il y a également partage si le
solvant est un mélange) pour les phases stationnaires polaires. Dans le cas des phases
inverses, c'est-à-dire hydrophobes, c'est le phénomène de chromatographie de partage qui
prédomine.
3. Chromatographie sur papier
Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la ou des solutions à analyser
est déposée sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet échantillon
est adsorbé par le papier ; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce dernier et
qu'elles auront tendance à rester au même endroit.
Le papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant) comme un mélange
eau/éthanol et placé dans un récipient fermé. Pendant que le solvant (éluant) monte le long du
papier par capillarité, il rencontre l'échantillon et l'entraîne.
Les différentes substances constituant l'échantillon migrent à différentes vitesses selon
qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier.

52
C. La chromatographie en phase gazeuse (CPG)
Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme une
substance active solide ou liquide appelée phase stationnaire, puis il est transporté à travers
celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les différentes molécules du mélange vont
se séparer et sortir de la colonne les unes après les autres après un certain laps de temps qui
est fonction de l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules.

53
D. La chromatographie en phase liquide à haute
performance (HPLC)
L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelé phase mobile) dans
une colonne remplie d'une phase stationnaire de fine granulométrie (les « grains » sont de très
petite taille).
Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation
de la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les
composants le long de la phase stationnaire. La fine granulométrie de la phase stationnaire
permet une meilleure séparation des composants. Le seuil de détection est également plus bas.
La combinaison de ces attributs - rapidité et résolution élevées - conduit à l'appellation
« haute performance».
Les phases mobiles utilisées sont des mélanges d'eau et d'un solvant organique
miscible (acétonitrile, méthanol) ou des combinaisons de solvants organiques (alcools,
hexane, dichlorométhane...) miscibles entre eux.

54
3. Electrophorèse
1. Définition
L'électrophorèse est une technique séparative. Elle est utilisée le plus souvent dans un
but analytique mais également parfois pour purifier des molécules solubles. Elle a quelques
applications en chimie, mais est principalement utilisée en biochimie ou biologie
moléculaire pour la séparation des protéines ou des acides nucléiques. Elle n'est donc pas
adaptée à la séparation des lipides.
2. Principe
Le principe consiste à soumettre un mélange de molécules à un champ électrique ce
qui entraine la migration des molécules chargées. En fonction de différents paramètres
(charge, masse, forme, nature du support, conditions physico-chimiques) la vitesse de
migration va être variable, ce qui permet la séparation des différentes molécules.
Les cations (+) migrent vers la cathode (-) et les anions (-) se déplacent vers l'anode (+).
o Sur les acides nucléiques, les charges sont portées par les
groupements phosphate du squelette.
o Sur les protéines, la situation est plus complexe et il existe différents types de
groupements ionisables : La charge nette d'une protéine dépend donc en général de
sa composition en acides aminés et du pH.
 Ceux pouvant acquérir une charge négative :
-Les fonctions acide carboxylique (-COOH) de l'acide glutamique, de
l'acide aspartique et de l'extrémité C-terminale de la chaîne polypeptidique ;
-La fonction thiol (-SH) de la cystéine ;
-Les fonctions alcool (-OH) de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine.
 Ceux pouvant acquérir une charge positive :
-La fonction guanido de l'arginine ;
-La fonction imidazole de l'histidine ;

55
3. Types d’électrophorèses
3.1. L’électrophorèse libre en veine liquide
Selon Tisélius (1937), est réalisée dans un tube en U de section carrée (ceci afin de
pouvoir réaliser des mesures optiques au travers du tube, comme avec une cuve de
spectrophotomètre) : la séparation n'est pas totale, mais les frontières qui se forment sont
mises en évidence par des méthodes optiques (absorption UV, indice de réfraction,
fluorescence...). Cette méthode est utilisée en recherche pour mesurer la mobilité
électrophorétique et pour vérifier la pureté des protéines.
Si l'électrophorèse dite « libre », permet une bonne détermination des mobilités
électrophorétiques, elle présente par contre certains inconvénients : non seulement elle
nécessite un appareillage coûteux, une mise en œuvre longue et délicate, mais encore elle ne
permet pas de distinguer, d'isoler, ni de caractériser les fractions protéiques autrement que par
leur mobilité.
3.2. Electrophorèse de zone
A partir de 1950, on a proposé différents supports qui permettent d'effectuer une
électrophorèse de zone sur un support « stabilisateur » qui peut être le papier-filtre, l'acétate
de cellulose, ou encore le gel.
Ces supports ont connu un immense succès, car leur emploi est simple, rapide, peu
onéreux. En outre, il ne nécessite que de très petites quantités de substances. Ainsi, dans le cas
d'un sérum sanguin, quelques microlitres suffisent.

56
Quel que soit le support, on utilise une « cuve à électrophorèse » essentiellement
constituée de deux bacs contenant le tampon et une électrode. Anode et cathode sont reliées à
un générateur de courant continu. Les extrémités du support solide trempent dans le tampon
ou lui sont reliées par des ponts en papier filtre. Le support doit être homogène, poreux et
inerte (cette dernière condition n'est jamais totalement réalisée).
Selon le support on distingue :
Électrophorèse sur papier : Assez peu résolutive, cette technique d'électrophorèse est
surtout destinée à séparer des molécules de petite taille, dont les acides aminés. Des
phénomènes d'interférence liés à la charge des acides aminés et de la cellulose du papier
interviennent de façon notable. Une goutte de solution contenant l'échantillon à analyser est
déposée sur une bande de papier, puis séchée. La bande de papier est humidifiée avec un
tampon convenablement choisi, puis les deux extrémités de la bande sont plongées dans deux
réservoirs contenant le tampon. Chaque réservoir est connecté à une électrode. Un champ
électrique continu est appliqué, et les acides aminés se déplacent en fonction de leur charge
nette. En fin d'électrophorèse, la bande de papier est séchée puis les acides aminés sont
révélés par une réaction colorimétrique telle que celle à la ninhydrine (La ninhydrine possède
la particularité de former un produit coloré avec les acides aminés).

57
Électrophorèse sur acétate de cellulose : L'électrophorèse se fait dans des conditions
proches de celles de l'électrophorèse sur papier. Les bandes d'acétate de cellulose sont
fragiles, mais elles limitent la diffusion des molécules à séparer. La révélation des protéines se
fait également par une réaction colorimétrique (rouge de ponceau par exemple). Cette
technique, peu résolutive, permet de séparer grossièrement des groupes de protéines. Elle est
peu coûteuse et permet une analyse rapide des protéines sériques.
Électrophorèse sur gel d’amidon : L'électrophorèse sur gel d'amidon est particulièrement
utile à l'analyse et la séparation des isoenzymes. Le principe de la technique repose sur une
séparation électrophorétiques des protéines sur une matrice poreuse composée d'un gel
d'amidon, de pH précis. Les enzymes présentes sont détectées en incubant le gel dans une
solution contenant un substrat spécifique de l'enzyme donnant lieu à un produit coloré. Les
profils obtenus sont désignés sous le nom de zymogrammes.
Électrophorèse sur gel d' agarose : L' électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode
utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour séparer les protéines, l' ADN, l' ARN en
fonction de leurs poids moléculaires. Les molécules de plus petites tailles se déplacent plus
rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.

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Électrophorèse sur gel de polyacrylamide : (ou PAGE pour Poly-Acrylamide Gel
Electrophoresis): Les gels, formés entre deux plaques de verre, sont obtenus par
polymérisation d'un mélange d'acrylamide (CH2 = CH-CO-NH2) et de bisacrylamide (CH2 =
CH-CO-NH-CO-CH= CH2), ce qui aboutit à la formation d'un réseau réticulé. Les
concentrations en acrylamide et le ratio acrylamide/bisacrylamide déterminent la taille des
pores et donc les capacités résolutives du gel. Ces techniques peuvent être utilisées pour
séparer des protéines ou bien des acides nucléiques (de courte séquence en général) en
condition native ou dénaturante. L'électrophorèse est réalisée à l'aide d'un montage vertical,
les échantillons étant déposés dans des puits localisés au sommet du gel.
Pour les deux types de polymères, le gel peut se faire en conditions natives ou en
conditions dénaturantes (électrophorèse sur gel en gradient dénaturant). Dans ce second cas,
on ajoute un agent dénaturant dans le tampon : un détergent, le SDS pour la séparation des
protéines (on parle alors de SDS-PAGE), un agent chaotropique, l'urée, pour les acides
nucléiques.
Selon la technique on distingue :
Electrofocalisation (IEF — IsoElectric Focussing) :La migration est effectuée dans un
gradient de pH; chaque molécule migre jusqu'à l'endroit où le pH est égal à son pHi. On
utilise un gel de forte porosité (polyacrylamide ou agarose), pour que la taille n'influence pas
la migration. Le gradient de pH est généré par des ampholytes, molécules amphotères de
synthèse introduites dans le gel au moment de sa fabrication : on utilise un mélange de telles
molécules, possédant des pHi dans une certaine gamme (gamme large, ex. 3-9, ou ± étroite,
ex. 4-5 ou 5-6,5). Ces molécules migrent rapidement dans le gel jusqu'à atteindre une zone où
leur charge devient nulle. Elles ont alors une distribution statistique telle qu'elles génèrent un
gradient de pH sensiblement linéaire le long du gel. Il existe de telles molécules de petit poids
moléculaire et solubles (ampholines) et il existe également des gels à base d'acrylamide
modifiée contenant des groupements acides et basiques fixés (gels d'immobilines).
Electrophorèse bidimensionnelle : On sépare selon le pHi dans une dimension (IEF) et selon
la masse molaire dans l'autre dimension (PAGE-SDS); on sépare ainsi environ 1000 protéines
dans le sérum. On peut établir de cette manière la "carte d'identité protéique" des principaux
tissus et organes humains. La lecture nécessite alors un système informatisé d'analyse
d'images.

59
Immunoélectrophorèse : La révélation est basée sur une réaction "antigène-anticorps". On
mettra de côté l'immunoblot, qui consiste à visualiser des protéines sur un gel (la fixation d'Ac
étant révélée par un second anticorps marqué). Elle utilisele fait qu'à des concentrations
adéquates, du fait de la présence de familles d'anticorps (polyclonaux) et de la bivalence de
ces anticorps, il se forme des agrégats (= réaction d'immunoprécipitation. Ce précipité est
ensuite coloré selon les techniques classiques.
Electrophorèse capillaire : C'est une technique récente qui commence à se développer et qui
offre essentiellement les avantages de la rapidité, de la très grande résolution et, partant, de la
très grande sensibilité de la détection. L'électrophorèse utilise un capillaire de silice de
diamètre d'environ 50 µm et de longueur œ 1 m (rempli de tampon ou de gel), et des voltages
élevés (15-30 kV). Ceci aboutit à des vitesses de migration très rapides des composés dans le
capillaire et ceux-ci sont détectés par absorption UV, fluorimétrie ou conductimétrie
directement sur le capillaire, donc dans un volume très faible. Ceci fournit donc une
sensibilité particulièrement élevée (on injecte seulement quelques nanolitres de l’échantillon).
Les domaines d'application sont a priori nombreux : analyse de peptides, d'acides aminés,
d'oligonucléotides,… le nombre de plateaux est de l'ordre de 500000 par mètre, ce qui fournit
une résolution remarquable (on peut séparer des peptides différant d'un acide aminé, des
mélanges complexes d'oligonucléotides, des fragments tryptiques de peptides ; la méthode est
utilisée pour tester la pureté de peptides ou d'oligonucléotides de synthèse,…). La technique
peut également s'appliquer à des molécules non ionisées en présence de micelles de détergents
appropriés.

60
4. Emission à flamme et absorption atomique
1. Définition
La spectroscopie d’absorption (AAS) et d’émission atomique (AES) est probablement
la plus ancienne méthode analytique utilisée dans le monde. Elle inclut deux méthodes
d’analyse quantitative qui peuvent être utilisées pour mesurer les concentrations d’environ 70
éléments (métaux, métalloïdes et non-métaux). Le principe derrière ces méthodes d’analyse
d’éléments dépend des mesures faites dans un analyte qui est transformé sous la forme
d’atome libre (atomisation). Une fois que les atomes ne peuvent plus tourner ou vibrer comme
les molécules, dans ce cas seulement, des transitions électroniques ont lieu quand l’énergie est
absorbée. Parce que les transitions sont quantifiées, on obtient un spectre de lignes et les
éléments sont détectés par spectrométrie optique ou de masse.
2. Principe
Absorption atomique :
Cette technique se base sur l’absorption de la radiation monochromatique par un nuage
d’atomes. Les atomes dans l'état fondamental absorbent l’énergie dans une certaine longueur
d'onde produite par une source composée par les mêmes atomes à être analysé à partir d'une
source (lampe avec cathode creuse). Cette source produit une radiation électromagnétique
intense avec une longueur d’onde similaire à celle absorbée par les atomes. La sensibilité de
cette technique est proportionnelle au nombre d'atomes à l'état fondamental. Les composants
de base d’un instrument d’absorption atomique sont dans la figure suivante.

61
L'analyse des atomes ou des ions élémentaires est seulement possible dans un milieu
gazeux où les ions sont bien séparés. Par conséquent, le premier pas de l’absorption atomique
est le plus important et s'appelle l’atomisation, étape pendant laquelle un échantillon en
solution est transformé en vapeur atomique en utilisant une source de chaleur appropriée. La
solution de l’échantillon est chauffée dans l’instrument à une température entre 2000 et 3000
°C pour couper les liaisons chimiques, libérant les éléments et les transformant dans l’état
atomique gazeux.
Dans l'absorption atomique, la seule fonction de la source de chaleur est de convertir
l'échantillon en forme d'aérosol en vapeur atomique (atomisation). L'atomisation peut avoir
lieu en brûlant la solution qui contient l'échantillon dans une flamme (spectrométrie atomique
par flamme (AAS).
Emission atomique :
Les atomes de la substance à analyser dans la solution sont aspirés dans la région
de stimulation où ils sont dissous, vaporisés et atomisés par une flamme, une décharge, ou
un plasma. Ces sources d'atomisation haute température fournissent suffisamment d'énergie
pour propulser les atomes à de hauts niveaux d'énergie. Les atomes se désintègrent pour
retourner à des niveaux plus bas en émettant de la lumière.
Pour les atomes stimulés par la lumière, on emploie le nom de fluorescence atomique
(spectroscopie de fluorescence atomique).

62
La SEA employant une flamme, également appelée spectroscopie à émission de
flamme (SEF), est caractérisée par une mise en application largement répandue en analyse
élémentaire. Elle peut être utilisée à la fois pour l'analyse quantitative et qualitative, et c'est
une méthode à élément simple. Ses usages les plus importants portent sur la détermination
du sodium, du potassium, du lithium et du calcium dans les fluides et tissus biologiques.

63
5. Réfractométrie
1. Définition
Un réfractomètre est un appareil qui mesure l’indice de réfraction d'une substance, ce
qui permet d’analyser un échantillon liquide ou solide afin de déterminer son identité, sa
pureté ou sa concentration. C’est une invention qui date en fait de 1869.
Cette technique appelée la réfractométrie s'appuie sur un phénomène physique, la
lumière ne se déplace pas à la même vitesse suivant la substance qu'elle traverse. En effet
chaque échantillon pur ou mélange de substance possède un indice spécifique de réfraction de
la lumière, ce qui permet d'identifier, de quantifier cette substance.
2. Principe
Réfractomètre à prisme d'Abbe: Le prisme supérieur est éclairé et contient le rayon
rasant. La lumière entre dans le prisme inférieur en une plage de lumière dont le rayon
supérieur correspond au prolongement du rayon rasant. À la sortie du prisme, cette plage de
lumière est réfléchie par un miroir et est observée par une lunette colimatrice. L'utilisateur
peut observer, dans cette lunette, la plage de lumière et sa limite qui porte l'information sur
l'angle limite, donc sur l'indice de réfraction du liquide étudié.

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3. Intérêt
Les méthodes d'analyses modernes sont largement plus performantes que la
réfractométrie. Celle-ci n'est pertinente qu'en absence de disponibilité de ces méthodes
performantes, par exemple sur le terrain :
o En viticulture, la quantité de sucre dans le jus de raisin est déterminable par
réfractométrie. Elle est directement convertible en degré d'alcool après
fermentation totale. Cette technique s'étend à l'estimation du taux de sucre de
nombreux fruits et à l'étude de leur maturité.
o L'indice de réfraction d'une pierre fine, comme les gemmes, est une donnée
pertinente.
o La technique de réfractométrie directe est utilisable en ophtalmologie
o La méthode de Hackermann permettait d'analyser le lait (après traitement pour
en isoler le sérum) et en déduire s'il était opportun de l'utiliser pour en faire du
fromage.
4. Utilisation
1. Procédure d'étalonnage (si non étalonné d'usine) Rendre le prisme parfaitement
propre.
2. Déposer quelques gouttes de produit d'étalonnage fourni avec le réfractomètre.
3. Rabattre le volet sur le prisme, en exerçant une petite pression de façon que le produit
soit étalé de manière uniforme et sans bulles d'air.
4. Attendre quelques secondes que le produit soit à la même température que le prisme.
5. Exposer le réfractomètre à la lumière puis regarder à travers l'optique.
6. Noter l'indice de réfraction, si celui-ci n'est pas identique à l'indice du produit
d'étalonnage fourni dans la documentation ajuster avec la vis de réglage.

65
6. Polarimétrie
1. Définition
La polarimétrie est une technique expérimentale basée sur la mesure de la déviation du
plan de polarisation d'une lumière polarisée traversant une solution composée d'une ou de
plusieurs molécules chirales. Cette méthode n'est applicable qu'aux molécules optiquement
actives (chirales). Elle a été découverte par Biot en 1812 sur des cristaux puis en 1815 sur des
molécules organiques.
2. Principe
La lumière polarisée a été découverte par Malus en 1809. Une lumière "normale" est
composée d'un champ électrique et d'un champ électromagnétique : on parle aussi d'onde
électromagnétique. Limitons nous au champ électrique, celui auquel l'œil est sensible. Ce
champ peut prendre n'importe quelle direction. Dans une lumière polarisée, le champ
électrique est limité à une seule direction.
Une molécule chirale (asymétrique) possède la propriété de faire dévier le plan de
polarisation d'une lumière incidente polarisée. Il suffit donc de placer une solution contenant
la substance chirale entre les deux polaroïdes pour vérifier si celle-ci fait dévier le plan de
polarisation de la lumière.
Si c'est le cas, l'angle pour lequel on obtient l'extinction correspond à l'angle de
rotation propre à la substance chirale. La mesure de cet angle est donc une caractéristique de
la substance. Ceci est le principe du polarimètre.

66
3. Utilisation
1. Allumer l'appareil (attendre 5 min que la lampe soit chaude).
2. Placer un "blanc" (tube rempli de solvant) et étalonner l'appareil (zéro pour
l'équipénombre).
3. Placer ensuite le tube contenant la substance chirale et mesurer l'angle
correspondant à la zone de pénombre.
Remarque1. Le liquide à analyser doit être parfaitement limpide.
Remarque2. Aucune bulle d'air ne doit se trouver sur le passage du faisceau de
lumière.
4. Intérêt
C’est ainsi que dans les sucreries on mesure la concentration de sucre des betteraves
qui sont achetées. On paye les agriculteurs en fonction de cette contenance en sucre. Il existe
plusieurs variétés de tube de polarimétrie, avant (début 20ème siècle) ils étaient en cuivre. De
nos jours les tubes sont en verre, beaucoup plus petits et le processus est entièrement
automatisé. Le liquide entre par un côté et ressort de l’autre. C’est toujours une technique de
référence pour les sucreries. Système rapide et très fiable.

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Glossaire
HAP
La combustion incomplète de produits organiques entraîne la formation d'hydrocarbures
aromatiques polycycliques (HAP) dont certains sont des carcinogènes probables pour
l'homme. Les HAP se forment dans les aliments durant le processus de chauffage et de
séchage lorsque les produits de combustion entrent en contact direct avec l'aliment.
De grandes quantités d'HAP peuvent se retrouver dans les huiles raffinées. L'HAP peut en être
extrait par passage sur charbon actif. Une autre source possible de HAP est le dépôt de
pollutions marines sur les poissons et fruits de mer. Il existe pour certaines denrées
alimentaires une limite maximale pour l'un des HAP les plus toxiques : le benzopyrène.
Depuis le 1/7/2012, une norme est également d'application pour la somme de 4 HAP :
benzopyrène, benzanthracène, benzofluoranthène et chrysène.
Dioxines, PCB de type dioxine et PCB marqueurs
Les PCB et les dioxines sont des substances pouvant avoir un effet cancérigène. Les dioxines
constituent une famille de composés (ou congénères) possédant des propriétés physico-
chimiques équivalentes. Outre les « véritables » dioxines (polychlorodibenzodioxines ou
PCDD), ce groupe comprend aussi les furanes (polychlorodibenzofuranes ou PCDF) et les
polychlorobiphényles (PCB) de type dioxine. Tous ces composés sont lipophiles (ils se
dissolvent dans les graisses), chimiquement et physiquement très stables et peu
biodégradables. De ce fait, ils s’accumulent dans la graisse des animaux et de l’homme. Les
non-conformités éventuelles sont dès lors le plus souvent constatées dans des produits
d’origine animale. Les dioxines n'ont pas d’usage technique ou autre : elles sont le sous-
produit involontaire et souvent inévitable issu de certains processus thermiques et industriels.
La production et la transformation des métaux, l'incinération des déchets et les feux
domestiques constituent d’importantes sources de dioxine ayant pour origine l’activité
humaine.
Les PCB trouvent leur origine dans les activités humaines. Ils ont été utilisés pendant des
décennies dans diverses applications industrielles, telles que le liquide de refroidissement des
transformateurs électriques, des pigments, peintures,... Ils ont été utilisés non comme
congénère individuel, mais sous la forme de mélanges complexes. L’utilisation des PCB est

68
actuellement interdite dans l'UE. La prévention et la réduction de l'exposition humaine
s’opère d’une part en s’attaquant aux sources, par exemple en gardant sous contrôle des
processus industriels, en prenant des mesures qui limitent ou éliminent l’émission, … et
également en éliminant les produits contaminés de la chaîne alimentaire. Bien que l'utilisation
des PCB soit interdite, ils peuvent encore se retrouver par exemple dans de vieilles
installations électriques. Un traitement adapté des déchets est dès lors particulièrement
important.
MALDI-TOF
Un instrument de type MALDI-TOF (en anglais Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
- Time of Flight) est un spectromètre de masse couplant une source d'ionisation laser assistée
par une matrice (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) et un analyseur à
temps de vol (TOF, time-of-flight mass spectrometry).
Limite de détection
La plus petite concentration d'une substance recherchée qui peut être détectée selon une
méthode d'analyse donnée avec un degré de certitude spécifié.
Limite de dosage
La plus petite concentration d'une substance recherchée qui peut être mesurée selon une
méthode d'analyse donnée avec un degré de certitude spécifié.
Valeur cibe de l'écart-type
Valeur numérique de l'écart-type d'un résultat de mesurage, qui a été désignée comme objectif
pour la qualité du mesurage.
ppm
La partie par million (le ppm), terme beaucoup utilisé en sciences (toxicologie, formulation,
chimie, métallurgie, électronique, géochimie, etc. ), est la fraction valant 10–6, c'est-à-dire un
millionième. On utilise surtout le ppm pour exprimer une fraction massique (1 ppm = 1 mg/kg
).

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