Les techniques de culture in vitro cherchent à contrôler les facteurs de l’environnement (température, lumière, composition du milieu…) du fragment de plante mis en culture afin de l’orienter vers un programme d’évolution déterminé.

1. Elaboré par : DELLAA Ahmed

2. Les biotechnologies végétales reposent principalement sur les
cultures in vitro.

3. Les applications sont nombreuses aujourd’hui tant dans le domaine de
l’horticulture que dans celui de la recherche (notamment en amélioration
des plantes), ou encore pour conserver la diversité variétale
(Conservatoires) ou sauvegarder des espèces menacées.
Les techniques de culture in vitro
cherchent à contrôler les facteurs de
l’environnement (température,
lumière, composition du milieu…) du
fragment de plante mis en culture
afin de l’orienter vers un programme
d’évolution déterminé.

4. Dès 1902, Haberland, un biologiste allemand, observe les potentialités
naturelles de la multiplication végétative (bouturage). Suite à ces travaux, il
énonce le premier grand principe qui ouvrira la voie de la micropropagation
des végétaux. Il s’agit du principe de la totipotence cellulaire.

5. En 1934, WHITE réussit la
culture de racines de tomate
sur un milieu contenant de l'
eau, des sels minéraux ,un
extrait de levure et du sucre
et une hormone végétale, la
seule connue à l’époque :
l’auxine.
En 1939, Gautheret obtient à partir
de tissu carotte, un amas de
cellules dédifférenciées : un cal.
On peut cultiver ce cal
indéfiniment dans le temps. Avec
lui démarre vraiment la
culture in vitro ("dans du verre").

6. Il s’agit un ensemble de méthodes faisant intervenir d'une part l'asepsie
(stérilisation du matériel, désinfection des explants) :
Autoclave: sert a la stérilisation des Hotte a flux laminaire : travail
Milieux de culture et du matériel. en condition aseptiques.

7. d'autre part des conditions de culture parfaitement contrôlées (milieux de
culture définis pour chaque type de plante, température, lumière,
humidité,...).

8. Ces méthodes s'appliquent des organes ou des fragments d’organes :
les explants.
- graine immature,
- embryon,
- ovule,
- pollen,
- bourgeon terminal,
- bourgeon axillaire,
- morceau de tige,
- morceau de feuille,
- de pétale de fleur,
- etc....

9. L'explant doit trouver dans le milieu de culture tout ce dont il a besoin
pour survivre, se multiplier et éventuellement régénérer un nouvel
individu, en fait, tout ce que la plante mère peut fournir :
 par les racines : les éléments minéraux, l’eau ;
 par les feuilles et grâce à la photosynthèse : des sucres, des
vitamines et des acides aminés ;
les hormones, pour orienter la formation des organes.

10. A- LES ÉLÉMENTS MINÉRAUX :
Macroéléments (g.l-1) Microéléments (mg.l-1)
(N), (Ca), (K), (Fe), (Cu), (Zn),
(S), (Mg), (P) (Mn), (Mo), (B)
(Cl), (Co), (Ni),
interviennent en grande ne sont nécessaires à la
quantité 6 éléments présents plante qu'en faibles
à des concentrations élevée concentrations, leur rôle est
essentiel.

11. B) LES ELEMENTS ORGANIQUES :
sucres vitamines acides aminés
Dès lors, on ajoute L'emploi de diverses Il a parfois été observé
des sucres, le plus vitamines favorise que l'apport d'acides
souvent du fréquemment le aminés favorisait la
saccharose, aux
développement des prolifération.
milieux de culture
pour fournir à l'explant
cultures in vitro
une source de
carbone.

12. C) LES REGULATEURS DE CROISSANCE.
Appelés généralement hormones végétales , ils induisent les
phénomènes de croissance et de néoformation des organes.
On trouve ces substances de croissance naturellement dans toutes
les plantes.
Les hormones utilisées sont principalement : les auxines*, les
cytokinines*, car ces hormones sont capables d’orienter les
explants vers la formation de nouveaux organes.
* Les cytokinines ont été découvertes par le * En effet, en 1934, on découvre l’auxine (AIA) :
biais de la culture in vitro en 1956. Ce groupe il faut 100 kg de maïs immature pour obtenir
de substances de croissance végétales est 500 mg d’AIA. Cette substance naturelle est
responsable des divisions cellulaires. Les principalement synthétisée dans les parties
cytokinines sont principalement synthétisées apicales et agit sur l’élongation des cellules
dans les parties racinaires jeunes. donc sur la croissance des plantes.

13. Le rapport auxines / cytokinines détermine le devenir des tissus en culture.
Notion de balance hormonale
Cytokinines bourgeons
Auxine formation de racines
[ ] égales division cellules indifférenciées

14. En 1962, Murashige et Skoog étudient la multiplication végétative
du tabac et mettent au point le premier milieu de base pour la culture in
vitro. Ce milieu contient des sels minéraux, des sucres, des vitamines B,
des auxines et des cytokinines.
Ce milieu rend possible la culture et la prolifération de méristèmes
de tiges jusqu’alors réfractaires à la multiplication végétative in vitro.

15. 4 étapes de culture
La mise en œuvre
Multiplication in vitro
Enracinement
Acclimatation

16. SAUVEGARDE DES ESPECES EN DANGER.
EXEMPLE : LES PLANTES CARNIVORES.
MULTIPLICATION D’ESPECES DIFFICILES A OBTENIR
PAR DES METHODES TRADITIONNELLES.
Enfin, les cultures in vitro permettent de mettre plus
rapidement sur le marché les plants certifiés, les
nouvelles créations, ou encore d'assainir des collections.

17. Obtention de clones sélectionnés pour leur vigueur, leur caractères
intéressants (Chrysanthème, Fraisier, Bananier), leur rareté (Orchidées)
Assainissement des végétaux (plantes sans virus)
Production rapide et en masse, à n'importe quel moment de l'année
Raccourcissement des cycles de développement

18. Diminution des coûts de production (peu de personnel) et des dépenses
énergétiques ( réduction des surfaces de culture et éclairement réduit)
Facilité de stockage et conservation (au froid) de millions de plantes sur de
très petites surfaces, à l'état sain et à l'abri des contaminations

19. Production de substances biochimiques intéressantes pour
l'industrie

21. Culture de méristème
Meristème
Apex caulinaire Plantules
Tige feuillée Enracinement
Nœud
Caulogenèse directe
Morphogenèse
Embryogenèse Semences
directe somatique directe artificielles
Explants divers
Caulogenèse
(racines, tige, feuilles…)
indirecte
cal
Morphogenèse Embryogenèse
indirecte somatique
Callogenèse indirecte
Suspensions
D’après Lindsey et Jones 1989 cellulaires

22. Les embryons obtenus après la fécondation peuvent être prélevés, mis en
culture in vitro et donner un nouvel individu. Le sauvetage d'embryons
consiste à prélever un embryon précocement, pour le cultiver in vitro, soit
pour accélérer les cycles végétatifs, soit parce qu'il ne pourrait pas se
développer dans les tissus maternels, par exemple lorsqu'il résulte d'un
croisement interspécifique.

24. Le processus d'haplodiploïdisation comprend l'obtention de plantes
haploïdes à partir des organes porteurs des cellules
reproductrices, appelés gamétophyte mâle ou femelle, et le retour vers
la phase diploïde.

26. La propriété la plus importante des protoplastes
est leur capacité à fusionner entre eux lorsqu'ils
sont placés dans un milieu approprié. Cette
technique permet de surmonter les barrières
liées à la reproduction sexuée et de créer de
nouvelles combinaisons entre noyau et
cytoplasme.
Du fait de l'absence
de la paroi
pectocellulosique,
l'introduction directe
de l'ADN dans les
cellules est facilitée.

27. Une source de gènes étendue.
On peut franchir la barrière des
espèces, des genres et des
règnes. Ainsi, il est possible
d'introduire des caractères qu'il
ne serait pas possible
d'introduire par sélection
classique.
Le transfert d'un gène précis.
Elle permet de transférer le seul gène désiré et non de
transférer plusieurs gènes comme lors de la
reproduction sexuée.

28. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4

29. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Identifier, isoler, intégrer et multiplier
un gène d'intérêt
La première étape est
l'identification d'un caractère
que l'on veut introduire dans
la plante, comme par exemple
des caractères de qualité
nutritionnelle, la résistance à
certains insectes, à certaines
maladies, à des
herbicides, etc. Le gène
d'intérêt peut provenir de tout
organisme
vivant, plante, animal ou
bactérie puisque le code
génétique est universel.

30. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Identifier, isoler, intégrer et multiplier
un gène d'intérêt
Il doit ensuite être isolé de
l'organisme donneur. Il est
intégré dans une construction
génétique associant souvent
un gène marqueur. Ce gène
marqueur permet de
sélectionner les cellules qui
ont intégré le gène d'intérêt.
La construction est ensuite
multipliée (clonée) afin de
disposer d'une quantité
suffisante d'ADN pour son
introduction dans les cellules
végétales que l'on veut
transformer.

31. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Transférer le gène
La transformation biologique

32. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Transférer le gène
La transformation biologique.
La transformation génétique est
réalisée en mélangeant une
culture d'une souche
d'Agrobacterium transformée,
mise en suspension en milieu
liquide, avec des explants de la
plante, on parle de coculture.
C'est au cours de cette étape
que la construction génétique
introduite dans la bactérie est
transférée dans le génome de la
plante.

33. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Transférer le gène
La transformation biologique.
La coculture est lavée pour
éliminer les agrobactéries. Il faut
ensuite sélectionner les cellules
qui sont effectivement
transformées.
Pour cela, on apporte dans la
culture des explants un agent
sélectif approprié : herbicide,
antibiotique ... Seules les
cellules végétales transformées,
c'est-à-dire celles possédant et
exprimant le gène marqueur de
sélection, soit de résistance à un
herbicide, soit de résistance à
un antibiotique, pourront se
développer.

34. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Transférer le gène
Le transfert direct.
Des méthodes dites de
transfert direct utilisent des
moyens physiques ou
chimiques pour permettre la
pénétration
d'ADN, généralement sous
forme de plasmides dans une
cellule végétale. Les plus
utilisées sont la biolistique et le
transfert sur protoplastes.

35. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Régénérer et évaluer les plantes
transformées
Après sélection des cellules
transformées, il faut régénérer les
nouvelles plantes transgéniques.
Les cellules transformées se
développent d'abord en
cals, larges amas de cellules
indifférenciées. Après quelques
semaines, on observe le
développement de pousses. Elles
sont alors placées dans un
nouveau milieu de culture
permettant le développement des
racines. Quand les racines sont
suffisamment développées, les
plantules sont repiquées en pot et
acclimatées en serre.

36. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Régénérer et évaluer les plantes
transformées
Les cellules transformées est une
étape difficile à maîtriser. Aussi,
le génotype, le type de tissus et
les conditions de culture sont
choisis en fonction de leur
aptitude à la régénération.
Les plantes régénérées sont
ensuite analysées pour confirmer
l'insertion de la construction
génétique dans leur génomea
régénération in vitro des.

37. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Incorporer dans une variété
commerciale
Les plantes transformées
obtenues sont soumises à
des croisements contrôlés
pour étudier les modalités
de transmission du nouveau
caractère à la descendance.