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antioxidant and antimicrobial activities of medicinal plant
- 1. Université Ferhat Abbas - Sétif Département de Biochimie Mémoire de Magister Présenté par : HARRAR Abdenassar Encadré par : Dr. BELHATTAB Rachid 2011-2012 Activités antioxydante et antimicrobienne d’extraits de Rhamnus alaternus L. harrar_abdelnacer@hotmail.fr https://www.researchgate.net/profile/Abdenassar_Harrar
- 4. Plantes médicinales Nouveaux médicaments Matière végétale Molécules bioactives PharmacieCosmétologieIndustrie alimentaire
- 5. Molécules bioactives Les polyphénols Acides phénoliques Flavonoïdes Tannins Vertus thérapeutiques Cancers Maladies cardio-vasculaires Peroxydation lipidique Attaques microbiennes Stresse oxydant Infections microbiennes
- 7. Espèces réactives de l’oxygène (ROS) Radicalaires Non radicalaires Radiations UV Pollution Tabac Exercices physiques Médicaments Réactifs chimiques Electron non apparié Très réactifs Neutraliser ou réduire Radical libre Antioxydant
- 8. Infections bactériennes Usage des antibiotiques Thérapeutique La prescription Inappropriée de ces agents Souches multi-résistantes Nouveaux médicaments à base des plantes Cependant
- 9. l’évaluation des propriétés phytopharmaceutiques antioxydante antimicrobienne Une tache très intéressante et utile Les plantes
- 10. Rhamnus alaternus Arbuste toujours vert Certains auteurs de pays méditerranéens ont entrepris des études limitées A notre connaissance cette espèce végétale n’a pas fait l’objet d’études antérieures En Algérie L’objectif de notre étude D’estimer la teneur en ces composés actifs essentiels (les polyphénols) Obtenus dans les différentes parties de la plante Evaluer leur pouvoir biologique Antioxydante Antimicrobienne Classification Famille Genre Sous genre Rhmanus alaternus Sous espèce Rhamnaceae Reynosia Rhamnus Espèce R. alaternus eu-alaternus Maire Nomenclature En Arabe Am’lile’ce ou Oud El-khir En anglais Buckthorn. En Français Nerprun En Espagnol Aladierna En Italien Alaterno
- 11. Usage traditionnel Digestif Diurétique Hypotensif Traitement des compilations Hépatiques Dermatologiques Laxatif
- 12. Composition biochimique L’étude phyto-chimique Anthraquinones coumarines Tannins Flavonoïdes R O O HO OH OH CH 3 R = H Emodine R = OH Alaternine R O O HO OH OH CH 3 R = H Physcion R = OH Chrysophanol
- 16. Préparation des extraits Extrait aqueux Décoction Partie aérienne Racines20 g 500 ml H2O 20 g 20 g Pendant 10 min 500 ml H2O 20 g Laissée reposer pendant 15 min Filtration Etuve Aliquotes du filtrat 24 h 40 °C
- 17. Extrait méthanolique de la partie aérienne Macération 200 ml Méthanol 50 g Maximum d’agitation 24 h T° ambiante 200 ml Méthanol 50 g Filtration Marc L’opération est répétée une fois Evaporateur rotatif Evaporation à sec T° 40 - 50 °C FiltratFiltrat
- 18. Extrait méthanolique des racines Extraction au Soxhlet 50 g Cartouche 6 cycles Evaporateur rotatif Méthanol T° d’évaporation 40 °C
- 19. EATF EAR EMR EMTF 6 8 10 11 Rendements des extraits (% m/m) EMTF : Extrait méthanolique tiges et feuilles EMR : Extrait méthanolique des racines EAR : Extrait aqueux des racines EATF : Extrait aqueux tiges et feuilles
- 20. Dosage des polyphénols Méthode du Folin-Ciocalteu (polyphénols totaux) Extrait 20 µl H2O distillée 1,58 ml Réactif de Folin-Ciocalteu 100 µl Agiter vigoureusement Laisser agir 6 min Na 2CO 3 (7.5%) 300 µl 2 heures d’incubation T° ambiante Abri de la lumière Bleu Taux des PPT 760 nm y = 0,0031 x - 0,0898 R² = 0,9803 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 50 100 150 200 250 Absorbanceà760nm Concentration d'acide caféique en µg/ml Droite d’étalonnage de l’acide caféique
- 21. EMTF EMR EAR EATF 7 7 19 36 Teneurs en PPT des quatre extraits en mg EAC/g de MF
- 22. Dosage des flavonoïdes totaux Extrait 1 ml AlCl 3 à 2 % 1 ml 15 min d’incubation Abri de la lumièreT° ambiante Jaune Taux des Flavonoïdes 430 nm y = 0.0344x + 0.0181 R² = 0.9992 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 10 20 30 40 50 Absorbanceà430nm Concentration de la quercétine en µg/ml Droite d’étalonnage de la quercétine
- 23. Teneurs en flavonoïdes des quatre extraits en mg EQ/g de MF EMR EMTF EAR EATF 5 6 14 18
- 24. Dosage des flavones et flavonols Extrait AlCl 3 à 10 % Ethanol CH 3 COONa H2O distillée 0,5 ml 1,5 ml 0,1 ml 0,1 ml 2,8 ml 30 min d’incubation 415 nm Abri de la lumière T° ambiante y = 0.0066x - 0.004 R² = 0.9991 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 20 40 60 80 100 120 Absorbanceà415nm Concentration de la quercétine en µg/ml Droite d’étalonnage de la quercétine
- 25. EMR EMTF EAR EATF 2 2 6 7 Teneurs en flavones et flavonols des quatre extraits en mg EQ/g de MF
- 26. Activité antioxydante et anti radicalaire Test au DPPH Extrait DPPH . 0,06 mM 1 ml 1 ml 30 min d’incubation Abri de la lumière T° ambiante DPPH réduit 517 nm y = 0,5245x + 22,558 R² = 0,9897 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 20 40 60 80 100 120 %d'inhibition Concentration µg/ml Variation de l’inhibition du DPPH en fonction de la concentration de l’extrait EMR 52 µg/ml y = 0,7412x + 1,3096 R² = 0,9712 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 20 40 60 80 100 120 %d'inhibition Concentration µg/ml Variation de l’inhibition du DPPH en fonction de la concentration de l’extrait EAR 66 µg/ml
- 27. y = 0,7588x + 0,3076 R² = 0,9997 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 20 40 60 80 100 120 %d'inhibition Concentration µg/ml Variation de l’inhibition du DPPH en fonction de la concentration de l’extrait EATF 66 µg/ml y = 0,4475x + 18,405 R² = 0,9993 0 10 20 30 40 50 60 70 0 20 40 60 80 100 120 %d'inhibition Concentration µg/ml Variation de l’inhibition du DPPH en fonction de la concentration de l’extrait EMTF 71 µg/ml y = 0.7047x + 23.736 R² = 0.9951 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 120 %d'inhibition Concentration µg/ml Variation de l’inhibition du DPPH en fonction de la concentration de BHT 37 µg/ml
- 28. BHT EMR EATF EAR EMTF 37 52 66 66 71 Activité anti-radicalaire des extraits Valeurs des IC 50
- 29. Test de blanchissement du β- carotene LOOH Acide linoléique β-carotène O2 LOO Radical peroxyl β-carotèneLOOH Acide linoléique O2 LOO Radical peroxyl LOOH Acide linoléique β-carotène Extrait Test qualitatif Test quantitatif Visuel sur gélose spectrophotomètre = 470 nm 470 nm
- 30. Test visuel sur gélose 30 µl 50 µl 20 µl 10 µl 40 µl EAR 30 µl 50 µl 20 µl 10 µl 40 µl EATF 10 µl 20 µl 30 µl 50 µl 40 µl EMR EMTF 30 µl 50 µl 20 µl 10 µl 40 µl Quercétine, BHT et éthanol BHT 50 µl BHT 30 µl Ethanol Quercétine 30 µl Quercétine 50 µl Augmentation du diamètre en fonction de la dose Halos de rétention de couleur
- 31. Diamètres en mm des halos de rétention de couleur dans le cas du dépôt de 50 µl des extraits 25 27 28 32 37 38
- 32. Test quantitatif : spectrophotomètre = 470 nm 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 10 20 30 40 50 60 Absorbanceà470nm Temps (h) EATF EAR EMTF EMR BHT (c+) (c-) Cinétique de blanchissement du β- carotène à 470 nm en absence et en présence des extraits de R. alaternus et du BHT Extraits - Antioxydant ou Extrait BHT
- 33. C (-) EATF EAR EMR EMTF BHT 16% 72% 79% 82% 82% 95% Activité anti-oxydante relative des extraits de R. alaternus et BHT après 48 h
- 34. Activité antimicrobienne Méthode de diffusion des disques sur un milieu gélosés solides Mueller – Hinton (Bactéries) Sabouraud (les champignon) Bactéries à Gram + bactéries à Gram – Lysteria monocytogenes ATCC 15313 Enterococcus faecalis ATCC 49452 Bacillus cereus ATCC 10876 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Acinetobacter baumanii ATCC 19606 Citrobacter freundii ATCC 8090 Salmonella typhimurium ATCC 13311 Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Proteus mirabilis ATCC 35659 Les champignons Aspergillus flavus Asperagillus niger Candida albicans
- 35. Les souches bactériennes Repiquage dans la gélose nutritive Incubées à 37°C Pendant 24 h Colonies bien isolées10 ml d’eau distillée stérile Dilution 0.5 Mc Farland ou DO de 0.08 à 0.10 à 625 nm Ensemencement Incubation pendant 18 à 24 heures à 37°C Diamètres des halos d’inhibitions Lecture des antibiogrammes Les champignons activés pendant 7 jours à T° de 28°C La lecture des antibiogrammes est faite après 72 heures d’incubation à 28°C
- 36. Zones d’inhibition obtenues avec les bactéries sensibles au EMR de R. alaternus Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Klebsiella pneumoniae
- 37. CMI et CMB exprimées pour l’extrait EMR sur les souches testées en mg/ml Souches Extraits Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomona s aeruginosa ATCC 27853 Staphylococc us aureus ATCC 25923 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Lysteria monocytogen es ATCC 15313 EMR CMI = 6,25 CMB = 12,5 CMI = 0,195 CMB = 25 CMI = 6,25 CMB = 12,5 CMI = 6,25 CMB = 100 CMI = 6,25 CMB = 12,5
- 38. Conclusion Les quatre extraits présentent des quantités importantes en polyphénols, une quantité considérable de flavonoïdes, cette plante est riche en flavonoïdes de types flavones et flavonols. Les extraits de R. alaternus possèdent une bonne activité antioxydant et antiradicalaire. Les extraits de R. alaternus ont une action faible sur les champignons et relativement faible sur les bactéries testées.
- 39. Perspectives Faire une étude biochimique sur les fruits de Rhamnus alaternus. Développer des médicaments antiradicalaires à base de plantes, doués d’une activité antioxydante. Déterminer de nouvelles substances bioactives naturelles pourront répondre aux différents problèmes de la santé et d’être un alternatif des médicaments synthétiques.
Notes de l'éditeur
- Messieurs les jurys, honorable assistance essalamou alaikoum et permettez-moi de vous présenter mon sujet intitulé