PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR
L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE
01-D-550
TABLE DES MATIÈRES
1. INTRODUCTION ..........................................................................................
4.3.10 Laits secs ............................................................................11
4.3.11 Produits chambrés ...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
1. INTRODUCTION
Le prélèvement effectué dans le but de réalise...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
l'échantillon pour l’analyse microbiologique et le client conc...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
Si la recherche de Campylobacter ne peut être effectuée lors d...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
4. PRÉLÈVEMENT ET PESÉE
4.1 Définitions
4.1.1 Échantillon : L’...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
prélevée est différente de 25 g, cela doit être noté dans le c...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
Peser 25 g de chacun des échantillons (2) dans 2 sacs à Stomac...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
- Une manipulation supplémentaire peut être effectuée si requi...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
Bien mélanger au Stomacher les oeufs pendant environ 30 second...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
Note : Pour la recherche de Salmonella spp., des rapports de d...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
Rapport recommandé entre les épices et les assaisonnements et ...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
4.3.14 Graines de germes (luzerne, radis, mung, etc.)2
1.Peser...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
4.3.18 Conserves
Se référer à la méthode 01-M-020.
4.3.19 From...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
pH final : 7,2 ± 0,2
5.2 Bouillons d’enrichissement initiaux
L...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
homogénéisation complète de l'aliment n'est pas nécessaire. Le...
Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
7. ANNEXE
A – Milieu de conservation Cary-Blair. (optimisé pou...
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8. BIBLIOGRAPHIE
Bacteriological Analytical Manual, 2003, Divi...
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  1. 1. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE 01-D-550
  2. 2. TABLE DES MATIÈRES 1. INTRODUCTION ....................................................................................... 4 2. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT DE BASE........................................................... 4 3. RÉCEPTION, ENTREPOSAGE ET DÉCONGÉLATION DES ÉCHANTILLONS............ 4 3.1 Vérification des conditions de transport et de l'intégrité des contenants.... 4 3.2 Identification et enregistrement des échantillons................................... 5 3.3 Entreposage des échantillons ............................................................. 5 3.3.1 Généralités............................................................................. 5 3.3.2 Préparation de l'échantillon pour le maintien de la viabilité des Campylobacters thermotolérants lors d'un entreposage prolongé avant analyse......................................................................... 5 3.3.3 Préparation de l'échantillon pour le maintien des cellules végétatives de Clostridium perfringens lors d'un entreposage prolongé avant analyse ................................................................................. 6 3.4 Décongélation des échantillons ........................................................... 6 4. PRÉLÈVEMENT ET PESÉE……………………………………..........................…………………...7 4.1 Définitions....................................................................................... 7 4.1.1 Échantillon ............................................................................. 7 4.1.2 Unité composite ...................................................................... 7 4.1.3 Unité d'analyse ....................................................................... 7 4.2 Mesures d'hygiène et de salubrité ....................................................... 7 4.3 Prise de l'unité d'analyse et pesée....................................................... 7 4.3.1 Tous les aliments .................................................................... 7 4.3.2 Aliments liquides ou semi-liquides.............................................. 8 4.3.3 Regroupement des unités d'analyse pour la recherche de bactéries pathogènes telles Salmonella et Listeria monocytogenes (unité composite)............................................................................. 8 4.3.4 Viandes................................................................................. 9 4.3.4.1 En bloc...................................................................... 9 4.3.4.2 Prélèvement sur une tranche (ou portion individuelle) ...... 9 4.3.5 Poisson entier cru................................................................... 9 4.3.6 Mollusques crus ..................................................................... 9 4.3.7 Crustacés non décortiqués crus ou cuits ...................................10 4.3.8 Volaille crue avec peau...........................................................10 4.3.9 Oeufs ..................................................................................10
  3. 3. 4.3.10 Laits secs ............................................................................11 4.3.11 Produits chambrés ................................................................11 4.3.12 Produits gras (beurre, margarine, saindoux, etc.) et fromages gras .................................................................11 4.3.13 Produits secs déshydratés (exemple : épices, céréales, légumineuses sèches, riz sec)................................................11 4.3.14 Graines de germes (luzerne, radis, mung, etc.).........................13 4.3.15 Analyse de surface par lavage ................................................13 4.3.16 Produits très salés (>5 %) .....................................................13 4.3.17 Produits très sucrés (miel, sucreries, sirop d'érable, etc.) ...........13 4.3.18 Conserves ..........................................................................14 4.3.19 Fromages ............................................................................14 4.3.20 Éponges ..............................................................................14 5. DILUANTS ...............................................................................................14 5.1 Choix du diluant approprié ................................................................14 5.1.1 Diluant d'emploi général .........................................................14 5.1.2 Diluant à utiliser si les analyses incluent la recherche de Salmonella spp......................................................................14 5.2 Bouillons d’enrichissement initiaux .....................................................15 6. BROYAGE ET HOMOGÉNÉISATION ..............................................................15 6.1 Définitions......................................................................................15 6.1.1 Suspension mère (première dilution).........................................15 6.1.2 Dilutions décimales subséquentes .............................................15 6.2 Procédures .....................................................................................15 7. ANNEXE ..................................................................................................17 8. BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................18 9. APPROBATION .........................................................................................18
  4. 4. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique 1. INTRODUCTION Le prélèvement effectué dans le but de réaliser une analyse microbiologique est une étape très importante de la chaîne analytique. Il est primordial de s'assurer de l'intégrité et de la représentativité des échantillons. La méthode de prélèvement peut influencer grandement les résultats obtenus. Cette méthode comprend les étapes de l'arrivée des échantillons au laboratoire de microbiologie jusqu'au broyage des échantillons, c’est-à-dire jusqu’à l’obtention de la suspension-mère. Les échantillons doivent être en tout temps minutieusement manipulés en respectant l’ensemble des règles d’asepsie de manière à éviter toute contamination. L’ensemble des protocoles pour la fabrication des diluants mentionnés dans ce document se retrouve dans le document 01-D-100. 2. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT DE BASE Balance analytique de portée suffisante avec une précision de lecture de 0,1 g ou appareil à dilution automatique (ex: Dilumat AES laboratoire), facultatif. Bouillons d'enrichissement ou solutions de dilution en volume de 225 ml ± 2 % ou autres volumes, selon le cas. Couteaux, fourchettes, spatules, forceps, ciseaux, scalpels, cuillères, etc., stériles. Éthanol 70 % et 95 % pour flambage, si nécessaire. Homogénéisateur de type péristaltique (Stomacher) avec des sacs stériles de plastique. Pipettes bactériologiques stériles de 10,0 ml. Réfrigérateurs à 2 ± 2 o C. Congélateurs à -20 ± 2 o C. Savons et détergents germicides 3. RÉCEPTION, ENTREPROSAGE ET DÉCONGELATION DES ÉCHANTILLONS 3.1 Vérification des conditions de transport et de l’intégrité des contenants Lorsque les délais de transport (≤ 36 heures) et la température de conservation (≤ 4 °C) des échantillons sont adéquats, vérifier les contenants afin de détecter tout défaut physique. Inspecter minutieusement les sacs de plastique, les bouteilles et autres contenants afin de vérifier s'il y a présence de trous, de fissures ou de perte de liquide. Vérifier si l'eau de la glacière ne s'est pas infiltrée dans l'échantillon. S'assurer que les sacs de plastique (type WhirlPak) soient très bien roulés et fermés hermétiquement. N'importe laquelle des irrégularités citées précédemment invalide 01-D-550 Page 4 de 18 AEV 2007-09-13
  5. 5. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique l'échantillon pour l’analyse microbiologique et le client concerné doit en être informé afin de procéder à un autre prélèvement, si nécessaire. 3.2 Identification et enregistrement des échantillons S'assurer que chaque échantillon est étiqueté et accompagné d'une demande d'analyse ou d’un procès-verbal de prélèvement lui attribuant un numéro de laboratoire officiel et renfermant l'ensemble de toutes les informations y étant rattachées. Vérifier la correspondance entre la description de l'échantillon sur la demande et la nature des échantillons expédiés. Compléter la description, particulièrement si elle a un impact sur l’interprétation des résultats (exemples : produit cuit, produit congelé, produit fermenté, etc.). Procéder aux enregistrements et à la détermination des paramètres analytiques. 3.3 Entreposage des échantillons Généralités 3.3.1 Dans des conditions optimales, on doit toujours analyser les échantillons immédiatement, ou dans le plus court délai après leur réception au laboratoire. Si exceptionnellement l'analyse doit être reportée, entreposer les échantillons à -20 °C, à la température de la pièce, ou à 4 °C, selon la nature de l’échantillon. L'interprétation des résultats devra tenir compte de cette période d’entreposage. Pour les Campylobacters thermotolérants et les bactéries anaérobies strictes, ainsi que pour tout autre microorganisme dont la survie est susceptible d'être fortement compromise par des conditions d'entreposage prolongées ou par une congélation, l'analyse doit absolument être effectuée immédiatement après leur réception ou selon les indications des points 3.3.2 et 3.3.3. A moins d’indication contraire, les échantillons d'aliments périssables ne doivent pas être entreposés plus de 36 heures à une température variant de 0 à 4 o C entre le prélèvement et l’analyse au laboratoire. Les produits non périssables, les conserves ou les aliments secs, doivent être conservés à la température de la pièce dans un endroit réservé à cette fin. Les aliments reçus congelés au laboratoire doivent être entreposés à -20 o C jusqu'au moment de l'analyse. Afin de maintenir la chaîne de froid, les échantillons ne doivent pas séjourner plus de 15 minutes hors du réfrigérateur. Suite au prélèvement, les échantillons sont réfrigérés immédiatement. Par la suite, ils sont congelés (-20 o C) pendant une période à déterminer en fonction des besoins. Les échantillons doivent toujours être classés et conservés dans un endroit propre et à l'abri de toute contamination extérieure. 3.3.2 Préparation de l'échantillon pour le maintien de la viabilité des Campylobacters thermotolérants lors d’un entreposage prolongé avant analyse. 01-D-550 Page 5 de 18 AEV 2007-09-13
  6. 6. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique Si la recherche de Campylobacter ne peut être effectuée lors de la réception, ne jamais congeler l’échantillon. Une conservation à 4 °C pour 3 jours peut être possible et est préférable. Si le produit est salé ou acide, l’analyse doit être effectuée le plus tôt possible. Si la période de conservation avant analyse est supérieure à 3 jours, le protocole suivant doit être suivi. 1- Prélever 25 g d'aliment et diluer avec 75 ml de peptone-sel (5.1.1). 2- Homogénéiser au Stomacher. Éviter d’incorporer trop d’air dans le milieu. 3- Prélever 10 ml de l'homogénat et incorporer 90 ml de milieu Cary-Blair diminué en agar (Annexe A ). 4- Conserver à 4 °C jusqu`à l'analyse. Il est fortement recommandé d'effectuer l'analyse à l'intérieur d'un délai de 7 jours. Pour Campylobacter, la perte de viabilité est beaucoup plus importante à 25 °C qu'à 4 °C. 3.3.3 Préparation de l'échantillon pour le maintien des cellules végétatives de Clostridium perfringens lors d’un entreposage prolongé avant analyse. Généralement, il est recommandé pour les épisodes de toxi-infections alimentaires où l'on soupçonne Clostridium perfringens comme agent étiologique, d’analyser les échantillons immédiatement, ou de les réfrigérer et de les analyser le plus tôt possible. Ne jamais congeler à -20 °C. Certaines souches perdent de la viabilité durant la réfrigération, mais la perte serait plus grande lorsqu’elles sont congelées à -20 °C. Les aliments qui doivent être entreposés pour plus de 48 heures devraient être traités avec un tampon glycérol-sel (Annexe B) pour donner une concentration finale de 10 % en glycérol et entreposé à -70 °C jusqu'à leur analyse. Les échantillons traités avec le glycérol et expédiés dans la glace sèche présentent une perte de viabilité minimale. Lors de l'homogénéisation, mélanger au Stomacher pendant 2 minutes ou manuellement en ayant pris soin d’enlever l’air du sac contenant l'échantillon. 3.4 Décongélation des échantillons Habituellement, les échantillons sont décongelés à 2 - 4 o C pendant un maximum de 18 heures. Si une décongélation rapide est nécessaire, ils peuvent être décongelés à moins de 40 o C pour une durée maximale de 15 minutes. Dans un tel cas, si l'échantillon est décongelé rapidement dans un bain-marie, une agitation continuelle doit être appliquée. 01-D-550 Page 6 de 18 AEV 2007-09-13
  7. 7. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique 4. PRÉLÈVEMENT ET PESÉE 4.1 Définitions 4.1.1 Échantillon : L’unité ou les unités d’échantillonnage prélevées pour l’analyse par le client. 4.1.2 Unité composite : Regroupement des unités d’analyse ou d’échantillonnage pour l’analyse. 4.1.3 Unité d’analyse : La quantité de produit prélevée de l’unité d’échantillonnage pour analyse. 4.2 Mesures d’hygiène et de salubrité 4.2.1 La salle de prélèvement (murs et planchers) doit être, en tout temps, exempte de poussières et de saletés. Avant chaque série de prélèvements, les surfaces de travail doivent être lavées et désinfectées à l'aide d'un détergent germicide reconnu. Des contrôles de la qualité de l'air et des surfaces de travail doivent être effectués régulièrement. 4.2.2 Les manipulations doivent être effectuées toujours de façon aseptique. Le personnel n'oubliera pas que les vêtements, les cheveux, les mains et l'air expiré contiennent ou supportent toujours des microorganismes. Il évitera soigneusement la contamination des produits étudiés. La propreté des mains et des ongles est primordiale. 4.2.3 Pour certains travaux nécessitant une asepsie plus rigoureuse, une stérilité (exemple : prélèvement du contenu des conserves) ou représentant un danger pour la santé humaine, les prélèvements devront être effectués dans une chambre stérile ou sous une hotte à flux laminaire. Les instruments utilisés pour le prélèvement doivent toujours être stériles ou désinfectés, selon le(s) microorganisme(s) recherché(s) et ne servir que pour un seul échantillon. Ils doivent être nettoyés, stérilisés ou désinfectés de nouveau avant chaque usage ultérieur. Les échantillons à prélever doivent être gardés réfrigérés en tout temps. Afin de maintenir la chaîne de froid, les échantillons doivent être sortis en petit nombre à la fois du réfrigérateur et pour un maximum de 15 minutes à la température de la pièce. 4.3 Prise de l'unité d'analyse et pesée 4.3.1 Tous les aliments Toute observation spécifique ou anormale du produit examiné, (exemples : mauvaise odeur, présence de matière brune en suspension, couleur verdâtre) doit être signalée. Lorsqu’une balance régulière est utilisée et que la quantité d'aliment 01-D-550 Page 7 de 18 AEV 2007-09-13
  8. 8. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique prélevée est différente de 25 g, cela doit être noté dans le cahier des prélèvements. Pour chaque pesée, le numéro d'échantillon et les initiales de la personne qui prélève doivent être inscrits dans le cahier des prélèvements. Si un diluteur automatique est utilisé comme balance, un enregistrement sur étiquette ou support informatique est conservé. L'extérieur des contenants des échantillons doit toujours être propre avant le prélèvement. Nettoyer et désinfecter avec de l'éthanol 70 %, au besoin. Peser 25 g de l'échantillon dans un sac stérile de polyéthylène ou un contenant de verre stérile préalablement taré. En général, il est important de prélever au minimum à 4 ou 5 endroits dans l'échantillon afin d'obtenir la représentativité. Si l'aliment est composé de plusieurs éléments, chaque élément sera prélevé dans une proportion sensiblement équivalente à celle qu'il représente; la prise de l'unité d'analyse devra comporter des parties superficielles et des parties profondes dans les mêmes proportions que dans l'aliment sauf lors de spécifications particulières. Dans certains cas, lorsque spécifié par le professionnel, l'analyse de chaque portion différente peut être réalisée séparément (exemple : sandwich, analyse de la garniture seulement). Si la totalité de l'échantillon est de moins de 25 g, peser l'échantillon au complet et additionner une quantité du diluant requis pour obtenir une dilution 1 :10. Le volume total de liquide doit couvrir l'échantillon. À noter que l’utilisation du poids pour l’ajout du diluant est considérée comme un moyen plus fiable d’obtenir la dilution désirée. 4.3.2 Aliments liquides ou semi-liquides Mélanger jusqu’à homogénéisation complète. S'il s'agit d'échantillons liquides, prélever 25 g ou 25 ml et s’il s’agit d’échantillons semi-liquides, prélever 25 g. 4.3.3 Regroupement des unités d’analyse pour la recherche de bactéries pathogènes telles Salmonella et Listeria monocytogenes (unité composite) Application Les échantillons peuvent être regroupés par deux pour la recherche de Salmonella et de Listeria monocytogenes, par exemple. Éviter de regrouper des échantillons relatifs aux toxi-infections, aux plaintes de consommateurs et aux saisies particulièrement pour la recherche de la bactérie pathogène incriminée. Protocoles Ne regrouper que des produits de composition et de caractéristiques physico- chimiques similaires (Exemple : pH). Respecter les numéros de lots s'il y a lieu. a) Dans les cas où le prélèvement sert également à l’analyse de bactéries indicatrices, effectuer le regroupement de la façon suivante : 01-D-550 Page 8 de 18 AEV 2007-09-13
  9. 9. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique Peser 25 g de chacun des échantillons (2) dans 2 sacs à Stomacher distincts. Ajouter 225 ml de milieu d'enrichissement à salmonelles ou autre, selon le pathogène recherché et homogénéiser au Stomacher séparément. Prélever les aliquotes nécessaires aux analyses des bactéries indicatrices ( Ex : E. coli) et autres, si requis. Par la suite, combiner les 2 homogénats dans le même sac en transvidant et poursuivre l’analyse. Note. Le milieu de pré-enrichissement utilisé ne doit pas avoir d’effet inhibiteur sur l’ensemble des bactéries recherchées, sinon, effectuer un autre homogénat avec de l’eau peptone-sel 0,1 %. b) Si l’analyse d’un pathogène seulement est requise : Peser 25 g de chacun des 2 échantillons dans un même sac. Ajouter 225 ml du diluant approprié et homogénéiser les 2 prélèvements ensemble au Stomacher. Par la suite, ajouter un autre 225 ml de diluant à l’homogénat et homogénéiser manuellement. Incuber et poursuivre l’analyse. Si le résultat s'avère positif, reprendre l'analyse des 2 échantillons distinctement, si nécessaire, ou refaire prélever par le client. 4.3.4 Viandes 4.3.4.1 En bloc Prélever le premier centimètre de surface à 4 ou 5 endroits à l'aide d'un instrument stérile. 4.3.4.2 Prélèvement sur une tranche (ou portion individuelle) Ce prélèvement s’applique sur les parties superficielles et profondes. Dégager, si nécessaire, la tranche de son emballage au moyen des ciseaux ou du bistouri puis la placer sur le plateau en l'étalant complètement. Au moyen de la pince et du couteau, prélever une languette en effectuant deux sections parallèles à 1 cm de distance dans la partie médiane de la tranche et perpendiculairement à son grand axe. Découper cette languette en plus petits fragments qui seront placés dans le sac de plastique prévu à cet effet. 4.3.5 Poisson entier cru Enlever la peau à l'aide d'instruments stériles et prélever le premier centimètre de surface à 4 ou 5 endroits. 4.3.6 Mollusques crus - Les coquilles des mollusques doivent être lavées et brossées à l'eau potable courante jusqu'à ce que les crevasses et les interstices soient propres et exempts de boue. - Rincer à l'eau du robinet et assécher avec un essuie-tout. 01-D-550 Page 9 de 18 AEV 2007-09-13
  10. 10. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique - Une manipulation supplémentaire peut être effectuée si requise, en désinfectant la surface des coquilles avec de l'alcool 70 % particulièrement près de l'ouverture. Utiliser des instruments stériles pour ouvrir les coquilles. Récupérer le liquide et détacher la chair avec un couteau et des pinces en évitant toute contamination par l’extérieur de la coquille. - S'il y a présence de byssus, le couper aux ciseaux avant ouverture, mais ne pas l'arracher. 4.3.7 Crustacés non décortiqués crus ou cuits Les crustacés tels que le homard et le crabe sont décortiqués avec des instruments stériles et la chair est prélevée à l'aide de pinces stériles à 4 ou 5 endroits de l'échantillon. Les petites crevettes sont décortiquées à l'aide de pinces stériles et la chair en est prélevée. Plusieurs crevettes constituent alors l’unité d’analyse. 4.3.8 Volaille crue avec peau En général, prélever une proportion peau et muscle (premier centimètre) à 4 ou 5 endroits sur la coupe de volaille. Pour les volailles entières crues, la recherche de salmonelles est préférablement effectuée sur 25 g de muscles pectoraux et de peau. 4.3.9 Oeufs 4.3.9.1 Procédure de prélèvement pour la détection des salmonelles sur la coquille et à l'intérieur des œufs Faire un groupe de 4 ou 6 oeufs par échantillon. Ceux-ci ne doivent avoir aucune craquelure. Extérieur À l'aide d'une pince stérile, prendre les oeufs et les déposer doucement dans un sac stérile contenant 225 ml d'eau peptonée tamponnée. Laver les coquilles délicatement avec le diluant, puis les retirer (toujours à l'aide de la pince) et les déposer dans un contenant d'éthanol 70 %. L'eau peptonée tamponnée est par la suite incubée à 35 o C. Intérieur Les oeufs sont retirés immédiatement du bain contenant l'éthanol 70 % (étape précédente) et déposés sur un papier absorbant pour enlever l'excès d'alcool. Ne pas laisser tremper les œufs dans l’alcool. Par la suite, permettre un temps de contact de 10 minutes. Les 4 à 6 oeufs sont cassés dans un sac stérile. Le technicien doit porter une nouvelle paire de gants entre chacun des échantillons (4 à 6 œufs). 01-D-550 Page 10 de 18 AEV 2007-09-13
  11. 11. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique Bien mélanger au Stomacher les oeufs pendant environ 30 secondes. Avec une pipette stérile, prélever 50 g (pour 4 à 6 œufs) du mélange et ajouter environ 200 ml d’eau peptonée tamponnée. Agiter au Stomacher 2 minutes et compléter à 500 g avec le diluant afin d’obtenir la dilution 1 :10. 4.3.9.2 Procédure pour analyse de l’intérieur seulement Laver les oeufs à l'eau et au savon germicide. Nettoyer à l'éthanol 70 % à l'aide d'un coton stérile et laisser sécher (une précaution supplémentaire peut être apportée en flambant l’œuf à l'extrémité opposée de la chambre d'air jusqu'à ce qu'une très mince couche d'albumen soit coagulée et collée sur la coquille). Briser délicatement la coquille avec un couteau stérile ou en portant des gants stériles pour dégager l'intérieur de l’œuf. 4.3.10 Laits secs Mélanger soigneusement le contenu du récipient fermé en secouant manuellement de façon répétée. Peser 25 g de l'échantillon directement dans le flacon contenant 225 ml de diluant réchauffé à 40 o C. Un pré-trempage dans le diluant de 30 minutes à température de la pièce est nécessaire avant d'homogénéiser. Cette étape consiste à revivifier les cellules microbiennes endommagées. Agiter 25 fois le flacon afin d'homogénéiser le produit dans le diluant. Laisser la mousse se disperser avant d'effectuer la prise d'essai (3 minutes au maximum). Note : Dans le but d'avoir une meilleure reconstitution, en particulier pour certaines poudres difficiles à dissoudre, il peut être utile d'employer des billes de verre préalablement stérilisées. 4.3.11 Produits chambrés Les diluants utilisés pour les produits chambrés doivent être à la température de la pièce. 4.3.12 Produits gras (beurre, margarine, saindoux, etc.) et fromages gras Utiliser un diluant contenant du citrate de sodium 2 % comme dispersant. Utiliser le diluant préalablement chauffé à 45 o C pour permettre une émulsion complète du gras avant l'homogénéisation. Homogénéiser et prélever dans la phase aqueuse en évitant de prélever du gras. Ensemencer dans les 15 minutes. 4.3.13 Produits secs déshydratés (exemples : épices, céréales, légumineuses sèches, riz sec) Mélanger soigneusement les échantillons secs avec un ustensile stérile avant de prélever. Un pré-trempage dans le diluant de 30 minutes à température de la pièce est nécessaire avant d'homogénéiser. Cette étape consiste à revivifier les cellules microbiennes endommagées. 01-D-550 Page 11 de 18 AEV 2007-09-13
  12. 12. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique Note : Pour la recherche de Salmonella spp., des rapports de dilution (poids/volume) entre les épices ou assaisonnements et le bouillon d’enrichissement sont recommandés (autre que 1 : 10). Certaines épices sont bactéricides ou bactériostatiques, c’est pourquoi une dilution supérieure est nécessaire (voir page suivante). 01-D-550 Page 12 de 18 AEV 2007-09-13
  13. 13. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique Rapport recommandé entre les épices et les assaisonnements et le bouillon de pré-enrichissement (p/v)1 Aneth, graines 1:10 Macis, poudre 1:10 Anis vert 1:10 Marjolaine 1:10 Arrow-root, poudre 1:10 Menthe, flocons 1:20 Assaisonnement à l'italienne 1:20 Menthe, poudre 1:10 Assaisonnement (suprême) 1:10 Moutarde, graines 1:10 pour salade Muscade (noix entières) 1:10 Basilic, feuilles 1:20 Oignon, poudre 1:10 Orange, morceaux 1:10 Cannelier, fleurs 1:20 Origan, feuilles 1:50 Cannelle, bâtons 1:10 et 1:100 Cardamome, graines 1:10 Paprika 1:10 Cari, poudre 1:10 Pavot, graines 1:10 Carvi, graines 1:10 Persil, flocons 1:20 Casse, bourgeons Piment de la Jamaïque 1:10 et 1:100 Casse, poudre 1:50 Piment de la Jamaïque, poudre 1:20 et 1:100 Céleri, flocons 1:20 Piment du Chili, entier 1:10 Céleri, graines 1:10 Poivre au citron 1:50 Cerfeuil, feuilles 1:20 Poivre blanc 1:10 Champignons, tranches 1:20 Poivre de Cayenne 1:10 Ciboulette hachée 1:20 Poivre, grains 1:10 Clou de girofle 1:50 et 1:1000 Poivre noir 1:10 Coriandre, graines 1:10 Crème de tartre 1:10 Romarin, feuilles 1:10 Cumin, graines 1:10 Curcuma, poudre 1:10 Safran 1:20 Sarriette moulue 1:50 Estragon 1:20 Sauge, feuilles 1:20 Épices pour tarte à la citrouille 1:50 Sésame, graines 1:10 Fenouil, graines 1;10 Thym, poudre 1:50 Fines herbes pour salade 1:10 Zeste de citron 1:10 Gingembre, racine 1:10 Laurier, feuilles 1:20 Légumes, flocons 1:20 Pour la poudre ou les flocons d’ail ou d’oignons, utiliser du bouillon trypticase renfermant 0,5 % de K2SO3 (rapport 1 : 10). 1 Modifié le tableau pour s’adapter à la méthode MFHPB-20. 01-D-550 Page 13 de 18 AEV 2007-09-13
  14. 14. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique 4.3.14 Graines de germes (luzerne, radis, mung, etc.)2 1.Peser de façon stérile 125 g de graines dans un contenant stérile (par exemple, un ou deux grands plats de Pétri de 14 cm) et ajouter de l'eau distillée stérile jusqu'à ce que le niveau dépasse les graines. Recouvrir de façon stérile et incuber à 30 °C pendant trois jours. 2. Le premier volume d'eau ajouté sera absorbé après environ deux heures. Ajouter encore de l'eau pour rétablir le niveau. Continuer de surveiller le niveau d'eau pendant le reste de la période d'incubation et en ajouter encore au besoin. 3. Après trois jours d'incubation, les enveloppes devraient avoir éclaté et une certaine germination devrait être apparente. Il faut plus de temps à certaines graines qu'à d'autres pour germer, mais trois jours devraient suffire dans la plupart des cas. Peser de façon stérile 25 g de la «boue» germée (c.-à-d. mélange de graines germées et d'eau) et ajouter à 225 mL de bouillon nutritif pour pré-enrichissement pendant la nuit. Exécuter la méthode MFHPB-20. 4.3.15 Analyse de surface par lavage Il arrive que le produit alimentaire ou un contenant ne soit contaminé qu'en surface ou encore que sa flore superficielle présente un intérêt particulier pour le contrôle. Dans ces cas, une homogénéisation par broyage n'est pas effectuée ; les microorganismes superficiels doivent être délogés pour les mettre en suspension. Les résultats peuvent être rapportés soit par poids de l'aliment, soit par la surface totale analysée ou simplement par la présence ou l’absence du microorganisme recherché. En règle générale la surface à analyser est mise en contact avec un diluant approprié, contenant fréquemment un agent tensioactif non bactéricide (exemple : tween 80), et une agitation manuelle est effectuée. Éviter d'ajouter trop de diluant qui entraînerait une dilution trop grande. Il faut suffisamment de diluant pour permettre un bon lavage de la surface. Puis, prélever la suspension microbienne à l’aide d’une pipette pour analyse subséquente. Le volume de diluant obtenu est noté pour permettre de calculer le compte pour la surface totale. 4.3.16 Produits très salés (>5 %) Pour le dénombrement de la microflore générale (bactéries, levures et moisissures), le diluant utilisé doit contenir 5 % de NaCl. Utiliser ce diluant pour la suspension- mère et les dilutions subséquentes. Par la suite, choisir le milieu de culture nécessaire pour éviter les effets de la pression osmotique. 4.3.17 Produits très sucrés (miel, sucreries, sirop d’érable, etc.) Pour la recherche d’une microflore générale (numération bactérienne des levures ou des moisissures) lorsqu’un aliment renferme plus de 25 % de sucre, utiliser un diluant à 40 % de sucre (exemple : eau peptonée 0,1 % + 40 % dextrose) afin d’éviter la perte des cellules osmophiles. Utiliser ce diluant pour la suspension mère et les dilutions décimales subséquentes. Le milieu de culture devra aussi contenir 40 % de sucre. 2 Modifié la procédure de germination pour s’adapter à la méthode MFHPB-20A. 01-D-550 Page 14 de 18 AEV 2007-09-13
  15. 15. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique 4.3.18 Conserves Se référer à la méthode 01-M-020. 4.3.19 Fromages Lorsque la croûte de fromage est consommable, elle doit être prélevée représentativement en fonction de la proportion qu’elle représente (exemple : plusieurs pointes à différents endroits). Selon l’analyse à effectuer, si les moisissures utilisées pour l’affinage de certains fromages provoquent de l’interférence pour la lecture des résultats, enlever la croûte avant de prélever l’unité d’échantillonnage. 4.3.20 Éponges À la réception de l’échantillon, il est considéré que la dilution est 10-1 . Le diluant approprié est ajouté jusqu'à l’obtention d’un poids de 100 g (10-2 ). 5. DILUANTS Le choix d’un diluant est fonction du produit à analyser; également le type de microorganisme à rechercher peut être un facteur déterminant dans le choix d’un diluant. Se reporter aux normes spécifiques des produits et à la méthode d’analyse. Lorsque les analyses ne requièrent pas la recherche de salmonelles, le diluant général « Peptone-Sel » (selon la norme ISO 6887 ) semble le plus approprié pour la majorité des aliments. 5.1 Choix du diluant approprié 5.1.1 Diluant d’emploi général Peptone-sel Peptone 1,0 g Chlorure de sodium 8,5 g Eau 1 000 ml Dissoudre les ingrédients et distribuer. Stériliser 15 minutes à 121 ºC. pH final : 7,0 ± 0,2 5.1.2 Diluant à utiliser si les analyses incluent la recherche de Salmonella spp. Eau peptonée tamponnée Peptone 10,0 g Chlorure de sodium 5,0 g Phosphate disodique (Na2HPO4) 3,5 g Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) 1,5 g Eau 1 000 ml Dissoudre les ingrédients et distribuer. Stériliser 15 minutes à 121 ºC. 01-D-550 Page 15 de 18 AEV 2007-09-13
  16. 16. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique pH final : 7,2 ± 0,2 5.2 Bouillons d’enrichissement initiaux Lors du regroupement des unités d’échantillonnage et pour les unités d’échantillonnage d’un poids supérieur à 25 g, tous les bouillons d’enrichissement initiaux doivent être chauffés à environ la température d’incubation avant de procéder à la dilution des échantillons avec le bouillon, à l’exception d’une analyse dont la température d’incubation est supérieure à 35 ºC, telle que E. coli O157 ou Shigella spp. Le bouillon de ces analyses doit être préchauffé à environ 35 ºC. Le bouillon préchauffé doit être utilisé dans la journée. Pour les bouillons d’enrichissement secondaire, ainsi que pour les unités d’échantillonnage de 25 g ou moins, il est acceptable que la température du bouillon soit augmentée seulement à la température ambiante avant de procéder à l’analyse. 6. BROYAGE ET HOMOGÉNEISATION 6.1 Définitions 6.1.1 Suspension mère (première dilution) Suspension, solution ou émulsion obtenue après qu’une quantité pesée (unité d’analyse) du produit à analyser ait été mélangée, si nécessaire, en utilisant un homogénéisateur et en observant des précautions appropriées, avec une quantité neuf fois égale de diluant, sauf exception, en laissant se déposer les particules grossières, s’il y en a. Note 1 : Dans certains cas, il peut être nécessaire d’ajouter davantage de diluant, notamment pour les produits donnant une suspension mère 1:10 trop visqueuse ou trop épaisse. On devra en tenir compte dans la suite des opérations et dans l’expression des résultats. Note 2 : Cette première dilution permet une limite de détection minimum de 10 UFC (unité formant une colonie) par gramme. S’il est souhaitable pour certains dénombrements dans certains produits de descendre au-dessous de ce seuil, il est possible de réaliser une suspension avec une quantité inférieure de diluant. Par contre, il doit être convenu que l’ensemencement de cette suspension peut éventuellement entraîner des difficultés liées au déséquilibre du rapport inoculum/milieu. 6.1.2 Dilutions décimales subséquentes Suspensions ou solutions obtenues en mélangeant un volume déterminé de la suspension mère avec un volume neuf fois égal de diluant, et en répétant cette opération sur chaque dilution ainsi préparée, jusqu’à l’obtention d’une gamme de dilutions décimales appropriées pour l’inoculation des milieux de culture. 6.2 Procédures Il est suggéré d'utiliser un homogénéisateur de type péristaltique (Stomacher) plutôt qu'un mélangeur de type rotatif pour le broyage des échantillons. Une 01-D-550 Page 16 de 18 AEV 2007-09-13
  17. 17. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique homogénéisation complète de l'aliment n'est pas nécessaire. Les microorganismes seront délogés de l'échantillon par de forts jets de liquide et par l'écrasement de l'aliment. Habituellement, l'aliment devrait être homogénéisé pour une période d’ une minute et demie. Selon la consistance, l'homogénéisation peut être prolongée jusqu'à 2 minutes. L'homogénéisateur péristaltique ne doit pas être utilisé pour certains produits alimentaires tels que : - les produits risquant d'entraîner des perforations du sac (présence de particules pointues, dures ou sèches); - les produits difficiles à homogénéiser de par leur texture (par exemple : saucisson sec). Dans ces cas, l’homogénéisation manuelle est privilégiée. La distribution des microorganismes dans un aliment est plus ou moins uniforme. Pour assurer une meilleure répartition des microorganismes, agiter les échantillons liquides et semi-liquides environ 25 fois. La période entre l'agitation et le prélèvement ne devrait pas excéder 3 minutes. Après le broyage ou l'homogénéisation, la suite de l'analyse (les dilutions et l'ensemencement) doit avoir lieu le plus rapidement possible pour éviter une multiplication des microorganismes dans le liquide de dilution enrichi par le produit alimentaire broyé et plus ou moins dissous. L'ensemble des manipulations, de la suspension mère jusqu'à l'ensemencement sur gélose ou bouillon, doit être effectué dans un délai maximum de 45 minutes. Après l’homogénéisation, laisser les grosses particules se déposer, si nécessaire, pendant 15 minutes au maximum. Ne pas attendre plus de 10 minutes entre les dilutions décimales et l'incorporation à la gélose. Une partie de l'homogénat peut être conservée au congélateur à -20 o C suite à l'ajout de glycérol (en concentration finale de 10 %). MESURE DU pH des DILUANTS ET DES BOUILLONS D’ENRICHISSEMENT ; Bien que cela ait été mentionné dans les versions précédentes de certaines méthodes, l’ajustement du pH du diluant avec la matrice alimentaire avant l’ensemencement n’est pas recommandé pour les méthodes quantitatives, sauf lorsque précisé par le fabricant (par exemple 3M exige un ajustement pour les Petrifilm). Ceci permet au produit d’être évalué tel que présenté au consommateur, empêchant tout biais (positif ou négatif) qui en découlerait si le pH était ajusté avant l’ensemencement. Ce point sera corrigé dans les versions révisées de ces méthodes. Pour les méthodes qualitatives l’ajustement du pH du bouillon d’enrichissement avec la matrice alimentaire est encore nécessaire s’il est mentionné dans la méthode. 01-D-550 Page 17 de 18 AEV 2007-09-13
  18. 18. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique 7. ANNEXE A – Milieu de conservation Cary-Blair. (optimisé pour Campylobacter spp. ) Thioglycolate de sodium……………………………1,5 g Phosphate disodique………………………………….1,1 g Chlorure de sodium................................5,0 g Chlorure de calcium………………………………….0,09 g Pyruvate de sodium…………………………………….10 g Agar…………………………………………………………….1,6 g Dissoudre les ingrédients dans 1 litre d’eau purifiée. Chauffer doucement jusqu’à ébullition pour dissoudre l’agar. Ajuster le pH à 8,4. Distribuer et stériliser par vapeur d’eau pendant 15 minutes. pH final : 8,4 ± 0,2 B- Milieu tamponné glycérine-sel Glycérol………………………………………………….100 ml Phosphate dipotassique…………………………12,4 g Phosphate monopotassique…………………….4,0 g Chlorure de sodium…………………………………4,2 g Dissoudre le chlorure de sodium dans environ 500 ml d’eau purifiée et y ajouter le glycérol et les phosphates. Ajuster le pH à 7,2 et compléter à 1000 ml. Distribuer et stériliser à l’autoclave à 121 ºC pendant 15 minutes. 01-D-550 Page 18 de 18 AEV 2007-09-13
  19. 19. Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique 8. BIBLIOGRAPHIE Bacteriological Analytical Manual, 2003, Division of Microbiology, Center for Food Safety and Applied Nutrition, U.S. Food and Drug Administration, Chapitre 1-Food sampling and preparation of sample homogenate. BOURGEOIS, C.M. et J.Y. LEVEAU, 1991, Techniques d'analyse et de contrôle dans les industries agro-alimentaires : Le contrôle microbiologique, Chapitre 2, 2e édition, Lavoisier - Tec & Doc, Paris. 572 p. VANDERZANT, C. et D.F. SPLITTSTOESSER, 1992, Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods, Chapitre 2, 3e édition, APHA, U.S., 1219 p. Analyse microbiologique, 1996, Méthodes sectorielles, Tome 2, Contrôle de la qualité des produits alimentaires, AFNOR, 6e édition. LUECHTEFIELD, N.W., WANG, W.-L., BLASER, M.J., & L. RELLER, Evaluation of Transport and Storage Techniques for Isolation of Campylobacter fetus subsp jejuni from Turkey Meat Specimens, J Clin Microbiol. 1981 Mar ;13:438-43 Compendium des méthodes pour l’analyse microbiologique et la détection de matières étrangères dans les diluants, Méthodes officielles pour l’analyse microbiologique des aliments, Volume 1 - Annexe I 2003 et supplément à l’annexe I juin 2005, Direction générale de la protection de la santé, Santé Canada, Gouvernement du Canada. Compendium des méthodes pour l’analyse microbiologique et la détection de matières étrangères dans les diluants, Méthodes officielles pour l’analyse microbiologique des aliments, Volume 2 – Méthode MFHPB-20, Isolement et identification des Salmonella dans les aliments (Tableau V), ainsi que MFHPB-20A, Modification de la procédure MFHBP-20 pour l’analyse de graines utilisées dans la production de semences, Direction générale de la protection de la santé, Santé Canada, Gouvernement du Canada. 9. APPROBATION Christine Barthe, Microbiologiste Kim Weaver, Technicienne qualité technique au service de microbiologie Daniel Tremblay, Chef du Service de la microbiologie 01-D-550 Page 19 de 18 AEV 2007-09-13

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