6. 2. Activité enzymatique
enzyme
Substrat produit
Disparition du substrat
Apparition du produit
- Activité réelle
dynamique
- Activité potentielle
Traceurs et marquage
- fluorescent, coloré
- isotopique stable ou radioactif
7. 2.1- Dynamique AUTOCLAVED
150
Fe(II)
Quantifier substrats et produits 100
Fe (II) uM
Au cours du temps
50
Réduction de Fe (III) 0
0 200 400 600 800
time (h)
Inhibiteurs ou compétiteurs
nitrapyrine NH4+ oxidase
chlorate NO2- oxidase
C2H2 N2O réductases
8. 2.2- Traceurs et marqueurs
Ajout de substrat devenir?
- chromogène ou fluorogène
- marquage isotopique
Attention!!!
Activité potentielle
- Microcosmes (radioactifs, chromogène, fluorogène)
- Nature (isotopes stables)
9. Substrat chromogène ou fluorogène
Colorimétrie
Microplaque Biolog
INT
respiration
INT-formazan
Fluorimétrie
Methylumbellyferone
Amino-methylcoumarine
12. Isotopes stables Fractionnement
Soufre 32S, 33S, 34S, 35S
Isotope + léger réagit + vite
Desulfovibrio spp.
SO42- H2S enrichi en 32S
Desulfatomaculum spp.
Rapport isotopique
34S/32S – 34S/32Sstandard
échantillon
δ34Sechantillon = x 1000
34S/32S
standard
13. Spectromètre de masse + GC
Séparation et identification Rapport masse/charge
des isotopes
• 13C/12C = 0.011225
ions
• 13C/12C = 0.011071
• 13C/12C = 0.010918
Bombardement e-
Masse molaire
14. 3- Biomasse
Densité = nb de cellule par volume ou par surface
Biomasse = mg de C par volume ou par surface
fg C Cell-1
culture
Escherichia coli 109-323
bacterioplancton
Antarctique 7-13
15. 2 Stratégies:
Comptage direct
DIRECT
Biomarqueurs
Quantité?
INDIRECT culture
17. 2.2. CULTURE LIQUIDE Estimation statistique
Nombre le plus probable (NPP)
1 ml dans 9 ml
Table de Mac Grady (extrait)
NPP
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
3 2 0 9
+ + + - -
+ - - - - 3 2 1 15
+ + - - - 3 2 2 21
3 2 1 0 0
Bactéries/ml = 15/10-2 = 1500
18. 2.3. COMPTAGE DIRECT
Hémocytomètre Microscope Eucaryotes
photonique
Electrolyte Compteur de particules
= cytomètre de flux
Fluorescence
Microscope à
épifluorescence
28. PCR en temps réel
Sonde TaqMan
mesurer à chaque cycle d’amplification la quantité
d’ADN par marquage fluorescent
log[ADN]=a(nombre de cycle)+b
[ADN]
Nb de cycles
29. 4- Diversité génétique = Acides nucléiques
ARNm = diversité phénotypique
ADN = diversité génotypique
- Population
- Groupes fonctionnels
- Communauté
PROFIL = code barre de l’espèce ou de la communauté
SEQUENCE = succession de paires de base
30. Quel gène amplifier?
- ARN ribosomal genres et espèces
16S ITS 23S
- Eléments répétés espèces
- DNA gyrase (gyrA et gyrB) espèces
- Gènes fonctionnels groupes fonctionnels
Ex. Nir K et Nir S codent des nitrites réductases
dénitrification
31. Séparation par la TAILLE
Fragments de taille variable
ITS, éléments répétés, microsatellites
Paires de bases
- 1000
Électrophorèse
500
en cuve ou en
capillaire
+ 200
Gel d’agarose ou d’acrylamide
par LC (pair d’ions)
32. Fragments de même taille ARNr 16S, gènes fonctionnels
Couper avec une enzyme de restriction
POPULATION
A B
Souche
RFLP
(restriction fragment
length polymorphism)
33. COMMUNAUTE Trop de bandes
*
Espèce A
amorce fluorescente* *
Espèce B
A B A+B A+B
*
Gel d’acrylamide
(electrophorèse *
capillaire) RFLP tRFLP
34. Séparation par la COMPOSITION
% bases G+C DENATURATION
Électrophorèse sur gel d’acrylamide
GC clamp Amplicon
Gradient dénaturant chimique (DGGE)
ou
thermique (TGGE, TTGE)
Élution à 65 ºC
dHPLC
pair d’ions
35. CONFORMATION = SSCP
Single strand conformation polymorphism
Électrophorèse d’acrylamide
(gel ou capillaire)
ARNr 16S, gènes fonctionnels Dans le gel à 20°C les simples
brins se replient sur eux-mêmes
A+B
Dénaturation (98°C-5 min)
2 simples brins
36. Analyse du profil = Diversité et structure
Richesse: nombre de phylotypes
chaque bande = 1 phylotype ou OTU
Structure: profil de bandes
Similarité entre 2 communautés = similarité entre 2
profils
Composition? Quelles espèces?
37. Identification = séquençage
Analyse phylogénétique
Électrophorèse
ou dHPLC
Séquençage
séparation des Identification
phylotypes
