1. Calibration de la méthode
Quantification en mélanges ternaires
Distinction isomérique et quantification de
monosaccharides par la méthode cinétique
Distinction isomérique et quantification de
monosaccharides par la méthode cinétique
L'expression de la correction entre phase liquide et phase gazeuse en mélange ternaire est immédiatement dérivée de la
correction en mélange binaire, en considérant des constantes d'équilibres propres à un sucre i, j ou k dans un mélange
ternaire i/j/k pour un système M / Réf.
g
i =
K i
i, j, k
kK
i, j, k i
l.
.
K i
i, j, k
kK
i, j, k +i
l 1-( (
g
i
g
j -
K j
i, j, k
kK
i, j, k j
l. +
g
i =
K i
i, k
kK
i, k i
l.
+i
l.
K i
i, k
kK
i, k 1-( (
g
i
g
j -
K j
j, k
kK
j, k j
l. +
Conclusion
L'utilisation de métaux de transition et d'acides aminés natifs dans le cadre de la méthode cinétique appliquée à la distinction
isomérique permet d'obtenir des systèmes discriminants pour trois monosaccharides (D-glucose, D-galactose et D-fructose).
Leur quantification en mélanges binaires et ternaires est possible en considérant une correction par une constante d'équilibre
entre fractions en phase liquide et en phase gazeuse, liée en partie à l'impact de la composition isomérique du mélange sur la
formation/ionisation du cluster trimérique associé à un isomère.
Cette constante est toutefois susceptible de décrire d'autres phénomènes impliquant une réponse non linéaire, en particulier
des phénomènes entropiques.
La procédure de correction trois points fournit une méthode performante pour la quantification de monosaccharides en mélange,
tant en terme de justesse que de répétabilité, l'écart-type mesuré étant de l'ordre du pourcent.
Cette méthode peut être étendue à N isomères en mélange, sous réserve d'obtenir au préalable N-1 systèmes M / Réf
discriminants pour les N analytes, et d'effectuer les 2 parmi N calibrations trois points des mélanges binaires pour déterminer les
constantes d'équilibres (soit les coefficients correcteurs) associées. La moyenne des N valeurs obtenues pour chaque fraction
molaire doit alors constituer une bonne approximation de la fraction réelle en phase liquide.
Remerciements
Cette étude a pu être réalisée grâce aux moyens techniques du
Spectropôle, service commun d'analyse des Universités d'Aix-Marseille,
qui nous a donné un accès privilégié au parc instrumental acquis grâce à
des fonds européens (FEDER OBJ2142-3341).
Références
[1] Smith, G. ; Leary, J. A. ; Journal of the American Chemical
Society 1998, 120, 13046 - 13056
[2] Salpin, J.-Y. ; Tortajada, J. J. Mass Spectrom. 2002, 37, 379-388
[3] Augusti, D. V. ; Carazza, F. ; Augusti, R. ; Tao, W. A. ; Cooks, R.
G., Analytical Chemistry 2002, 74, (14), 3458 - 3462
[4] Fouquet, T. ; Charles, L. Journal of the American Society for Mass
Spectrometry, soumis pour publication
[5] Wu, L. ; Meurer E. C. ; Cooks, R. G. Analytical Chemistry 2004,
76 (3), 663 - 671
[6] Wu, L. M. ; Lemr, K. ; Aggerholm, T. ; Cooks, R. G., Journal of the
American Society for Mass Spectrometry 2003, 14, (2), 152 - 160
[7] Zhang, M. Y. ; Kerns, E. ; McConnell, O. 51st ASMS Conference
on Mass Spectrometry and Allied Topics, Montreal, Quebec, 2003 ;
Montreal, Quebec, 2003
[8] Lemr, K. ; Ranc, V. ; Frycak, P. ; Bednar, P. ; Sevcik, J., Journal of
Mass Spectrometry 2006, 41, (4), 499 - 506
Thierry Fouquet et Laurence Charles
Universités Aix-Marseille I, II & III - CNRS, UMR 6264 : Laboratoire Chimie Provence, Spectrométries Appliquées à la Chimie Structurale, 13397 Marseille cedex 20
La détermination numérique de ces constantes d'équilibre nécessiterait un étalonnage supplémentaire par la mesure de ratio
R en mélange ternaire connu. Toutefois, nous proposons ici d'utiliser les coefficients correcteurs obtenus avec les mélanges
binaires pour la quantification des mélanges ternaires, en supposant que l'impact d'un isomère j sur un isomère i , imagé par la
constante d'équilibre, n'est pas influencé par la présence d'un isomère k.
Cette hypothèse implique alors l'obtention de trois jeux de résultats pour les fractions molaires en phase liquide, selon l'identification du
composé k (dans l'expression ci-jointe) au fructose, au galactose ou au glucose.
La méthode retenue consiste en une moyenne arithmétique des trois valeurs obtenues pour chaque fraction molaire en phase
liquide. Cette opération revient à considérer qu'un mélange ternaire i/j/k peut être modélisé par la somme des trois mélanges binaires
dérivés i/j, i/k et j/k en terme de compétition pour la formation des clusters.
34,3 (0,5) 15,8 (1,1) 49,9 (1,2)
35,0 15,0 50,0
33,2 (0,5) 34,0 (1,0) 32,8 (0,9)
33,3 33,3 33,3
49,4 (0,6) 35,9 (0,9) 14,7 (1,1)
50,0 35,0 15,0
gal fruglc
mesuréi
l
i
l réel
gal fruglc gal fruglc
Introduction
Si les sucres dans leur ensemble interviennent dans une grande variété de processus biologiques, du stockage de l'énergie à la
reconnaissance cellulaire, leur quantification en mélange prend toute son importance lorsqu'ils sont utilisés comme base pour l'élaboration
de principes actifs ou de vecteurs, ou pour la production de biocarburants à partir de la biomasse.
Diverses techniques analytiques peuvent évidemment être mises en oeuvre pour l'étude de sucres. La résonance magnétique nucléaire est
capable de caractériser des isomères de mono et polysaccharides, ou de distinguer les différentes formes cycliques et anomériques mais
se heurte à la complexification rapide des signaux en mélanges binaire et ternaire. Les méthodes chromatographiques peuvent quant à
elle devenir longues à mettre en oeuvre.
En revanche la spectrométrie de masse peut avec succès identifier et/ou quantifier des sucres en mélange, par l'étude du profil de
fragmentation d'adduits métalliques par exemple, ou par l'application des variantes de la méthode cinétique. Développée à l'origine pour
la détermination de propriétés thermochimiques comme l'affinité protonique, elle fut mise en oeuvre pour la distinction et la quantification
d'un vaste panel de composés chiraux (acides aminés, acides alpha-hydroxylés, peptides, ...).
Les travaux présentés concernent l'application de la méthode cinétique pour la quantification de monosaccharides isomères, illustrés par le
glucose, le galactose et le fructose, en mélanges binaires et ternaires.
[1, 2]
[3]
[4]
Les fractions molaires moyennes en phase liquide pour les différents mélanges ternaires proposés ci-dessus sont en très bon accord avec les
fractions réelles en mélange. A cette justesse s'ajoute une très bonne répétabilité des mesures, l'écart-type obtenu étant au maximum de
l'ordre d'un pour cent.
gg
iln (R ) = +.ln (R ) 1 -( ( ln (R ).mesuré ii j
i
l
Le logarithme du ratio n'est alors plus linéaire en fonction de la
fraction molaire en phase liquide , mais en fonction de la
fraction molaire en phase gaz , selon une relation analogue.
Une calibration trois points, réalisée en corrélant l'expression
de ln(R) ci-dessus aux points expérimentaux (sucres i et j purs,
et mélange équimolaire) permet d'obtenir avec précision la
constante d'équilibre pour un système M / Réf et un mélange i/j
donné. Cet unique coefficient correcteur obtenu, la mesure du ratio
R apporte les fractions molaires en phase liquide des sucres en
mélange binaire sans biais.
Il faut noter que la constante d'équilibre ou le coefficient correcteur
ne peuvent être associés qu'à un système et un mélange binaire
donné, et non à un sucre de manière universelle.
i
g
g
i =
K i
i, j
jK
i, j i
l.
i
l. + 1 - i
l
( (
K i
i, j
jK
i, j
sucre i [M(réf*) (sucre i)-H]2
+
K i
i, j
sucre j [M(réf*) (sucre j)-H]
+
2
K j
i, j
En considérant une constante d'équilibre entre le sucre i en solution et le cluster associé en
phase gaz dans un mélange i/j, susceptible de décrire tous les phénomènes entre la formation
du cluster en phase liquide et sa fragmentation, en particulier l'impact des autres isomères en
solution sur la formation/ionisation du cluster trimérique, on obtient une expression de la fraction
molaire en phase gaz du sucre i.
D'après Cooks et al, le logarithme népérien du ratio
mesuré en mélange de N composés peut être relié
linéairement à la fraction molaire en phase liquide de
chacun, connaissant les ratios des analytes pris
séparement. Pour des mélanges binaires ou ternaires,
respectivement une ou deux fractions molaires sont
inconnues, et la quantification nécessite la mesure du
ratio pour un ou deux systèmes discriminants.
l
i
.ln (R ) = +mesuré ln (R )i
l
j
.ln (R )j 1-( (.l
i ln (R )k
l
j
-+
M , réf* M , réf* M , réf*M , réf*
mélange ternaire
mélange binaire
ll
iln (R ) = +.ln (R ) 1 -( ( ln (R ).mesuré ii j
mesuréln (R )
i
K gal
fru, gal
fruK
fru, gal
Cu - L-Ser
( ( = 2,51
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
g
i
i
l
fraction molaire en phase liquide
fraction molaire en
phase gaz, calculée par
la constante d'équilibre
Les phénomènes entropiques, négligés dans le cadre de la méthode
cinétique standard (sous réserve de similitude structurale entre
analyte et référence) et l'impact de la présence d'un sucre j sur la
formation/ionisation du cluster d'un sucre i sont des origines parmi
d'autres possibles de cette non-linéarité.
Le logarithme népérien du ratio mésuré en mélange binaire des
monosaccharides considérés n'est pas, contrairement aux attentes,
lié linéairement à la fraction molaire en phase liquide d'un sucre
donné comme observé sur ces courbes de réponse.
i
l
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0 ln (R)
l
i
fru / gal
glc / gal
glc / fru
1,00,80,60,40,20
système Cu-Ser
Pour illustrer cette dernière hypothèse, la mesure de l'abondance du
cluster trimérique associé au fructose est réalisée en ESI/MS pour
différentes concentration en fructose, en présence de concentrations
définies et croissantes de glucose marqué 13-C. Si l'abondance du
cluster est bien une fonction linéaire de la concentration en fructose,
la pente de cette droite varie avec la concentration en glucose
marqué, démontrant ainsi l'impact de la présence d'un isomère j sur
la formation/ionisation du cluster d'un isomère i.
1
2
3
fructose (mM)
glucose (mM)
0,20,150,10,050
Abondance(xe6)
0 mM
0,1 mM
0,15 mM
0,3 mM
Déviation à la linéarité
Correction en mélange binaire
Résumé
Quantitative isomeric analysis of D-fructose, D-galactose and D-glucose was achieved using collision-
induced dissociation of electrosprayed trimeric ions with data analysis by the kinetic method. Several L-
amino acids and divalent metal cations were tested to select the best systems for isomeric distinction and
quantitation of each monosaccharide. Very high distinction could be achieved for most tested systems
amongst which serine/Cu and aspartic acid/Mn were selected for quantitative analysis. Accurate
quantitative results were obtained for each analyte in binary and ternary mixtures using three-point
corrected calibration curves, which account for the competition effects evidenced to occur between sugars
for the formation of the trimeric complexes.
L'analyse isomérique quantitative de trois monosaccharides (D-fructose, D-galactose, D-glucose), basée
sur la dissociation de complexes trimériques simplement chargés formés par electrospray, a été réalisée
selon la méthode cinétique. Divers acides aminés L et cations métalliques divalents ont été testés afin de
choisir les meilleurs systèmes pour la distinction isomérique et la quantification en mélange. Une forte
discrimination est observée pour de nombreux systèmes, dont les couples serine/Cu et acide aspartique/
Mn , qui ont été sélectionnés pour l'analyse quantitative. Des effets de compétition pour la formation/
ionisation des complexes ont été mis en évidence, mais une correction par des calibrations trois points
assure la justesse et la répétabilité de la quantification en mélange binaire et ternaire.
Abstract
2+
2+
2+2+
i / j / k ~ i / j + i / k + j / k
Conditions expérimentales
Les analyses ont été réalisées sur un spectromètre de masse hybride
QTrap 3200 (Applied Biosystems SCIEX) équipé d'une source d'ionisation
electrospray. Les solutions analysées sont composées d'un sel métallique
(1 M), d'un acide aminé (2 M) et d'un sucre (2 M) dans
MeOH / H O à 50/502
[6]
[7]
[8]
Distinction isomérique
Parmi ces systèmes dont quelques exemples sont présentés
ci-dessus, ceux offrant la plus grande distinction isomérique
(c'est-à-dire la plus grande différence entre les trois ratios) et
qui seront utilisés pour la quantification en mélange sont les
combinaisons Cu/Ser et Mn/Asp. Les autres raisons
susceptibles de faire écarter un système M / Réf sont la faible
répétabilité des mesures (liée à la faible abondance du cluster
trimérique) et le manque de discrimination entre certains
isomères, ces deux motifs impactant sur l'éventuelle précision
des mesures en mélange.
réf* M
II
réf*
CID
k1
k2
II
sucreréf* M
M ,réf*
II
ESI
II
sucre
Mréf*
réf*
sucre
R =
k1
k2 [M(réf*) -H]2
+
[M(réf*)(sucre)-H]
+
=
R = [M(Réf)(A)-H] /[M(Réf) -H]2
+ +
M Réf
Mn
Asp
Thr
Cu Ser
Zn Phe
gal
2,62
24
0,420
4,17
glc
0,45
1,96
0,161
0,392
1,11
3,23
0,043
0,42
fru
R = 0,04fructose
galactoseR = 0,42
glucoseR = 0,16
100 200 300 400 500
0
20
40
60
80
100
100 200 300 400 500
0
20
40
60
80
100
100 200 300 400 500
0
20
40
60
80
100
[Cu(L-Ser)2(D-fru)-H]+
[Cu(L-Ser)2(D-glc)-H]+
- D-fru
- D-gal
- L-Ser
- D-glc
- L-Ser
- L-Ser
[Cu(L-Ser)2(D-gal)-H]+
m/z
AbondancerelativeAbondancerelativeAbondancerelative
L'utilisation de métaux de transitions (Mn, Fe, Co, Cu, Zn) pour
le cation central et d'acides aminés pour références permet
dans le cas des trois monosaccharides étudiés (glucose,
galactose et fructose) d'obtenir une série de systèmes
potentiellement discriminants, après avoir éliminé les
combinaisons ne permettant pas la formation du cluster
trimérique ou entraînant une fragmentation secondaire forte,
non compatible avec la méthode cinétique (qui considère les
deux voies de dissociation précitées comme les seules
fragmentations du cluster trimérique).
La méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique est basée sur la mesure des cinétiques de dissociations
compétitives d'un cluster trimérique simplement chargé formé d'un cation divalent central M, de deux molécules de référence
Réf et de l'analyte A, noté [M(Réf) (A)-H] .
Deux complexes dimériques sont formés après dissociation, résultant de la perte d'une référence ou de l'analyte, et sont notés
[M(Réf)(A)-H] et [M(Réf) -H] respectivement.
Les différences structurales des analytes isomères entraînent des stabilités différentes du complexe [M(Réf)(A)-H] , donc de
l'abondance associée en MS/MS et qui, mesurée relativement à l'abondance du complexe [M(Réf) -H], définit un ratio R
propre à chaque analyte, image des cinétiques de fragmentation. Si le système M / Réf est disciriminant, les ratios de chaque
isomère étudié seront différents. Cette discrimination isomérique peut se quantifier par le rapport des ratios de deux isomères,
et sera d'autant plus efficace que le rapport diffère de 1.
2
+ [5]
2
2
++
+
+
.10- 4 .10- 4 .10- 4
1
2
3