1. Stress Oxydant et vieillissement :
De la senescence aux
pathologies associées au vieillisseemnt.
2. Stress oxydant et vieillissement.
I) Bases moléculaires du Stress Oxydant :
II) Stress Oxydant et sénescence
III) Pathologies associées au vieillissement
3. Les marqueurs du Stress Oxydant
Existe-t-il des marqueurs de production d’oxydant ?.
Peut-on apprécier les mécanismes de défense ?
Existe-t-il des marqueurs de déséquilibre ?
Antioxydants:
SOD, GPx,
Catalase, GSH,
Vitamines E et C,
●NO,
Caroténoides
Oxydants:
O2
● -, OH●,
1O2, H2O2,
●NO, ONOO-,
HOCl, ROO●,
ROOH
4. Superoxide anion : a byproduct of
mitochondrial bioenergetic function
O2°-
Cellular Metabolism
8. 2 O2 2 O2
°-
NADPH
NADP+
+ H +
p67
p47
p40
P
P
P
P
P
P
P
PKC
p38
MAPK
Modèle d'activation de la NADPH oxydase :
Phosphorylation et géranylgéranylation
(Lynch 2000; Viedt 2000; Ward 2000)
gp 91
p22
rap 1A
rac 2
GDP
p67
p47
p40
P
P
P
P
P
P
rac 2
GDP
Acetyl CoA
Isoprenyls
Cholesterol
GTP
rac 2
9. p67
p47
p40
P
P
P
P
P
P
P
2 O2 2 O2
°-
rac 2
GTP
GDP
gp 91
p22
NADPH
NADP+ + H +
rap 1A
rac 2
Statins prevent Geranylgeranylation of
rac-2 and NADPH Oxidase activation
Acetyl CoA
Isoprenyls
Cholesterol
P
Statins
x
x
x
GTP
rac 2
x
10. p21 rac 2
actine
Simvastatin inhibits p21 rac2 translocation
PMA PMA +
simva
control
Delbosc et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. In press
p67 phox
p47 phox
12. Formes réactives de l'oxygène :
production et toxicité.
Lipides
Protéines
Acides nucléiques
H2O2
O2°-
OH°
Réaction
d'Haber Weiss
ONOO-
ClO-
Production
d'anion superoxyde
NO
Effets
propres
L-Arginine
Stress Oxydant
Toxicité
Effets cellulaires
H2O
13. Inflammation et production
d ’espèces réactives de l ’oxygène
Médiateurs
inflammatoires
H2O2
MPO
ClO-
Lactoferrine
OH°
Fe2+/ Fe3+
O2
O2
°-
NADPH Oxydase
iNOS
L-Arginine
NO° ONOO-
O2
O2
°-
+
14. Stress
Oxydant
Protéines Glucides Lipides Facteurs de
Transcription
AOPP AGEs
Facteurs de
Transcription
activés
Isoprostanes
MDA
Stress Oxydant : cibles moléculaires
Désorganisation de la membrane
Perte de fonctions des protéines
Altération du matériel génétique
Synthèse de novo
de protéines
ADN
Bases
modifiées
15. Formes réactives de l'oxygène :
Système de protection.
H2O2
O2°-
OH°
ONOO-
ClO-
Production
d'anion superoxyde
Stress Oxydant
H2O
SOD GPx
Catalase
Chélateur
des métaux
Vitamines E/C
Caroténoïdes
GSH
Mannitol...
16. (Ray et Shah 2005)
La NAD(P)H oxydase : une famille enzymatique
Pancreas
gp91phox
Neurospora crassa
Humain
(Bengtsson et al., 2005)
17. La NAD(P)H oxydase : rôle toxique et informatif
Bactéricidie
Cytotoxicité / Nécrose
(foyer inflammatoire)
Proapototique
(CMLV)
Facteur de transcription
(NFkB, AP-1, PPARs …)
Transdifférentiation
(CMLV, EC, Mph)
Prolifération
(CMLV)
Sensor
Hypoxie Glucose Cisaillement
18. Le stress Oxydant : un modulateur de la
réponse inflammatoire
Membrane cellulaire
NFkB /AP-
1
Molécules d ’adhésion
iNOS, MMP Cytokines
FRO
19. IL-6
GAPDH
H2O2 (µM)
0 10 50 100
IL-6
b-actine
Le stress Oxydant : un modulateur de la
sécrétion de cytokines
Sano et al., Circulation Research, 2001 89(8):661
20. inhibition (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 nM 20 nM 200 nM 2 µM 20 µM
Inhibition du système AP-1 par les acides phénols
Paracoumaric
Acid
Protocatechic
acid
Gallic Acid
Sinapic Acid
Cafeic Acid
Ferulic Acid
n=6
Vitamine E
Maggi-Capeyron et al.; 2001
22. Stress oxydant et vieillissement.
I) Bases moléculaires du Stress Oxydant :
II) Stress Oxydant et sénescence
- Mitochondrie horloge biologique ?
- NADPH Oxydase et vieillissement
- Systèmes de protection
III) Pathologies associées au vieillissement
23. Stress Oxydant et vieillissement du fibroblaste en culture :
Les FRO et la limite d’Hayflick (Exp. Gerontol. 1985)
I) Stress oxydant exogène précipite la sénescence cellulaire :
Toussaint et al., Mech Ageing Dev. 1992; 65:65-83.
II) Production endogène de FRO précipite la sénescence :
Lee et al., J. Biol. Chem., 1999; 274:7936-7940.
III) Oxydants et réponse cellulaire aux agressions :
Radiations UV, xénobiotiques, Choc thermique,
infections, cytokines …
=> Sénescence et … production de FRO
=> Production de FRO : signal de stress cellulaire
=> Selon l’intensité : adaptation / apoptose
24. Altération de l ’ADN mitochondrial et
Formes Réactives de l ’oxygène
I
II
III IV
CoEQ
Cyt c
O2
H2 O
O2
°-
ADN
25. Anomalies fonctionnelles mitochondriales
et Formes Réactives de l ’oxygène
-Altérations fonctionnelles liées à l’âge :
G. Lenaz et al., Biochim. Biophysic Acta 2000; 1459:397-404.
Muller-Höcker J et al. Mut. Res. 1992; 275:115-124.
Merlo Pich M. et al., FEBS Lett. 1996; 380: 176-178.
-Altérations du mtDNA liées à l’âge :
Michikawa Y. et al., Science 1999; 286:774-779.
Cortopassi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89:7370-7374.
-Mutations du mtDNA liées à la longévité :
De Benedictis G et al., FASEB J. 1999; 13:1532-1536.
Tanaka M. et al. Lancet 1998; 351:185-186.
26. Uremia-induced mitochondrial mutations
are associated to skeletal muscle oxidative
stress
0
5
10
15
20
25
30
Healthy
subjects
Uremic
patients
Mitochondrial
membrane
lipid
peroxides
(nmol/mg)
Mutations found
in 17/19 uremic patients Lim PS et al J Biomed Sci. 2002; 9:549-60.
27. Production de FRO par la NADPH oxydase
en fonction de l’age
(Chang et al. Free Radic. Biol. Med. 1998; 24:1411-1418)
0
5
10
15
20
25
20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 >70 Age
chemiluminescence
(mV/105
cells)
*
*
*
*
*
?
28. Modulation en fonction de l’age …..
au dela de 70 ans
1,00
1,02
1,04
1,06
1,08
1,10
1,12
1,14
1,16
1,18
60-77 77-83 83-92
Age (ans)
Production
O2°-
(cps/leuco) P<0.05
E. Ventura, Thèse Université
30. Modification des EAO chez « drosophila melanogaster »
(Le Bourg E. FEBS letters 2001; 498:183-186.)
Enzyme Activité Longévité Résistance SO
Cu/Zn SOD 0% - 80% dim. (Pq, H2O2)
3,5 – 10 % Nle dim. (Pq, H2O2)
50-60 % Nle Nle (Pq, H2O2)
130-180% Nle ou Augm (Pq, H2O2)
Aug
CAT 0-14 % Nle Dim. H2O2
50 % Nle Nle H2O2
150-250 % Nle Aug. H2O2
31. Antioxydants nutritionnels
chez « drosophila melanogaster »
(Le Bourg E. FEBS letters 2001; 498:183-186.)
Sur 24* études recensées, 8 sont positives
Antioxydant Variation de longévité (%)
Vitamine E 13,7
Dinitrophénol 12,3
Thiocentrophenoxine 14,7
Propyl Gallate 34,2
N Acétyl cystéine -1,9 26,6
Thioproline 16 30,4 6,1
Vitamine A palmitate 17
* « Search for efficient antioxidants would be facilitated if more
investigators would publish their negative results. »
32. Modéles cellulaires et animaux :
conclusions
I) En condition basale, le niveau de protection
contre le SO est suffisant pour assurer
l’homéostasie cellulaire et la réponse aux
aggressions.
II) Au cours de la sénescence la réponse adaptative
pourrait être diminuée et les cellules deviennent
plus sensibles aux agressions.
III) Une augmentation de la résistance au stress
oxydant entraîne une meilleure réponse aux
agressions et parfois une élévation de la longévité.
33. Activités antioxydantes en fonction de l’âge
10 30 50 70 90
Erythrocyte SOD (U/mgHb)
Femmes
Hommes
10 30 50 70 90
Ans
400
600
800
Plasma Gpx (U/L)
*
*
*
*
*
*
Ans
*
*
20
30
40
From Artur et al., Free Radicals and Aging. 1992. Ed. by I. Emerit & B. Chance
34. Activité SOD et âge
0
1
2
SOD (U/mg Hb)
p<0.01
Elderly
women
Control
0
1
2
Copper
(mg/l)
p<0.001
p<0.01
0.0
0.5
1.0
Zinc
(mg/l) Elderly
Control
Cristol et al., Lipids, 1999
35. Activités antioxydantes en fonction de l’âge
I) Glutathion peroxydase:
Diminuée Inchangée Augmentée
Perrin et al., 1990;
Guemori et al., 1991;
Reddy et al., 1993.
Artur et al., 1992 (n=1836)
Campbell et al., 1990;
Barnett et al., 1995
De la Torre et al., 1990,
(n=2397)
Jozwiak et al., 1985;
Ceballos-Picot et al.,
1992;
II) Superoxyde dismutase:
Diminuée Inchangée Augmentée
Perrin et al., 1990;
Jozwiak et al., 1985;
Artur et al., 1992 (n=1836)
De Lusting et al., 1993
Barnett et al., 1995
36. Stress oxydant et vieillissement.
I) Bases moléculaires du Stress Oxydant :
II) Stress Oxydant et sénescence
III) Pathologies associées au vieillissement :
- Démence de type Alzheimer
- Athérogénèse
37. SYSTEMES DE PRODUCTION DES RADICAUX LIBRES (1)
E. Ventura
0,90
0,95
1,00
1,05
1,10
1,15
1,20
1,25
CTRLs
Production
O
2
°-
(cps/leuco)
*p=0.02
vs contrôles
CVx
*
MMS<26
*
Modulation en fonction des comorbidités
38. Susceptibilité cérébrale au stress oxydant.
(Butterfield, 2004; Markesberry et al. 1999)
Richesse en éléments
prooxydables
H2O2
O2°-
OH°
ONOO-
ClO-
H2O
Anomalies Mitochondriales
(Davis et al., 1997; Gibson 98)
Stimulation
NADPH oxydase
Ab (Behl, 1994;
Shimohama, 2000)
MAO
(Masson, 2000,
Richards, 1998)
Déséquilibre
SOD/GPx
(Delacourte et al. 1989
Ceballos et al. 1991
Berr, 2004)
Jolivalt, 1996
Ab :
Parihar, 2004
39. MA ET STRESS OXYDANT
Marqueurs lipidiques :
4-hydroxynonenal (DNF) (Montine, 1997)
MDA (Vogelson et al.1989, Subbarao et al. 1990)
Isoprostanes (Greco et al. 2000, Reich et al. 2001)
Marqueurs Protidiques :
Protéines carbonylées
Nitrotyrosine
AGE (Advanced Glycation End Products)
Marqueurs Nucléiques:
8-hydroxyguanosine (DNA) (Meccoci, 1993, Smith
et al. 2000)
Marqueurs de SO au niveau cérébral dans la DTA
(Gibson, 2005)
40. Les Isoprostanes un marqueur
de la dégénérescence cérébrale
Montuschi et al. 2004
Montine et al. 2005
42. Stress Oxydant marqueur systémique
d’évolutivité du déclin cognitif
Migliore et al. 2005
Keller et al. 2005
43. Métabolisme oxydatif et délin cognitif (EVA study)
0
5
10
15
20
25
>25 <25 >25 <25 >25 <25 <75 >75
Se Carotenoïdes GR VitE TBARS
Déclin
Cognitif
%
RR 1,58 (1,08-2,31)
RR 1,17 (0,75-1,81)
RR 1,04 (0,68-1,56)
RR 1,78 (1,16-2,73)
Berr et al. 2000
44. Consommation antioxydante et déclin cognitif :
Les études observationnelles:
- Rotterdam Study (Engelhart et al. 2002)
Apports importants de vit E diminuent le risque de MA
- East Boston Study (Morris et al. 2005) :
Etude 1993-2002 âge > ou = 65 ans
- 3718 participants
- Apport nutritionnel de vitamine E
5 mg/jour, RR = 0.74 [0.62 -0.88]
-Polyphénols :
effet bénéfique du thé : (PAQUID 2000)
effet bénéfique du vin rouge (resvératrol) : (PAQUID 2000)
45. ANTIOXYDANTS
ETUDES INTERVENTIONNELLES
- The Alzheimer’s Disease Cooperative Study (Sano et al. 1997)
sélégiline (10mg/j)/vitamine E (2000UI/j).
Gain de 8 mois sur les institutionalisatons
-Honolulu Asia Aging Study : (Masaki et al. 2000)
Vitamine E/C supplémentation (3 385 Hommes) :
protection contre la démence vasculaire mais pas DTA
- Cache County Study : (Zandi et al. 2004)
Combinaison E/C (4 740 pts)
Prévention AD (RR = 0.36 [0.09-0.99]
Vitamine E ou C isolée : pas d’effet
46. ETUDE INTERVENTIONNELLE et MCI:
Petersen et al.2005
- Etude double aveugle MCI
- Durée de 3 ans
769 sujets :
- 2000 UI Vitamine E / 10 mg Donepezil / vs placebo
Progression MCI vers démence 16%/an
212 sujets ont développé MA
Pas de bénéfice du groupe vit E
47. Intérêt de la combinaison d’antioxydants:
Montine et al. 2005
Effet des AO vit E et /
ou vit C sur la
production d ’IsoP
dans le LCR.
48. Athérogénèse : Evolution des idées
3) Théories inflammatoires:
- Ross R, N Eng J Med, 1999
=> Antiinflammatoire ?
1) Athérome (aqera):
- Marchand 1904
=> Hypolipémiant
2) Théorie oxydative de l ’athérosclérose:
- Steinberg N. Engl. J. Med. 1989.
=> Antioxydant
ou un hypolipémiant-antioxydant-antiinflammatoire ?
49. Théorie oxydative de l’athérogénèse
Steinberg et al., N. Engl. J. Med. 1989
native LDL
Lésion
endothéliale
LDL oxydées
+
Monocytes
circulants
Monocytes/
Macrophages
résidents
Cellules
spumeuses
50. Vitamin E, the main LDL antioxidant, acts
as a chain-breaking agent
Apo B
LDL
LOOH
LOO°
L°
TocO°
TocOH
LH
O2
Propagation
Chain-
breakng
52. Cambridge Heart AntiOxidant Study, CHAOS,
Lancet 1996; 347:781-86.
Placebo
(n=967)
Vitamin E
(n=1035)
0
0 200 400
0.9
1
Days of Follow-up
Proportion
of
patients
free
Of
major
cardiovascular
events
0.95
800
600 1000
P=0.015
0
0 200 400
0.9
1
Days of Follow-up
Proportion
of
patients
free
Of
cardiovascular
death
0.95
800
600 1000
Placebo
(n=967)
Vitamin E
(n=1035)
P=0.78
53. Les essais de supplémentation en
vitamine E.
Prévention IIaire : l ’espoir déçu.
ATBC, Alpha Tocopherol Beta Carotene, N. Engl. J. Med., 1994
GISSI, Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell ’
Infarcto Miocardio, Lancet, 1999
HOPE, Heart Outcome Prevention Evaluation,
N. Engl. J. Med., 2000
Méta-analyse, Yussuf et al. N. Engl. J. Med., 2000
HPS, Heart Protection Study. Int. J Clin Pract 2002
54. Heart Outcome Prevention Evaluation, HOPE.
Placebo
(n=4652)
Ramipril
(n=4645)
Reduction in risk,
p<0.001
0
0 500 1000
5
10
Days of Follow-up
Cardiovascular
events
Proportion
of
patients
(%)
15
20
1500
N. Engl. J. Med., 2000; 342:145-153
Placebo
(n=4780)
Vitamin E
(n=4761)
0
0 500 1000
5
10
Days of Follow-up
Cardiovascular
events
Proportion
of
patients
(%)
15
20
1500
N. Engl. J. Med., 2000; 342:154-160
55. Vitamines E et C :
des Co-antioxydants
LOOH
LOO°
L°
TocO°
TocOH
LH
O2
Propagation
Chain-
breakng Ascorbate
Or Vit C
Ascorbyl
radical
2 GSH
GSSG
56. CellaVie® : Vitamine E(100 mg), Vitamine C(250 mg)
2 fois par jour / 3 ans
==> Progression de l ’épaisseur Intima / Média
Antioxidant Supplementation in Atherosclerosis
Prevention (ASAP)
Salonen J.T. et al. J. Intern. Med., 2000.
0
0,005
0,010
0,015
0,020
Augmentation
mm/an
Hommes
Femmes
Placébo Vit. E Vit. C CellaVie
57. Théorie inflammatoire de l’athérogénèse
Ross R., N. Engl. J. Med. 1999
Monocytes/
Macrophages
Cellules
endothéliales
T lymphocyte
Cytokines
Facteurs de croissance
Médiateurs lipidiques
ROS
Monocytes
Plaquettes
O2
O2
°-
Cellules musculaires lisses
Cellules
spumeuses
61. La NADPH Oxydase : un facteur de modulation phénotypique
des cellules musculaires lisses ?
Cellules matures
Phénotype contractile:
expression des protéines de la contraction
Faible taux de prolifération
Faible production de la M.E.C
Phénotype sécréteur:
expression des protéines de la contraction
réponse aux facteurs de croissance
production de la M.E.C et des protéases
prolifération
Cellules de-différenciées
Modulation
phénotypique
NADPH oxydase
?
62. NADPH oxydase et protéines contractiles sont
inversement exprimées
(Itoh; circulation 2002)
p22phox
SM2
A-SM actin
SMC a actin
p22 phox
Smoothelin
(West; ATVB 2001)
63. NADPH oxydase vasculaire et trnsdifférentiation
ostéoblastique
Production d’H2O2
*
*
*
production
totale
d'H2O2/mg
de
protéine
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Culture
jour 1
CTRL
ß-glycérophosphate
+apocynine
n = 4
ß-glycérophosphate
CTRL Cal.
Cal. et
apocynine
Culture
jour 15
Ph. alcaline
Collagène
de type I
64. Modulation de la NAD(P)H oxydase :
Du physiologique au pathologique
O2
°-
Physiologique
O2
°-
O2
°- O2
°- O2
°-
O2
°-
Transcriptionnel
O2
°-
O2
°- O2
°-
Pathophysiologie
Post-traductionnel
65. Groupe Témoin Groupe High Fructose
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
J0 J7 J14 J21 J 28 J42
Coeur (mv/mg VG)
*
*
*
* *
L ’IR du rat high fructose est associée à une
production d ’O2°- cardiaque (col. G. Cros)
2,6
2,7
2,8
2,9
3
3,1
3,2
3,3
3,4
J0 J7 J14 J21 J28 J42
* * *
IMC (mg/kg masse corp.)
*p<0.05 Fructose vs témoins,
Corrélation O2°- / IMC r=0,532
p22
phox
CT HF Delbosc et al., Atherosclerosis, 2005
71. 0
2
4
6
8
10
12
14
J0 J15
Glycémie (mM)
Insulinémie (UI/ml)
HOMA
X
X
Régime hypocalorique 1200 Kcal/J
*
*
NADPH Oxydase et diabète II
Anion superoxyde
(mv/leuco)
*
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Volont
sains
DS II
72. Le Stress Oxydant et le diabète II :
une réalité clinique
Monnier et al, JAMA, Avril 2006.
15 F2t- Isop pg/mg créatinine
0
200
400
600
800
DS II Contrôles
* p=0.0001
79. Résultat (1): Cinétique et effet dose du resvératrol
Effet maximal significatif au bout de 24 heures
Inhibition significative à partir de 20µM (60%)
Inhibition significative maximale à 80µM (75%)
Effet dose
0
20
40
60
80
100
120
*
*
*
%
Activation
Cinétique
%
Activation
0
50
100
150
200
250
PMA 1h 4h 24h
*
* P<0.05 resvératrol vs contrôle
(20µM)
L'IC50 du resvératrol sur les cellules vasculaires est de 20µM (Usha R., Arterioscler Thromb
Vasc Biol, 1999)
Le resvératrol se dissout dans l’éthanol.
80. Résultat (2): Cinétique et effet dose de la quercétine
Effet maximal significatif au bout de 24 heures
Inhibition significative à partir de 4µM (59%)
Inhibition significative maximale à 80µM (95%)
Cinétique Effet dose
%
Activation
%
Activation
* P<0.05 quercétine vs contrôle
(5µM)
0
50
100
150
PMA 1h 4h 24h
*
0
20
40
60
80
100
120
*
*
* * *
L'IC50 de la quercétine sur la progression des tumeurs mammaires est de 5µM (Lamson, D.W , Altern Med
Rev, 2000 )
La quercétine se dissout dans l’éthanol.
81. Résultat (6): Effet des polyphénols sur l’expression de la sous-unité
p22phox de la NADPH oxydase (Western Blot)
EtOH Quercétine Resvératrol
NaOH Acide ellagique
DMSO Rutine
EtOH Acide protocatéchique
Polyphénols
Resvératrol
Quercétine
Acide ellagique
Rutine
Acide protocatéchique
% d’inhibition par
rapport au témoin
60 %
65 %
41 %
41 %
51 %
Anti-corps Iaire: anti-p22phox (1/200ème) ;Anti-corps IIaire couplé à la péroxydase : anti-chèvre (1/30 000ème)
84. 0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20 <0.01
*
Ctl simva AngII AngII+
simva
Aorte (mv/mgprot)
Modèle Angio II et Interventions pharmacologiques
* p<0.05 ANG II vs Contrôle (Delbosc Hypertension 2002)
0 5 10 J
120
140
160
180
200
220
*
*
†
Ang II
Ang II
+ Simva
Simva
Contrôle
Pression artérielle (mmHg)
Notes de l'éditeur
6
1
1
Au bout de 24 heures, la production d ’H2O2 est prévenue avec l ’apocynine, donc la production d ’H2O2 passe par NADPH oxydase. Cette production est maintenue pendant 6 jours.
Les cellules contrôle produisent aussi H2O2 non dépendante de la NADPH oxydase, car elle est pas prévenue par l ’apocynine, donc passe peut-être par la mitochondrie due au vieillissement.
La production d’O2°-par l’aorte a été significativement réduite par le mélange de polyphénols avec et sans éthanol ainsi qu »avec les extraits non alcooliques d’anthocyane, de procyanidine et de vitaflavon (la différence entre avec ou sans éthanol n’est pas significative)
