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Soutenance de Thèse en vue de l’obtention du diplôme de Doctorat/Ph.D en Biochimie
Laboratoire de Biochimie des Plantes Médicinales, des Sciences Alimentaires et
Nutrition (LABPMAN)
UNIVERSITE DE DSCHANG FACULTE DES SCIENCES
THEME
Evaluation des activités anticancéreuses de quelques
plantes utilisées dans le Département de la Vina
(Adamaoua-Cameroun)
2
Plan
Introduction
I- Inventaire des plantes médicinales et évaluation du
potentiel anticancéreux des plus citées
II- Evaluation de l’impact du fractionnement sur l’activité
anticancéreuse des extraits choisis et caractérisation du
mode d’action des fractions les plus actives
III- Evaluation de l’effet du traitement par les fractions
les plus actives sur le stress induit par le naphtalène chez
le rat
Conclusion et perspectives
Introduction
3
Facteurs Chimiques:
Tabac, Alcool, arsenic,
amiante, hydrocarbures
aromatiques…
Facteurs Physiques
Rayon X, UV, Radioactivité…
Facteur Viral
Epstein Barr, V. Hépatite B ou C,
Herpès Virus, Papilloma Virus…
Facteur génétique
Facteurs endogènes
4
Introduction
Relation entre stress et cancer
Stress oxydatif
5
En 2012 Incidence = 14 millions (OMS, 2014)
Sur la même période, les décès devraient passer
d’environ 8,2 millions à 13 millions par an (OMS, 2014 ;
Globocan, 2012 ; Enow et al., 2012)
Introduction
Au Cameroun, l’incidence annuelle est de 15 000
Prévalence estimée à 25 000 malades (OMS, 2014 ;
Enow et al., 2012)
Age moyen des patients au diagnostic est de 45 ans
Plus de 80% des cas sont diagnostiqués tardivement
6
Les progrès réalisés pour guérir le cancer sont indéniables
Thérapie génique Ciblée
Immunothérapie
Chirurgie
Radiothérapie
Hormonothérapie
Chimiothérapie
Traitements localisés
Traitements systémiques
Introduction
7
Introduction
Vomissements Effets secondaires
Pertes de cheveux
Il est unanimement avéré qu’au Cameroun, la plupart des malades n’ont accès ni
à un diagnostic précoce, ni au traitement moderne
Ceux qui peuvent suivre un traitement moderne font face
Mort de certaines
cellules
La difficulté d’accéder facilement à un traitement efficace motive certains patients à
faire recours à la phytothérapie
8
Introduction
C’est dans ce même contexte que s’inscrit ce présent travail
Exploitation des
pharmacopées
traditionnelles
Base de bien de progrès dans les traitements du cancer
Cas de la Vincristine et de la Vinblastine
Kueté et al. (2012, 2013, 2014,
2015), Tamokou et al. (2013)
Travaux sur certaines plantes des Régions de
l’Ouest, du Littoral et du Nord-Ouest.
Possibilité de fabrication des phytomédicaments.
9
Le criblage des plantes des Régions du Cameroun où la flore reste encore peu
exploitée quant aux plantes ayant une activité anticancéreuse pourrait ouvrir des
perspectives nouvelles dans le combat contre le cancer.
Certaines plantes médicinales de ces régions contiendraient des constituants qui outre
leur effet antiprolifératif, pourraient neutraliser l’excès de radicaux libres lié à une
intense prolifération.
Hypothèses
10
Etudier les propriétés antiprolifératives et antioxydantes des extraits
de quelques plantes médicinales traditionnellement utilisées dans le
Département de la Vina.
Objectif général
11
 Inventorier les plantes médicinales utilisées dans le Département de la vina contre
le cancer, puis évaluer le potentiel antiprolifératif des plus citées ainsi que l’activité
antioxydante in vitro de celles-ci
Objectifs Spécifiques
 Evaluer l’impact du fractionnement des extraits choisis sur l’activité
anticancéreuse puis caractériser le mode d’action des fractions les plus
actives tout en recherchant leurs principes actifs grâce à une purification bio-
guidée
 Etudier l’effet du traitement par certaines fractions actives sur un stress induit
par le naphtalène chez le rat
12
Partie 1
Inventaire des plantes médicinales et évaluation du
potentiel anticancéreux des plus citées
13
Enquête ethnopharmacologique
14
Fiche d’enquête
Espèce de plante et les parties utilisées dans le traitement
du cancer
Méthode de préparation de l’extrait et le solvant utilisé
Autres usages traditionnels des espèces citées
Enquête ethnopharmacologique
15
Enquête
Les phytothérapeutes rencontrés assimilaient le cancer à
la plante parasite appelée Gui d’Afrique
L’étude a montré que ces phytothérapeutes prescrivaient
différents modes de préparation des potions aux patients
Les entretiens se sont déroulés dans l’ensemble en langue
locale (Fufulde). Toutes les espèces végétales recensées
ont été récoltées, puis identifiées.
Des 23 espèces obtenues, 12 ont été retenues pour la suite de nos travaux
Enquête ethnopharmacologique
16
Ekebergia senegalensis Ziziphus mauritiana
Eremomastax speciosa Cissus populnea
Enquête ethnopharmacologique
17
Costus spectabilis Protea elliotii
Vitellaria paradoxa Senna siamea
Enquête ethnopharmacologique
18
Terminalia macroptera Centella asiatica
Lannea kerstingii Gardenia aqualla
Enquête ethnopharmacologique
19
Prélèvement des parties ciblées de chaque plante
Broyage jusqu’à l’obtention de fines poudres
Après chaque 24 heures, le mélange obtenu a été filtré et le
filtrat obtenu a été concentré dans un évaporateur rotatif
Nettoyage et séchage à température ambiante
1000 g de chaque poudre ont été mis à macérer à
température ambiante dans 3 L de méthanol
Les extraits résultant ont été séchés et les poudres obtenues
ont été conservées jusqu’à leur utilisation.
Préparation des extraits
20
Extrait Classes de métabolites
Alcaloïdes Flavonoïdes Anthraquinones Tanins Triterpènes Saponines
Senna siamea + + + + + +
Centella asiatica + + + + + +
Cissus populnea + + + + + +
Costus spectabilis + + + + + +
Ekebergia senegalensis + + + + + -
Eremomastax speciosa + + - + + +
Gardenia aqualla + + + + + +
Lannea kerstingii + + + + + -
Protea elliotii + + - + + +
Terminalia macroptera + + + + + +
Vitellaria paradoxa - + + + + -
Ziziphus mauritiana + + + + + +
Les travaux de laboratoire, guidés par les usages vernaculaires ont pour but de constater le bien-fondé de l’usage d’une plante donnée
TABLEAU 1.1: Composition phytochimique des
extraits
21
Evaluation du potentiel antiprolifératif
des extraits de plantes sélectionnées
22
NCI-H460
MCF-7 PC3 HeLa 3T3
LIGNEES CELLULAIRESMatériel et méthodes
23
Matériel et méthodes
24
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
.
Milieu de culture + extrait de plante (ou anticancéreux de référence)
Milieu de culture + cellule + extrait de plante (ou anticancéreux de référence)
Milieu de culture + cellule + RPMI
RMPI
Matériel et méthodes
25
.
Fixation des protéines par le TCA
Rinçage 5 fois avec le PBS
Ajout de 100µL de sulforhodamine B + 5
Rinçages avec l’acide acétique 1%
Ajout de 100µL de tampon Tris + agitation
pendant 5 mins
Mesure de l’absorbance de chaque puits à
515 nm
Matériel et méthodes
26
Matériel et méthodes
Paramètres
antiprolifératifs
% croissance= [(E - Z) / (C - Z)] x 100
La CI50 (concentration d'extrait qui inhibe 50 %
de la croissance cellulaire)
% inhibition = 100 - % Croissance
27
Tableau 1.2: Effets des extraits de plantes
sélectionnées sur la prolifération Cellulaire
Extrait
Activité antiproliférative CI50 (µg/mL)
NCI H460 MCF-7 PC3 HeLa 3T3
Lannea kerstingii >250 >250 >100 >100 >250
Cissus populnea >100 >100 >100 >100 >100
Centella asiatica >250 47,00±1,60*** 45,00±0,81*** >100 >250
Gardenia aqualla >100 87,00± 0,73*** 97,00± 0,88*** >100 >100
Senna siamea 87,00±1,60*** 97,00±1,30*** >100 >100 >100
Eremomastax speciosa 98,00 ±0,77*** 44,00±0,77*** >100 >100 >250
Costus spectabilis 13,00±0,80*** 20,00 ±0,80*** 22,50±0,81*** 10,30±0,26*** 6,72±0,05***
Ekebergia senegalensis 20,00 ± 0,04*** 13,50± 1,04*** 16,18±1,34*** 17,86±0,74*** 28,84±0,10***
Protea elliotii 24,44±0,90*** 87,00 ±1,22*** 47,00±1,33*** 66,46±0,37*** 81,6± 0,70***
Terminalia macroptera 31,00±1,50*** 31,00±1,50*** 42,37±0,31*** 68,46±018*** 64,42±1,30***
Vitellaria pradoxa 27,00±0,90*** 27,00±0,90*** 67,00±0,09*** 66,46±0,37*** 30,67±0,50***
Ziziphus mauritiana 16,00±0,59*** 29,00±0,90*** 39,87±0,19*** 37,10±0,47*** 42,53±0,48***
Doxorubicine 0,02± 0,001 0,22 ±0,053 0,29±0,120 0,62 ±0,150 0,70 ±0,19
Résultats et discussion
***P < 0,001 par rapport à la substance de référence (Doxorubicine)
28
L’effet antiprolifératif présenté par certains des extraits peut être lié à leur richesse en
métabolites secondaires
Les variations observées au niveau de l’efficacité pourraient être attribuées soit à la
constitution génétique des différentes lignées cellulaires considérées
L’absence d’activité observée pourrait être attribuée: Manque de connaissances
spécifiques sur le cancer
Le composé présent dans ces extraits pouvait avoir besoin d’une transformation
métabolique in vivo, nécessaire à son activation
Résultats et discussion
29
Tableau 1.3 : Indices de sélectivité des
extraits de plantes sélectionnées
Extraits de : NCI-H460 MCF-7 PC3 HeLa
Lannea kerstingii / / / /
Cissus populnea / / / /
Centella asiatica / / / /
Gardenia aqualla / / / /
Senna siamea / / / /
Eremomastax speciosa / / / /
Costus spectabilis 0,51 0,33 0,29 0,65
Ekebergia senegalensis 1,44 2,13 1,77 1,61
Protea elliotii 3,33 0,93 1,73 1,22
Terminalia macroptera 2,07 2,68 1,52 0,94
Vitellaria paradoxa 1,13 1,27 0,45 0,46
Ziziphus mauritiana 2,65 1,46 1,14 1,06
Doxorubicine 35,00 3,00 2,41 1,12
Résultats et discussion
30
Un extrait antiprolifératif et antioxydant permettrait de combattre efficacement le
stress oxydatif chez le patient.
Production du
monoxyde d’azote
Rôle majeur dans la physiologie cellulaire (Valko et al.,
2007)
Sa forte concentration observée devient délétère pour les
cellules
31
Evaluation du potentiel antioxydant in vitro
des extraits de plantes sélectionnées
5 μL des solutions d’extraits ou de solution d’acide gallique
95 μL d’une solution éthanolique de DPPH
Incubation pendant 30 min à l’obscurité
L’absorbance a été mesurée à 515 nm
% d’activité = [(Abs Contrôle–Abs échantillon) / Abs Contrôle] x100
32
Evaluation du potentiel antioxydant des extraits de
plantes sélectionnées: potentiel anti-DPPH
Matériel et méthodes
(Kumari, 2013)
Le potentiel anti-NO : Hemayet
et al. (2012)
Chélation du fer: Le et al.
(2007)
150 µL (Extrait + tampon +
nitroprussiate de sodium )
150 minutes d’incubation à 25 ° C
50 µL de réactif d'acide sulphanalique
50 µL de N-(1-naphtyl) éthylène
diamine
L’absorbance a été mesurée à 546 nm
% d’activité anti-radicalaire = [(Abs
Contrôle–Abs échantillon) / Abs Contrôle] x100
100 μL (5 µL d’extrait +35 µL de
FeCl2 +60 µL de Ferrozine).
agité à 25 °C pendant 10 min
L’absorbance a été mesurée à 562
nm
% d’activité chélatrice= [(Abs Contrôle–
Abs échantillon) / Abs Contrôle] x100
33
Evaluation du potentiel antioxydant des extraits de
plantes sélectionnées
Matériel et méthodes
34
Tableau 1.4: Activité anti-DPPH et anti-NO des
extraits de plantes sélectionnées
Extrait de:
Test anti oxydant
DPPH CI50 (µg/mL) NO CI50 (µg/mL)
Centella asiatica ND ND
Costus spectabilis ND /
Eremomastax speciosa 454,00±2,54** /
Senna siamea 236,70±3,80** ND
Gardenia aqualla 105,90±2,10** 278,00±1,56**
Lannea kerstingii 34,4±2,20** 253,00±2,00**
Ekebergia senegalensis 15,83±0,40** 299,00±3,00**
Protea elliotii 14,20±0,27** 306,00±2,50**
Cissus populnea 15,72±1,20** 409,00±2,00**
Terminalia macroptera 19,90±0,70* 205,00±0,90
Vitellaria paradoxa 22,14±0,39 290,00±2,04**
Ziziphus mauritiana 19,05±0,5* 361,00 ±3,00**
Substance de référence 22,67±0,40 108,00±2,00
Résultats et discussion
35
Figure 1.1: Chélation du fer par les extraits de
plantes sélectionnées
Il est connu que les composés phénoliques à l’instar des flavonoïdes peuvent fonctionner comme capteurs de radicaux libres,
agents complexant des pro-oxydants, des métaux et des agents réducteurs d’espèces réactives de l’oxygène, ce qui protège le
corps contre les maladies métaboliques telles que le cancer (Geronikaki et al., 2013)
Seuls les extraits de Cissus populnea, Ekebergia senegalensis, Protea elliotii et Ziziphus mauritiana semblent
présenter l’activité chélatrice importante
*
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0
20
40
60
80
100
Pourcentaged'activité
ChélatriceduFe2+(%)
Extraits de plantes et substance de référence
Résultats et discussion
**P < 0,01 par rapport à la substance de référence (EDTA) avec le test de Dunnet
36
Partie 2
Fractionnement des extraits, caractérisation du
mode d’action des fractions les plus actives et
recherche bio-guidée des principes actifs
37
Extraits
choisis
Ziziphus mauritiana
Protea elliotii
Ekebergia senegalensis
Matériel et méthodes
38
Figure 2.1: Partitionnement des extraits
F-MoH (28,71 g)
F-BuOH (15,39g) Résidu Aqueux
Séchage à 40°C
1,5 L BuOH (3 fois)
F-Ac (12,10 g) Résidu Aqueux
1,5 L ETO AC (6 fois)
F-DCM (10,74g) Résidu Aqueux
Extrait au méthanol de Ziziphus mauritiana (150g) + solubilisation dans
500 ml d’eau distillée
F-Hex (1,2mg) Résidu Aqueux
1,5 L DCM (6 fois)
1,5 L Hexane (6 fois)
Matériel et méthodes
39
Tableau 2.1: Activité antioxydante des fractions de
plantes sélectionnées
Nom de la plante Fraction testée Activité antioxydante (DPPH)
% d’activité à
500µg/mL CI50 µg/mL
Ekebergia
senegalensis
Hexane NA N A
Dichlorométhane 61,81±1,50** 366,60±2,90**
Acétate d’éthyle 95,45±1,90 14,00±0,20**
n-Butanol 94,63±0,30** 19,12±0,50*
Méthanol 93,41±0,80** 20,16±1,30
Protea elliotii Hexane 91,92±1,23** 122,00±4,30**
Dichlorométhane 92,74±0,90** 104,30±1,80**
Acétate d’éthyle 94,64±2,01** 24,10±0,18
n-Butanol 94,71±1,44** 16,50±0,70**
Méthanol 96,05±0,79 15,30±0,20**
Ziziphus mauritiana Hexane 39,00±1,33** N D
Dichlorométhane 60,62±2,30** 274,70±3,75**
Acétate d’éthyle 95,41±1,55 14,6±0,29**
n-Butanol 96,66±0,66 16,70±0,40**
Méthanol 93,51±1,11** 17,00±0,80**
Acide gallique 96,67±0,80 22,67±0,40
Résultats et discussion
40
Tableau 2.2: Effets des fractions de plantes
sélectionnées sur la prolifération cellulaire
Plantes Fraction testée Activité anticancéreuse CI50 (µg/mL)
NCI-H460 MCF-7 3T3
Ekebergia
senegalensis
Hexane 30,00± 0,10*** 10,00± 0,80*** 45,00 ± 0,22***
Dichlorométhane 12,00 ± 0,50*** 19,00 ±0,90*** 32,00 ± 0,15***
Acétate d’éthyle 30,00±1,66*** 25,00±1,33*** 40,00±1,88***
n-Butanol 32,00±0,37*** 40,00±0,77*** 52,00±0,31****
Méthanol 44,00±0,74*** 34,00±0,44*** 44,00±0,54***
Proteaelliotii
Hexane >100 >100 >100
Dichlorométhane 3,50±0,18*** 10,00 ±0,55*** 50,00 ±0,12***
Acétate d’éthyle 70,00±0,26*** 60,00±0,46*** 80,00±0,86***
n-Butanol 13,00±0,47*** 15,00±0,37*** 55,00±0,76***
Méthanol 12,00±0,10*** 92,00±0,80*** 48,00±0,50***
Ziziphus
mauritiana
Hexane 18,00±0,09*** 96,00 ±0,01*** 66,00±0,93***
Dichlorométhane 3,80±0,50*** 5,00±0,88*** 54,00 ±0,99***
Acétate d’éthyle 20,00±1,11*** 16,00± 2,17*** 46,00±1,44***
n-Butanol 18,00±0,05*** 21,00±0, 60*** 36,00±0,36***
Méthanol 16,00±0,48*** 27,00±0,72*** 52,00 ± 0,25***
Standard Doxorubicine 0,02± 0,001 0,22 ±0,05 0,70 ±0,19
Résultats et discussion
41
Formation de la mono-couche
(24h)
Ajout des fractions et
medicament standard (48h)
Trypsinisation + 1ml de milieu de
culture
Centrifugation dans le tampon
phosphate
Ajout de l’éthanol à 4°C
Rnase (30min) + Iodure de
propidium (30min)
42
Evaluation de l’effet des fractions les plus actives
sur le cycle cellulaire
Matériel et méthodes
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0
10
20
30
40
50
60
70
PourcentagedeCellules(%)
G0/G1 S G2/M
Contrôle 1 µg/mL 3,5 µg/mL 25 µg/mL Doxorubicine
Traitement
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0
10
20
30
40
50
60
70
Pourcentagedecellules(%)
G0/G1 S G2/M
Contrôle 1 µg/mL 5 µg/mL 25 µg/mL Doxorubicine
Traitement
43
Figure 2.2: Effets de la fraction au dichlorométhane de Ziziphus
mauritiana sur le cycle cellulaire
Inhibition en phase S pour NCI-H460 et en G2-M pour MCF-7
NCI-H460 MCF-7
Résultats
et discussion
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*
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*
*
*
*
*
*
*
*
*
0
10
20
30
40
50
60
70
PourcentagedeCellules(%)
G0/G1 S G2/M
Contrôle 1 µg/mL 4 µg/mL 25 µg/mL Doxorubicine
Traitement
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0
10
20
30
40
50
60
70
PourcentagedeCellules(%)
G0/G1 S G2/M
Doxorubicine30 µg/mL10 µg/mL5 µg/mLContrôle
Traitement
44
Arrêt de la progression en S (Protea) Arrêt de la progression en G2-M ( Ekebergia)
Figure 2.3: Effets de la fraction au dichlorométhane de Protea elliotii
et à l’hexane de Ekebergia senegalensis sur le cycle cellulaire
NCI-H460 MCF-7
Résultats et
discussion
45
Fractions issues du partitionnement
Sélection de la ou des fraction(s) active(s)
Réalisation des sous-fractions
Evaluation des activités antiproliférative et anti-oxydante
des fractions
Chromatographie sur colonne des fractions
Evaluation des activités antiproliférative et anti-
oxydante des sous-fractions
Sélection de la sous-fraction active et réalisation de la
chromatographie jusqu'à l’obtention de la ou des molécules
Purification bio-guidée
Des chromatographies préliminaires sur couche mince ont été menées
Matériel et méthodes
46
Les sous-fractions pures ont été soumises à des études spectroscopiques
Structures des
composés
Déterminées par une équipe de collaborateurs de ICCBS
(Pakistan)
Confirmées par comparaison sur CCM avec des composés
disponibles au laboratoire et de structures connues
Purification bio-guidéeRésultats et discussion
47
Composés isolés de Ziziphus mauritiana
Lupéol Acide bétulinique
Catéchine
Epigalocatéchine
Résultats et discussion
48
Acide bétulinique
cytotoxique sur de nombreuses lignées de cellules
cancéreuses (Prasad et al., 2008)
Mécanisme moléculaire: induction de l’apoptose
perméabilisation de la membrane mitochondriale externe
Lupéol
Induit de l’apoptose
Arrêt du cycle cellulaire des cellules cancéreuses en phase G2/M par
inhibition de la voie de signalisation des cyclines
Résultats et discussion
49
Catéchine
Limite certains dommages au sein d’un organisme et retarde
l’apparition de certaines maladies comme le cancer
Agirait par une modulation des voies de signalisation cellulaires,
entraînant ainsi des changements dans l’expression des gènes au
niveau cellulaire (Manach et al., 2005; Scalbert et al., 2005)
Epigallocatéchine
Possède une puissante activité anti-inflammatoire et
antiproliférative et est capable d’inhiber sélectivement la
croissance cellulaire
Induit l’apoptose dans les cellules cancéreuses sans
affecter les cellules normales (Syed et al., 2007)
Résultats et discussion
50
Partie 3
Effet du traitement par les fractions les
plus actives sur le stress induit par le
naphtalène chez le rat
51
Evaluation du traitement par les fractions les plus
antioxydantes sur le stress induit par le naphtalène
30 rats test
TestsContrôles
NAP+12,5
mg/kg
NAP+50
mg/kg
NAP+25
mg/kg
NAP+100
mg/kg
Contrôle
nég:
Huile
+eau
distillée
Contrôle
ref: NAP +
Ac Asc
Contrôle
positif: NAP
+ Eau
distillée
Gavage pendant 30 jours + Anesthésie +Sacrifice +collecte des
organes
Matériel et méthodes
Akhter et al. (2008)
Préparation des homogénats tissulaires et
dosages
52
Collecte du surnageant et conservation à -18 °C
Centrifugation à 3000 tours/minute pendant 15 mins
Cœur Foie et Rein broyés à 15%
 Evaluation de l’activité de la SOD
 Evaluation de l’activité de la catalase
 Dosage du glutathion
 Dosage du MDA
Matériel et méthodes
53
Tableau 3.1: Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii
et de Ziziphus mauritiana sur l’activité de la SOD
Groupes et traitements SOD (IU/mg enzyme)
Foie Cœur Rein
Fractionàl’acétate
d’éthyledeProtea
elliotii
CNe 13,98±1,25 15,64±1,13 15,22±1,27
Cp 17,42±1,21 19,32±1,88 18,56±1,56
Cr 15,24±1,38 15,86±1,40 15,61±1,31
N+D1 17,77±1,65 17,47±1,82 16,53±1,68
N+D2 15,68±1,83 15,77±1,88 16,23±1,68
N+D3 17,82±2,31 18,67±2,16 16,80±2,52
Fractionàl’acétate
d’éthyledeZiziphus
mauritiana
CNe 13,98±1,25 15,64±1,13 15,22±1,27
Cp 17,42±1,21 19,32±1,88 18,56±1,56
Cr 15,24±1,38 15,86±1,40 15,61±1,31
N+D1 17,13±2,01 16,20±2,11 15,51±1,89
N+D2 19,72±1,27 20,16±2,20 22,79±1,28*
N+D3 21,44±1,33* 23,49±0,61* 20,06±2,21
Résultats
et discussion
*P < 0,05 par rapport au témoin négatif avec le test de Dunnet
54
Tableau 3.2 : Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea
elliotii et de Ziziphus mauritiana sur l’activité de la catalase
Groupes et traitements Catalase (IU/mg enzyme)
Foie Cœur Rein
Fractionàl’acétate
d’éthyledeProtea
elliotii
Cp 25,91±2,41 22,47±0,83 24,26±1,62
Cp 27,24±2,13 26,22±2,41 27,79±1,38
Cr 25,08±1,15 23,28±2,50 25,61±0,93
N+D1 25,18±1,42 28,42±1,45 27,18±2,17
N+D2 25,70±2,35 27,95±3,49 31,64±2,35
N+D3 37,73±0,5**a 34,30±3,06* 36,98±2,47*
Fractionàl’acétate
d’éthyledeZiziphus
mauritiana
CNe 25,91±2,41 22,47±0,83 24,26±1,62
Cp 27,24±2,13 26,22±2,41 27,79±1,38
Cr 25,08±1,15 23,28±2,50 25,61±0,93
N+D1 24,73±2,74 30,67±3,47 29,78±5,84
N+D2 28,44±3,59 32,49±3,95 28,88±3,13
N+D3 33,99±2,10 34,57±2,11* 33,99±2,10
Résultats
et discussion
*P < 0,05 par rapport au témoin négatif, tandis que*aP < 0,05 par rapport au témoin
positif avec le test de Dunnet
55
SOD
Catalase
Dans les études in vivo, l’évaluation du statut de stress oxydant le
plus souvent se fait indirectement par l’évaluation des enzymes
antioxydantes à l’instar de la SOD et la catalase.
La SOD dismute les anions superoxyde en eau oxygénée qui à son
tour est décomposée en eau et en oxygène par la catalase
L’augmentation de l’activité de la SOD et la catalase observée
pourrait suggérer soit l’augmentation de la biosynthèse des enzymes
antioxydantes soit la neutralisation des espèces oxygénés activées
par ces fractions (Sathishsekar et Subramanian, 2005)
Résultats et discussion
a
*a *
*a * *a *
*
0
0.5
1
1.5
2
TauxdeGlutathionhépatique
enµmol/gdetissu
CNe Cp Cr Protea Ziziphus
Contrôle N+D1 N+D2
N+D3
Traitement
a
*a
0
0.5
1
1.5
2
TauxdeGlutathionrénale
enµmol/gdetissu
CNe Cp Cr Protea Ziziphus Ziziphus
Contrôle N+D3N+D2N+D1
Traitement
56
Figure 3.1: Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii
et de Ziziphus mauritiana sur le taux de glutathion hépatique et rénal
Hausse (P<0,05) du taux de glutathion hépatique et rénal.
Résultats
et discussion
*P < 0,05 par rapport au témoin négatif, tandis que*aP < 0,05 par rapport au témoin
positif avec le test de Dunnet
0
0.5
1
1.5
2
TauxdeGlutathion
cardiaque
enµmol/gdetissu
CNe Cp Cr Protea Ziziphus
Contrôle N+D1 N+D2
N+D3
Traitement
57
Figure 3.2: Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii
et de Ziziphus mauritiana sur le taux de glutathion cardiaque
Glutathion
Le glutathion, antioxydant non enzymatique, constitue la première
ligne de défense anti-radicalaire et joue un rôle multifactoriel dans
le mécanisme de défense antioxydante
Les changements de son taux peuvent être considérés comme des
indicateurs du stress oxydant
Résultats
et discussion
a
**a
*a *a *a
*a
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Tauxdemalondialdéhyde
hépatiqueenµM/gdetissu
CNe Cp Cr Protea Ziziphus
N+D2N+D1 N+D3Contrôl
e
Traitement
a
a*
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Tauxdemalondialdéhyde
rénalenµM/gdetissu
CNe Cp Cr Protea Ziziphus
Contrôle N+D1
N+D2
N+D3
Traitement
58
Figure 3.3: Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii
et de Ziziphus mauritiana sur le taux de malondialdéhyde (foie et rein)
Baisse significative du taux de malondialdéhyde hépatique et rénal
Résultats
et discussion
*P < 0,05 par rapport au témoin négatif, tandis que*aP < 0,05 par rapport au témoin
positif avec le test de Dunnet
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1Tauxdemalondialdéhydecardiaque
enµM/gdetissu
CNe Cp Cr Protea Ziziphus
Contrôle N+D1 N+D2 N+D3
Traitement
59
Figure 3.4: Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii
et de Ziziphus mauritiana sur le taux de malondialdéhyde cardiaque
Malondialdéhyde
L’élévation traduit une augmentation de la lipo-peroxydation et
des dommages tissulaires par la formation excessive des
radicaux libres (Sanmugapriya et Venkataraman, 2006)
Par contre, l’administration simultanée des fractions de Protea
elliotii ou de Ziziphus mauritiana avec le naphtalène induit une
diminution du taux de malondialdéhyde
Résultats
et discussion
60
23 plantes présumées anticancéreuses ont été identifiées dans la Vina
Parmi elles, les extraits de Ekebergia senegalensis et Costus spectabilis
ont présenté une forte activité antiproliférative
Les extraits de Terminalia macroptera, Protea elliotii, Vitellaria paradoxa
et Ziziphus mauritiana par contre ont présenté une activité
antiproliférative modérée.
Par ailleurs, les extraits de Protea elliotii, Terminalia macroptera, Lannea
kerstingii Vitellaria paradoxa, Ekebergia senegalensis et Ziziphus
mauritiana ont montré une activité antioxydante in vitro
Conclusion
61
Le fractionnement des extraits choisis a conduit à l’obtention
de quelques fractions plus actives que les extraits ayant
conduit à leur obtention.
L’un des modes d’actions anticancéreux des fractions serait
le ralentissement ou l’arrêt du cycle cellulaire à l’une des
phases
La purification bio-guidée de ces fractions a conduit à
l’obtention du lupéol de l’acide bétulinique, de la catéchine et
l’épigalocatéchine qui avaient des activités anticancéreuses
prouvées.
Conclusion
62
Les fractions à l’acétate d’éthyle de Ziziphus mauritiana et de
Protea elliotii ont montré leur capacité à protéger les tissus
hépatiques, cardiaques et rénaux des dommages tissulaires qui
peuvent être causés par la production excessive des radicaux
libres
Conclusion
63
Evaluer les activités antiprolifératives et antioxydantes des
autres plantes issues de l’enquête ethnopharmacologique
Evaluer l’effet du fractionnement sur les autres extraits ayant
présenté l’activité antiproliférative et/ou l’activité anti-oxydante
Effectuer des études toxicologiques sur les extraits ayant
présenté une bonne activité afin de vérifier leur innocuité
Perspectives
64
Richard Simo Tagne, Bruno Phelix Telefo, Jean Noel Nyemb, Didiane Mefokou
Yemele, Sylvain Nguedia Njina, Stéphanie Marie Chekem Goka, Landry Lienou
Lienou, Armel Hervé Nwabo Kamdje, Paul Fewou Moundipa, Ahsana Dar Farooq.
2014. Anticancer and antioxidant activities of methanol extracts and fractions of some
Cameroonian medicinal plants. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. doi:
10.1016/S1995-7645(14)60272-8”.
Richard Simo Tagne; Bruno Phelix Telefo; Emmanuel Talla; Jean Noel Nyemb;
Sylvain Nguedia Njina; Mudassir Asrar; Armel Hervé Nwabo Kamdje; Paul
Fewou Moundipa; Ahsana Dar Farooq and M. Iqbal Choudhary.2015 Bio-guided
fractionation of methanol extract of Ziziphus mauritiana Lam. (bark) and effect of
the most active fraction on cancer cell lines. Asian Pacific Journal of Tropical
Disease 5(4) 307-312.
Publications
65
Remerciements
Laboratoire de Biochimie des Plantes Médicinales, des
Sciences Alimentaires et Nutrition (LABPMAN)
Tradithérapeutes qui nous ont orienté vers les plantes
Laboratoire de chimie de l’Université de Ngaoundéré
TWAS pour la bourse
Centre International pour les Sciences Chimiques et
Biologiques du Pakistan (ICCBS)
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Évaluation des activités anticancéreuses de quelques plantes utilisées dans le Département de la Vina (Adamaoua-Cameroun)

  • 1. 1 Soutenance de Thèse en vue de l’obtention du diplôme de Doctorat/Ph.D en Biochimie Laboratoire de Biochimie des Plantes Médicinales, des Sciences Alimentaires et Nutrition (LABPMAN) UNIVERSITE DE DSCHANG FACULTE DES SCIENCES THEME Evaluation des activités anticancéreuses de quelques plantes utilisées dans le Département de la Vina (Adamaoua-Cameroun)
  • 2. 2 Plan Introduction I- Inventaire des plantes médicinales et évaluation du potentiel anticancéreux des plus citées II- Evaluation de l’impact du fractionnement sur l’activité anticancéreuse des extraits choisis et caractérisation du mode d’action des fractions les plus actives III- Evaluation de l’effet du traitement par les fractions les plus actives sur le stress induit par le naphtalène chez le rat Conclusion et perspectives
  • 3. Introduction 3 Facteurs Chimiques: Tabac, Alcool, arsenic, amiante, hydrocarbures aromatiques… Facteurs Physiques Rayon X, UV, Radioactivité… Facteur Viral Epstein Barr, V. Hépatite B ou C, Herpès Virus, Papilloma Virus… Facteur génétique Facteurs endogènes
  • 4. 4 Introduction Relation entre stress et cancer Stress oxydatif
  • 5. 5 En 2012 Incidence = 14 millions (OMS, 2014) Sur la même période, les décès devraient passer d’environ 8,2 millions à 13 millions par an (OMS, 2014 ; Globocan, 2012 ; Enow et al., 2012) Introduction Au Cameroun, l’incidence annuelle est de 15 000 Prévalence estimée à 25 000 malades (OMS, 2014 ; Enow et al., 2012) Age moyen des patients au diagnostic est de 45 ans Plus de 80% des cas sont diagnostiqués tardivement
  • 6. 6 Les progrès réalisés pour guérir le cancer sont indéniables Thérapie génique Ciblée Immunothérapie Chirurgie Radiothérapie Hormonothérapie Chimiothérapie Traitements localisés Traitements systémiques Introduction
  • 7. 7 Introduction Vomissements Effets secondaires Pertes de cheveux Il est unanimement avéré qu’au Cameroun, la plupart des malades n’ont accès ni à un diagnostic précoce, ni au traitement moderne Ceux qui peuvent suivre un traitement moderne font face Mort de certaines cellules La difficulté d’accéder facilement à un traitement efficace motive certains patients à faire recours à la phytothérapie
  • 8. 8 Introduction C’est dans ce même contexte que s’inscrit ce présent travail Exploitation des pharmacopées traditionnelles Base de bien de progrès dans les traitements du cancer Cas de la Vincristine et de la Vinblastine Kueté et al. (2012, 2013, 2014, 2015), Tamokou et al. (2013) Travaux sur certaines plantes des Régions de l’Ouest, du Littoral et du Nord-Ouest. Possibilité de fabrication des phytomédicaments.
  • 9. 9 Le criblage des plantes des Régions du Cameroun où la flore reste encore peu exploitée quant aux plantes ayant une activité anticancéreuse pourrait ouvrir des perspectives nouvelles dans le combat contre le cancer. Certaines plantes médicinales de ces régions contiendraient des constituants qui outre leur effet antiprolifératif, pourraient neutraliser l’excès de radicaux libres lié à une intense prolifération. Hypothèses
  • 10. 10 Etudier les propriétés antiprolifératives et antioxydantes des extraits de quelques plantes médicinales traditionnellement utilisées dans le Département de la Vina. Objectif général
  • 11. 11  Inventorier les plantes médicinales utilisées dans le Département de la vina contre le cancer, puis évaluer le potentiel antiprolifératif des plus citées ainsi que l’activité antioxydante in vitro de celles-ci Objectifs Spécifiques  Evaluer l’impact du fractionnement des extraits choisis sur l’activité anticancéreuse puis caractériser le mode d’action des fractions les plus actives tout en recherchant leurs principes actifs grâce à une purification bio- guidée  Etudier l’effet du traitement par certaines fractions actives sur un stress induit par le naphtalène chez le rat
  • 12. 12 Partie 1 Inventaire des plantes médicinales et évaluation du potentiel anticancéreux des plus citées
  • 14. 14 Fiche d’enquête Espèce de plante et les parties utilisées dans le traitement du cancer Méthode de préparation de l’extrait et le solvant utilisé Autres usages traditionnels des espèces citées Enquête ethnopharmacologique
  • 15. 15 Enquête Les phytothérapeutes rencontrés assimilaient le cancer à la plante parasite appelée Gui d’Afrique L’étude a montré que ces phytothérapeutes prescrivaient différents modes de préparation des potions aux patients Les entretiens se sont déroulés dans l’ensemble en langue locale (Fufulde). Toutes les espèces végétales recensées ont été récoltées, puis identifiées. Des 23 espèces obtenues, 12 ont été retenues pour la suite de nos travaux Enquête ethnopharmacologique
  • 16. 16 Ekebergia senegalensis Ziziphus mauritiana Eremomastax speciosa Cissus populnea Enquête ethnopharmacologique
  • 17. 17 Costus spectabilis Protea elliotii Vitellaria paradoxa Senna siamea Enquête ethnopharmacologique
  • 18. 18 Terminalia macroptera Centella asiatica Lannea kerstingii Gardenia aqualla Enquête ethnopharmacologique
  • 19. 19 Prélèvement des parties ciblées de chaque plante Broyage jusqu’à l’obtention de fines poudres Après chaque 24 heures, le mélange obtenu a été filtré et le filtrat obtenu a été concentré dans un évaporateur rotatif Nettoyage et séchage à température ambiante 1000 g de chaque poudre ont été mis à macérer à température ambiante dans 3 L de méthanol Les extraits résultant ont été séchés et les poudres obtenues ont été conservées jusqu’à leur utilisation. Préparation des extraits
  • 20. 20 Extrait Classes de métabolites Alcaloïdes Flavonoïdes Anthraquinones Tanins Triterpènes Saponines Senna siamea + + + + + + Centella asiatica + + + + + + Cissus populnea + + + + + + Costus spectabilis + + + + + + Ekebergia senegalensis + + + + + - Eremomastax speciosa + + - + + + Gardenia aqualla + + + + + + Lannea kerstingii + + + + + - Protea elliotii + + - + + + Terminalia macroptera + + + + + + Vitellaria paradoxa - + + + + - Ziziphus mauritiana + + + + + + Les travaux de laboratoire, guidés par les usages vernaculaires ont pour but de constater le bien-fondé de l’usage d’une plante donnée TABLEAU 1.1: Composition phytochimique des extraits
  • 21. 21 Evaluation du potentiel antiprolifératif des extraits de plantes sélectionnées
  • 22. 22 NCI-H460 MCF-7 PC3 HeLa 3T3 LIGNEES CELLULAIRESMatériel et méthodes
  • 24. 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H . Milieu de culture + extrait de plante (ou anticancéreux de référence) Milieu de culture + cellule + extrait de plante (ou anticancéreux de référence) Milieu de culture + cellule + RPMI RMPI Matériel et méthodes
  • 25. 25 . Fixation des protéines par le TCA Rinçage 5 fois avec le PBS Ajout de 100µL de sulforhodamine B + 5 Rinçages avec l’acide acétique 1% Ajout de 100µL de tampon Tris + agitation pendant 5 mins Mesure de l’absorbance de chaque puits à 515 nm Matériel et méthodes
  • 26. 26 Matériel et méthodes Paramètres antiprolifératifs % croissance= [(E - Z) / (C - Z)] x 100 La CI50 (concentration d'extrait qui inhibe 50 % de la croissance cellulaire) % inhibition = 100 - % Croissance
  • 27. 27 Tableau 1.2: Effets des extraits de plantes sélectionnées sur la prolifération Cellulaire Extrait Activité antiproliférative CI50 (µg/mL) NCI H460 MCF-7 PC3 HeLa 3T3 Lannea kerstingii >250 >250 >100 >100 >250 Cissus populnea >100 >100 >100 >100 >100 Centella asiatica >250 47,00±1,60*** 45,00±0,81*** >100 >250 Gardenia aqualla >100 87,00± 0,73*** 97,00± 0,88*** >100 >100 Senna siamea 87,00±1,60*** 97,00±1,30*** >100 >100 >100 Eremomastax speciosa 98,00 ±0,77*** 44,00±0,77*** >100 >100 >250 Costus spectabilis 13,00±0,80*** 20,00 ±0,80*** 22,50±0,81*** 10,30±0,26*** 6,72±0,05*** Ekebergia senegalensis 20,00 ± 0,04*** 13,50± 1,04*** 16,18±1,34*** 17,86±0,74*** 28,84±0,10*** Protea elliotii 24,44±0,90*** 87,00 ±1,22*** 47,00±1,33*** 66,46±0,37*** 81,6± 0,70*** Terminalia macroptera 31,00±1,50*** 31,00±1,50*** 42,37±0,31*** 68,46±018*** 64,42±1,30*** Vitellaria pradoxa 27,00±0,90*** 27,00±0,90*** 67,00±0,09*** 66,46±0,37*** 30,67±0,50*** Ziziphus mauritiana 16,00±0,59*** 29,00±0,90*** 39,87±0,19*** 37,10±0,47*** 42,53±0,48*** Doxorubicine 0,02± 0,001 0,22 ±0,053 0,29±0,120 0,62 ±0,150 0,70 ±0,19 Résultats et discussion ***P < 0,001 par rapport à la substance de référence (Doxorubicine)
  • 28. 28 L’effet antiprolifératif présenté par certains des extraits peut être lié à leur richesse en métabolites secondaires Les variations observées au niveau de l’efficacité pourraient être attribuées soit à la constitution génétique des différentes lignées cellulaires considérées L’absence d’activité observée pourrait être attribuée: Manque de connaissances spécifiques sur le cancer Le composé présent dans ces extraits pouvait avoir besoin d’une transformation métabolique in vivo, nécessaire à son activation Résultats et discussion
  • 29. 29 Tableau 1.3 : Indices de sélectivité des extraits de plantes sélectionnées Extraits de : NCI-H460 MCF-7 PC3 HeLa Lannea kerstingii / / / / Cissus populnea / / / / Centella asiatica / / / / Gardenia aqualla / / / / Senna siamea / / / / Eremomastax speciosa / / / / Costus spectabilis 0,51 0,33 0,29 0,65 Ekebergia senegalensis 1,44 2,13 1,77 1,61 Protea elliotii 3,33 0,93 1,73 1,22 Terminalia macroptera 2,07 2,68 1,52 0,94 Vitellaria paradoxa 1,13 1,27 0,45 0,46 Ziziphus mauritiana 2,65 1,46 1,14 1,06 Doxorubicine 35,00 3,00 2,41 1,12 Résultats et discussion
  • 30. 30 Un extrait antiprolifératif et antioxydant permettrait de combattre efficacement le stress oxydatif chez le patient. Production du monoxyde d’azote Rôle majeur dans la physiologie cellulaire (Valko et al., 2007) Sa forte concentration observée devient délétère pour les cellules
  • 31. 31 Evaluation du potentiel antioxydant in vitro des extraits de plantes sélectionnées
  • 32. 5 μL des solutions d’extraits ou de solution d’acide gallique 95 μL d’une solution éthanolique de DPPH Incubation pendant 30 min à l’obscurité L’absorbance a été mesurée à 515 nm % d’activité = [(Abs Contrôle–Abs échantillon) / Abs Contrôle] x100 32 Evaluation du potentiel antioxydant des extraits de plantes sélectionnées: potentiel anti-DPPH Matériel et méthodes (Kumari, 2013)
  • 33. Le potentiel anti-NO : Hemayet et al. (2012) Chélation du fer: Le et al. (2007) 150 µL (Extrait + tampon + nitroprussiate de sodium ) 150 minutes d’incubation à 25 ° C 50 µL de réactif d'acide sulphanalique 50 µL de N-(1-naphtyl) éthylène diamine L’absorbance a été mesurée à 546 nm % d’activité anti-radicalaire = [(Abs Contrôle–Abs échantillon) / Abs Contrôle] x100 100 μL (5 µL d’extrait +35 µL de FeCl2 +60 µL de Ferrozine). agité à 25 °C pendant 10 min L’absorbance a été mesurée à 562 nm % d’activité chélatrice= [(Abs Contrôle– Abs échantillon) / Abs Contrôle] x100 33 Evaluation du potentiel antioxydant des extraits de plantes sélectionnées Matériel et méthodes
  • 34. 34 Tableau 1.4: Activité anti-DPPH et anti-NO des extraits de plantes sélectionnées Extrait de: Test anti oxydant DPPH CI50 (µg/mL) NO CI50 (µg/mL) Centella asiatica ND ND Costus spectabilis ND / Eremomastax speciosa 454,00±2,54** / Senna siamea 236,70±3,80** ND Gardenia aqualla 105,90±2,10** 278,00±1,56** Lannea kerstingii 34,4±2,20** 253,00±2,00** Ekebergia senegalensis 15,83±0,40** 299,00±3,00** Protea elliotii 14,20±0,27** 306,00±2,50** Cissus populnea 15,72±1,20** 409,00±2,00** Terminalia macroptera 19,90±0,70* 205,00±0,90 Vitellaria paradoxa 22,14±0,39 290,00±2,04** Ziziphus mauritiana 19,05±0,5* 361,00 ±3,00** Substance de référence 22,67±0,40 108,00±2,00 Résultats et discussion
  • 35. 35 Figure 1.1: Chélation du fer par les extraits de plantes sélectionnées Il est connu que les composés phénoliques à l’instar des flavonoïdes peuvent fonctionner comme capteurs de radicaux libres, agents complexant des pro-oxydants, des métaux et des agents réducteurs d’espèces réactives de l’oxygène, ce qui protège le corps contre les maladies métaboliques telles que le cancer (Geronikaki et al., 2013) Seuls les extraits de Cissus populnea, Ekebergia senegalensis, Protea elliotii et Ziziphus mauritiana semblent présenter l’activité chélatrice importante * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 0 20 40 60 80 100 Pourcentaged'activité ChélatriceduFe2+(%) Extraits de plantes et substance de référence Résultats et discussion **P < 0,01 par rapport à la substance de référence (EDTA) avec le test de Dunnet
  • 36. 36 Partie 2 Fractionnement des extraits, caractérisation du mode d’action des fractions les plus actives et recherche bio-guidée des principes actifs
  • 38. 38 Figure 2.1: Partitionnement des extraits F-MoH (28,71 g) F-BuOH (15,39g) Résidu Aqueux Séchage à 40°C 1,5 L BuOH (3 fois) F-Ac (12,10 g) Résidu Aqueux 1,5 L ETO AC (6 fois) F-DCM (10,74g) Résidu Aqueux Extrait au méthanol de Ziziphus mauritiana (150g) + solubilisation dans 500 ml d’eau distillée F-Hex (1,2mg) Résidu Aqueux 1,5 L DCM (6 fois) 1,5 L Hexane (6 fois) Matériel et méthodes
  • 39. 39 Tableau 2.1: Activité antioxydante des fractions de plantes sélectionnées Nom de la plante Fraction testée Activité antioxydante (DPPH) % d’activité à 500µg/mL CI50 µg/mL Ekebergia senegalensis Hexane NA N A Dichlorométhane 61,81±1,50** 366,60±2,90** Acétate d’éthyle 95,45±1,90 14,00±0,20** n-Butanol 94,63±0,30** 19,12±0,50* Méthanol 93,41±0,80** 20,16±1,30 Protea elliotii Hexane 91,92±1,23** 122,00±4,30** Dichlorométhane 92,74±0,90** 104,30±1,80** Acétate d’éthyle 94,64±2,01** 24,10±0,18 n-Butanol 94,71±1,44** 16,50±0,70** Méthanol 96,05±0,79 15,30±0,20** Ziziphus mauritiana Hexane 39,00±1,33** N D Dichlorométhane 60,62±2,30** 274,70±3,75** Acétate d’éthyle 95,41±1,55 14,6±0,29** n-Butanol 96,66±0,66 16,70±0,40** Méthanol 93,51±1,11** 17,00±0,80** Acide gallique 96,67±0,80 22,67±0,40 Résultats et discussion
  • 40. 40 Tableau 2.2: Effets des fractions de plantes sélectionnées sur la prolifération cellulaire Plantes Fraction testée Activité anticancéreuse CI50 (µg/mL) NCI-H460 MCF-7 3T3 Ekebergia senegalensis Hexane 30,00± 0,10*** 10,00± 0,80*** 45,00 ± 0,22*** Dichlorométhane 12,00 ± 0,50*** 19,00 ±0,90*** 32,00 ± 0,15*** Acétate d’éthyle 30,00±1,66*** 25,00±1,33*** 40,00±1,88*** n-Butanol 32,00±0,37*** 40,00±0,77*** 52,00±0,31**** Méthanol 44,00±0,74*** 34,00±0,44*** 44,00±0,54*** Proteaelliotii Hexane >100 >100 >100 Dichlorométhane 3,50±0,18*** 10,00 ±0,55*** 50,00 ±0,12*** Acétate d’éthyle 70,00±0,26*** 60,00±0,46*** 80,00±0,86*** n-Butanol 13,00±0,47*** 15,00±0,37*** 55,00±0,76*** Méthanol 12,00±0,10*** 92,00±0,80*** 48,00±0,50*** Ziziphus mauritiana Hexane 18,00±0,09*** 96,00 ±0,01*** 66,00±0,93*** Dichlorométhane 3,80±0,50*** 5,00±0,88*** 54,00 ±0,99*** Acétate d’éthyle 20,00±1,11*** 16,00± 2,17*** 46,00±1,44*** n-Butanol 18,00±0,05*** 21,00±0, 60*** 36,00±0,36*** Méthanol 16,00±0,48*** 27,00±0,72*** 52,00 ± 0,25*** Standard Doxorubicine 0,02± 0,001 0,22 ±0,05 0,70 ±0,19 Résultats et discussion
  • 41. 41
  • 42. Formation de la mono-couche (24h) Ajout des fractions et medicament standard (48h) Trypsinisation + 1ml de milieu de culture Centrifugation dans le tampon phosphate Ajout de l’éthanol à 4°C Rnase (30min) + Iodure de propidium (30min) 42 Evaluation de l’effet des fractions les plus actives sur le cycle cellulaire Matériel et méthodes
  • 43. * * * * * * * * * 0 10 20 30 40 50 60 70 PourcentagedeCellules(%) G0/G1 S G2/M Contrôle 1 µg/mL 3,5 µg/mL 25 µg/mL Doxorubicine Traitement * * * * * * * * * * * * 0 10 20 30 40 50 60 70 Pourcentagedecellules(%) G0/G1 S G2/M Contrôle 1 µg/mL 5 µg/mL 25 µg/mL Doxorubicine Traitement 43 Figure 2.2: Effets de la fraction au dichlorométhane de Ziziphus mauritiana sur le cycle cellulaire Inhibition en phase S pour NCI-H460 et en G2-M pour MCF-7 NCI-H460 MCF-7 Résultats et discussion
  • 44. * * * * * * * * * * * * 0 10 20 30 40 50 60 70 PourcentagedeCellules(%) G0/G1 S G2/M Contrôle 1 µg/mL 4 µg/mL 25 µg/mL Doxorubicine Traitement * * * * * * * * * * * 0 10 20 30 40 50 60 70 PourcentagedeCellules(%) G0/G1 S G2/M Doxorubicine30 µg/mL10 µg/mL5 µg/mLContrôle Traitement 44 Arrêt de la progression en S (Protea) Arrêt de la progression en G2-M ( Ekebergia) Figure 2.3: Effets de la fraction au dichlorométhane de Protea elliotii et à l’hexane de Ekebergia senegalensis sur le cycle cellulaire NCI-H460 MCF-7 Résultats et discussion
  • 45. 45 Fractions issues du partitionnement Sélection de la ou des fraction(s) active(s) Réalisation des sous-fractions Evaluation des activités antiproliférative et anti-oxydante des fractions Chromatographie sur colonne des fractions Evaluation des activités antiproliférative et anti- oxydante des sous-fractions Sélection de la sous-fraction active et réalisation de la chromatographie jusqu'à l’obtention de la ou des molécules Purification bio-guidée Des chromatographies préliminaires sur couche mince ont été menées Matériel et méthodes
  • 46. 46 Les sous-fractions pures ont été soumises à des études spectroscopiques Structures des composés Déterminées par une équipe de collaborateurs de ICCBS (Pakistan) Confirmées par comparaison sur CCM avec des composés disponibles au laboratoire et de structures connues Purification bio-guidéeRésultats et discussion
  • 47. 47 Composés isolés de Ziziphus mauritiana Lupéol Acide bétulinique Catéchine Epigalocatéchine Résultats et discussion
  • 48. 48 Acide bétulinique cytotoxique sur de nombreuses lignées de cellules cancéreuses (Prasad et al., 2008) Mécanisme moléculaire: induction de l’apoptose perméabilisation de la membrane mitochondriale externe Lupéol Induit de l’apoptose Arrêt du cycle cellulaire des cellules cancéreuses en phase G2/M par inhibition de la voie de signalisation des cyclines Résultats et discussion
  • 49. 49 Catéchine Limite certains dommages au sein d’un organisme et retarde l’apparition de certaines maladies comme le cancer Agirait par une modulation des voies de signalisation cellulaires, entraînant ainsi des changements dans l’expression des gènes au niveau cellulaire (Manach et al., 2005; Scalbert et al., 2005) Epigallocatéchine Possède une puissante activité anti-inflammatoire et antiproliférative et est capable d’inhiber sélectivement la croissance cellulaire Induit l’apoptose dans les cellules cancéreuses sans affecter les cellules normales (Syed et al., 2007) Résultats et discussion
  • 50. 50 Partie 3 Effet du traitement par les fractions les plus actives sur le stress induit par le naphtalène chez le rat
  • 51. 51 Evaluation du traitement par les fractions les plus antioxydantes sur le stress induit par le naphtalène 30 rats test TestsContrôles NAP+12,5 mg/kg NAP+50 mg/kg NAP+25 mg/kg NAP+100 mg/kg Contrôle nég: Huile +eau distillée Contrôle ref: NAP + Ac Asc Contrôle positif: NAP + Eau distillée Gavage pendant 30 jours + Anesthésie +Sacrifice +collecte des organes Matériel et méthodes Akhter et al. (2008)
  • 52. Préparation des homogénats tissulaires et dosages 52 Collecte du surnageant et conservation à -18 °C Centrifugation à 3000 tours/minute pendant 15 mins Cœur Foie et Rein broyés à 15%  Evaluation de l’activité de la SOD  Evaluation de l’activité de la catalase  Dosage du glutathion  Dosage du MDA Matériel et méthodes
  • 53. 53 Tableau 3.1: Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii et de Ziziphus mauritiana sur l’activité de la SOD Groupes et traitements SOD (IU/mg enzyme) Foie Cœur Rein Fractionàl’acétate d’éthyledeProtea elliotii CNe 13,98±1,25 15,64±1,13 15,22±1,27 Cp 17,42±1,21 19,32±1,88 18,56±1,56 Cr 15,24±1,38 15,86±1,40 15,61±1,31 N+D1 17,77±1,65 17,47±1,82 16,53±1,68 N+D2 15,68±1,83 15,77±1,88 16,23±1,68 N+D3 17,82±2,31 18,67±2,16 16,80±2,52 Fractionàl’acétate d’éthyledeZiziphus mauritiana CNe 13,98±1,25 15,64±1,13 15,22±1,27 Cp 17,42±1,21 19,32±1,88 18,56±1,56 Cr 15,24±1,38 15,86±1,40 15,61±1,31 N+D1 17,13±2,01 16,20±2,11 15,51±1,89 N+D2 19,72±1,27 20,16±2,20 22,79±1,28* N+D3 21,44±1,33* 23,49±0,61* 20,06±2,21 Résultats et discussion *P < 0,05 par rapport au témoin négatif avec le test de Dunnet
  • 54. 54 Tableau 3.2 : Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii et de Ziziphus mauritiana sur l’activité de la catalase Groupes et traitements Catalase (IU/mg enzyme) Foie Cœur Rein Fractionàl’acétate d’éthyledeProtea elliotii Cp 25,91±2,41 22,47±0,83 24,26±1,62 Cp 27,24±2,13 26,22±2,41 27,79±1,38 Cr 25,08±1,15 23,28±2,50 25,61±0,93 N+D1 25,18±1,42 28,42±1,45 27,18±2,17 N+D2 25,70±2,35 27,95±3,49 31,64±2,35 N+D3 37,73±0,5**a 34,30±3,06* 36,98±2,47* Fractionàl’acétate d’éthyledeZiziphus mauritiana CNe 25,91±2,41 22,47±0,83 24,26±1,62 Cp 27,24±2,13 26,22±2,41 27,79±1,38 Cr 25,08±1,15 23,28±2,50 25,61±0,93 N+D1 24,73±2,74 30,67±3,47 29,78±5,84 N+D2 28,44±3,59 32,49±3,95 28,88±3,13 N+D3 33,99±2,10 34,57±2,11* 33,99±2,10 Résultats et discussion *P < 0,05 par rapport au témoin négatif, tandis que*aP < 0,05 par rapport au témoin positif avec le test de Dunnet
  • 55. 55 SOD Catalase Dans les études in vivo, l’évaluation du statut de stress oxydant le plus souvent se fait indirectement par l’évaluation des enzymes antioxydantes à l’instar de la SOD et la catalase. La SOD dismute les anions superoxyde en eau oxygénée qui à son tour est décomposée en eau et en oxygène par la catalase L’augmentation de l’activité de la SOD et la catalase observée pourrait suggérer soit l’augmentation de la biosynthèse des enzymes antioxydantes soit la neutralisation des espèces oxygénés activées par ces fractions (Sathishsekar et Subramanian, 2005) Résultats et discussion
  • 56. a *a * *a * *a * * 0 0.5 1 1.5 2 TauxdeGlutathionhépatique enµmol/gdetissu CNe Cp Cr Protea Ziziphus Contrôle N+D1 N+D2 N+D3 Traitement a *a 0 0.5 1 1.5 2 TauxdeGlutathionrénale enµmol/gdetissu CNe Cp Cr Protea Ziziphus Ziziphus Contrôle N+D3N+D2N+D1 Traitement 56 Figure 3.1: Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii et de Ziziphus mauritiana sur le taux de glutathion hépatique et rénal Hausse (P<0,05) du taux de glutathion hépatique et rénal. Résultats et discussion *P < 0,05 par rapport au témoin négatif, tandis que*aP < 0,05 par rapport au témoin positif avec le test de Dunnet
  • 57. 0 0.5 1 1.5 2 TauxdeGlutathion cardiaque enµmol/gdetissu CNe Cp Cr Protea Ziziphus Contrôle N+D1 N+D2 N+D3 Traitement 57 Figure 3.2: Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii et de Ziziphus mauritiana sur le taux de glutathion cardiaque Glutathion Le glutathion, antioxydant non enzymatique, constitue la première ligne de défense anti-radicalaire et joue un rôle multifactoriel dans le mécanisme de défense antioxydante Les changements de son taux peuvent être considérés comme des indicateurs du stress oxydant Résultats et discussion
  • 58. a **a *a *a *a *a 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Tauxdemalondialdéhyde hépatiqueenµM/gdetissu CNe Cp Cr Protea Ziziphus N+D2N+D1 N+D3Contrôl e Traitement a a* 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Tauxdemalondialdéhyde rénalenµM/gdetissu CNe Cp Cr Protea Ziziphus Contrôle N+D1 N+D2 N+D3 Traitement 58 Figure 3.3: Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii et de Ziziphus mauritiana sur le taux de malondialdéhyde (foie et rein) Baisse significative du taux de malondialdéhyde hépatique et rénal Résultats et discussion *P < 0,05 par rapport au témoin négatif, tandis que*aP < 0,05 par rapport au témoin positif avec le test de Dunnet
  • 59. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1Tauxdemalondialdéhydecardiaque enµM/gdetissu CNe Cp Cr Protea Ziziphus Contrôle N+D1 N+D2 N+D3 Traitement 59 Figure 3.4: Effets des fractions à l’acétate d’éthyle de Protea elliotii et de Ziziphus mauritiana sur le taux de malondialdéhyde cardiaque Malondialdéhyde L’élévation traduit une augmentation de la lipo-peroxydation et des dommages tissulaires par la formation excessive des radicaux libres (Sanmugapriya et Venkataraman, 2006) Par contre, l’administration simultanée des fractions de Protea elliotii ou de Ziziphus mauritiana avec le naphtalène induit une diminution du taux de malondialdéhyde Résultats et discussion
  • 60. 60 23 plantes présumées anticancéreuses ont été identifiées dans la Vina Parmi elles, les extraits de Ekebergia senegalensis et Costus spectabilis ont présenté une forte activité antiproliférative Les extraits de Terminalia macroptera, Protea elliotii, Vitellaria paradoxa et Ziziphus mauritiana par contre ont présenté une activité antiproliférative modérée. Par ailleurs, les extraits de Protea elliotii, Terminalia macroptera, Lannea kerstingii Vitellaria paradoxa, Ekebergia senegalensis et Ziziphus mauritiana ont montré une activité antioxydante in vitro Conclusion
  • 61. 61 Le fractionnement des extraits choisis a conduit à l’obtention de quelques fractions plus actives que les extraits ayant conduit à leur obtention. L’un des modes d’actions anticancéreux des fractions serait le ralentissement ou l’arrêt du cycle cellulaire à l’une des phases La purification bio-guidée de ces fractions a conduit à l’obtention du lupéol de l’acide bétulinique, de la catéchine et l’épigalocatéchine qui avaient des activités anticancéreuses prouvées. Conclusion
  • 62. 62 Les fractions à l’acétate d’éthyle de Ziziphus mauritiana et de Protea elliotii ont montré leur capacité à protéger les tissus hépatiques, cardiaques et rénaux des dommages tissulaires qui peuvent être causés par la production excessive des radicaux libres Conclusion
  • 63. 63 Evaluer les activités antiprolifératives et antioxydantes des autres plantes issues de l’enquête ethnopharmacologique Evaluer l’effet du fractionnement sur les autres extraits ayant présenté l’activité antiproliférative et/ou l’activité anti-oxydante Effectuer des études toxicologiques sur les extraits ayant présenté une bonne activité afin de vérifier leur innocuité Perspectives
  • 64. 64 Richard Simo Tagne, Bruno Phelix Telefo, Jean Noel Nyemb, Didiane Mefokou Yemele, Sylvain Nguedia Njina, Stéphanie Marie Chekem Goka, Landry Lienou Lienou, Armel Hervé Nwabo Kamdje, Paul Fewou Moundipa, Ahsana Dar Farooq. 2014. Anticancer and antioxidant activities of methanol extracts and fractions of some Cameroonian medicinal plants. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. doi: 10.1016/S1995-7645(14)60272-8”. Richard Simo Tagne; Bruno Phelix Telefo; Emmanuel Talla; Jean Noel Nyemb; Sylvain Nguedia Njina; Mudassir Asrar; Armel Hervé Nwabo Kamdje; Paul Fewou Moundipa; Ahsana Dar Farooq and M. Iqbal Choudhary.2015 Bio-guided fractionation of methanol extract of Ziziphus mauritiana Lam. (bark) and effect of the most active fraction on cancer cell lines. Asian Pacific Journal of Tropical Disease 5(4) 307-312. Publications
  • 65. 65 Remerciements Laboratoire de Biochimie des Plantes Médicinales, des Sciences Alimentaires et Nutrition (LABPMAN) Tradithérapeutes qui nous ont orienté vers les plantes Laboratoire de chimie de l’Université de Ngaoundéré TWAS pour la bourse Centre International pour les Sciences Chimiques et Biologiques du Pakistan (ICCBS)
  • 66. 66