Cell culture describes all techniques allowing cells growth and division in an ex-vivo controlled environment, to conduct experimentations on these cells. Recent development of new technologies such as 3D printing or microfluidics have given rise to new approaches in various fields of biology, especially bioinformatics, biotechnologies and biophysics, with direct applications in cell culture. However, these protocols are often associated to a very random yield, depending directly on the accuracy of the handling performed by a human experimenter. This project aims at using current knowledges coming from these three fields, in order to offer an innovative multidisciplinary approach minimizing the introduction of handling errors in existing cell culture protocols, and to propose a novel techniques of 3D cell culture combining robotics, ultrasounds and optical microscopy. For this purpose, studies on the effects of ultrasounds on cells will be conducted. A computer program allowing the management of ultrasonic transmitters in synergy with optical cameras to apply a cell culture protocol and evaluate its efficiency, will be developed. Finally, a robot using this program, with the required tools for handling cell culture, will be built.

1. Projet ANR Etudiant :
Accurate Computer-assisted
Cell Culture using Ultrasounds
PAGEAUD Yoann
Paris 28 Novembre 2016
M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7)

2. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 2
Table des matières
1. Résumé ............................................................................................3
2. Introduction......................................................................................4
3. Etat de l’Art .....................................................................................5
3.1. La Modélisation en Culture Cellulaire.......................................5
3.2. L’Impression 3D ........................................................................6
3.3. La Méthode de Lévitation Magnétique (MLM).........................7
3.4. Les Ultrasons..............................................................................7
3.5. Matrice Isotrope de Vecteurs .....................................................9
4. Le Projet.........................................................................................10
4.1 Le Robot .....................................................................................10
4.2 Le Logiciel..................................................................................10
5. Partenariats, Recherche et Développement ...................................12
5.1. Equipe 1 : Acoustique et manipulation de cellule unique........12
5.2. Equipe 2 : Bioinformatiques et culture cellulaire assistée .......13
5.3. Equipe 3 : Biophysique des ultrasons ......................................13
6. Calendrier Prévisionnel .................................................................13
7. Budget Prévisionnel.......................................................................14
Références...........................................................................................14

3. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 3
1.Résumé
La culture cellulaire décrit l’ensemble des techniques permettant la croissance et la
division de cellules dans un environnement contrôlé en ex-vivo, dans le but de mener des
expérimentations sur ces cellules. Le développement récent de nouvelles technologies comme
l’impression 3D ou la microfluidique ont fait naitre de nouvelles approches dans plusieurs
domaines de la biologie, notamment les bioinformatiques, les biotechnologies ainsi que la
biophysique, avec des applications directes en culture cellulaire.
Toutefois, ces protocoles sont souvent associés à un rendement très aléatoire, dépendant
directement de la précision des manipulations réalisées par un expérimentateur humain.
Ce projet a pour objectifs d’utiliser les connaissances actuelles provenant de ces trois domaines,
de façon à proposer une approche multidisciplinaire innovante minimisant l’introduction
d’erreurs de manipulations dans les protocoles de culture cellulaire déjà existant, et de proposer
une technique inédite de culture cellulaire 3D conjuguant la robotique, l’utilisation d’ultrasons,
et la microscopie optique.
Dans ce but, des études sur les effets des ultrasons sur les cellules seront menées. Un logiciel
permettant la gestion d’émetteurs à ultrasons en synergie avec des caméra optiques pour
appliquer un protocole de culture cellulaire et évaluer son rendement, sera développé. Enfin, un
robot utilisant ce programme, avec les outils nécessaires à la culture cellulaire assistée, sera
construit.
Abstract
Cell culture describes all techniques allowing cells growth and division in an ex-vivo
controlled environment, to conduct experimentations on these cells. Recent development of
new technologies such as 3D printing or microfluidics have given rise to new approaches in
various fields of biology, especially bioinformatics, biotechnologies and biophysics, with direct
applications in cell culture.
However, these protocols are often associated to a very random yield, depending directly on
the accuracy of the handling performed by a human experimenter.
This project aims at using current knowledges coming from these three fields, in order to offer
an innovative multidisciplinary approach minimizing the introduction of handling errors in
existing cell culture protocols, and to propose a novel techniques of 3D cell culture combining
robotics, ultrasounds and optical microscopy.
For this purpose, studies on the effects of ultrasounds on cells will be conducted. A computer
program allowing the management of ultrasonic transmitters in synergy with optical cameras
to apply a cell culture protocol and evaluate its efficiency, will be developed. Finally, a robot
using this program, with the required tools for handling cell culture, will be built.

4. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 4
2.Introduction
Depuis la première culture cellulaire à partir de cellules cancéreuses (connues sous le nom de
cellules HeLa) prélevées chez la patiente Henrietta Lacks en 19511
, les protocoles se sont
multipliés pour répondre des problématiques de plus en plus variées allant de l’étude de cellules
cancéreuses2
, à la production de biocarburants grâce à des micro-algues, en passant par les
thérapies cellulaires basées sur les cellules souches3
.
Ces protocoles toujours plus spécifiques se sont complexifiés à un point tel que la précision des
manipulations réalisées en laboratoire est devenue décisive dans leurs bons déroulements.
L’essor de l’impression 3D a vu naitre une nouvelle approche de la culture cellulaire en trois
dimensions (3D) avec des nouveaux objectifs en médecine régénérative notamment.
Toutefois, ces remarquables avancées n’ont pas encore permises de réussir à coup sûr une
culture cellulaire. Les protocoles restent difficilement reproductibles4
, et leur complexité
augmentant, la source d’erreurs majoritaires devient l’expérimentateur manipulant les cellules.
Quant à l’impression 3D, les résultats fluctues selon les techniques, en absence de
vascularisation active les tissus créés se nécroses trop rapidement et ne permettent pas encore
la création d’un organe viable greffable chez un humain en utilisant les techniques actuelles5
.
Une nouvelle approche proposée ici est d’abandonner les techniques traditionnelles de cultures
cellulaires manuelles au profit de cultures cellulaires manipulées en environnement fermé par
un robot. Dans ce but, le robot sera équipé d’un bac en polystyrène cristal, de 2 caméras avec
microscopes optiques, de 4 panneaux d’émetteurs à ultrasons, d’un lot de 10 pinces acoustiques
récemment développées à l’Institut des Nanosciences de Paris6
, ainsi que d’une interface
informatique.
L’utilisation d’ultrasons en tant qu’outils de manipulation de cellule individuelle n’a encore
jamais été étudié à l’heure actuelle mais des études sur des billes de silices7
, des gouttelettes
d’eau8
, de tailles similaires et sur des amas cellulaires9
donnent des résultats prometteurs.
Les applications potentielles que pourrait avoir cette technologie sont extrêmement variées :
l’étude des migrations cellulaires pendant le développement d’un organisme, des processus
métastatiques, de la croissance tumorale ou la fabrication de tissus cellulaires complexes et
d’organes greffables, avec un rendement dépassant ceux des cultures cellulaires manuelles
classiques, et ceux de l’impression biologique 3D. Il pourrait également s’agir d’une alternative
sérieuse à l’expérimentation animale.
Le projet s’organisera en plusieurs phase de tests et de développement :
- La première phase de test servira à déterminer les réglages nécessaires pour adapter
l’application des ultrasons à la manipulation de cellules.
- Viendra ensuite une phase de prototypage du robot qui se fera conjointement au
développement du programme nécessaire à son bon fonctionnement.
- Une phase de test pour déterminer le meilleur modèle de matrice pour la culture cellulaire
3D sera également nécessaire et sera à prendre en compte dans le fonctionnement du
programme.
- Enfin des tests de mise en situation seront menés où le robot et son programme seront
soumis à différents protocoles de culture cellulaire récupérés dans la base de données
Springer Protocols. Les rendements seront comparés aux prévisions des protocoles.

5. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 5
3.Etat de l’Art
3.1. La Modélisation en Culture Cellulaire
Une des clés de la réussite d’une culture cellulaire est la modélisation de la croissance cellulaire.
Le premier modèle logistique ayant permis la prédiction de la croissance d’une culture cellulaire
a été proposé en 1838 par Pierre François Verhulst10
:
𝑬𝒒. 𝟏 ∶
𝑑𝑁
𝑑𝑡
= 𝑟𝑁
La solution de cette équation est :
𝑬𝒒. 𝟐 ∶ 𝑁( 𝑡) = 𝑁0 𝑒 𝑟𝑡
Où 𝑁0 et 𝑁(𝑡) sont la densité de cellule aux temps t=0 et t=t respectivement et r le taux de
croissance spécifique d’un type cellulaire.
Ce modèle est en fait lui-même basé sur le tout premier modèle permettant de décrire la
croissance d’une population, le Modèle de population de Malthus (1798)11
.
A la suite de ce modèle de nombreux autres modèles furent développés pour prédire la
croissance cellulaire et l’évolution de la concentration de produits cellulaires d’intérêt (des
protéines, des molécules …) quasiment spécifiques à chaque type cellulaire connu
actuellement, et prenant en compte plusieurs paramètres de l’environnement de culture en
compte tels que la température, la pression ou la concentration en oxygène1213
.
Pour mieux comprendre et utiliser ces modèles dans les protocoles de culture cellulaire une
classification hiérarchique a été décidée. La dernière date de 2007 (Julien and Whitford) :
Figure 1 : Classification des modèles non-linéaires utilisés en culture cellulaire14
.
Aujourd’hui, l’ensemble de ces modèles peut être retrouvé dans la littérature, notamment sur la
base de données de Springer Protocols.

6. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 6
3.2. L’Impression 3D
L’impression 3D repose sur le principe de base de la superposition de matière, couche par
couche permettant d’obtenir un objet en volume après un nombre de couches superposées,
adhérentes entre-elles, suffisamment important.
En biologie, il existe de nombreux matériaux polymères utilisés pour l’impression 3D. Ils sont
classiquement divisés en 2 catégories, les polymères synthétiques, et les polymères naturels15
:
La Polycaprolactone (PCL) fait
partie de ces polymères synthétiques
couramment utilisé en impression
3D. la PCL est intéressante car c’est
un polymère biodégradable dont le
point de fusion (température seuil
nécessaire pour le passage de l’état
solide à l’état liquide du PCL
permettant l’impression 3D) est à
60°C, une température basse
comparée aux autres polymères
synthétiques16
.
Les polymères naturels restent
néanmoins les plus utilisés pour le
moment. Ils ont un avantage
considérable par rapport aux polymères synthétiques, leur capacité à pouvoir être fixés par des
cellules grâce à leurs récepteurs membranaires d’adhésion, les intégrines.
Il existe plusieurs procédés d’impression 3D, chacun ayant son avantage. Un procédé
notamment utilisé pour l’impression en milieu aqueux est le 3D Bioplotter System qui permet
de fabriquer en 3D des matrices, d’architecture complexes et dont la stabilité est compromise
par la force de gravité, dans une solution aqueuse de densité proche de celle du polymère utilisé
pour l’impression17
.
Toutefois l’impression 3D en Biologie fait face à plusieurs problématiques empêchant la
conception d’organes viables :
- Le manque de contrôle sur la dispersion des cellules sur les matrices en polymères, ne
permet pas une différentiation parfaite des cellules et provoque l’apoptose des cellules là
où leur densité est trop grande.
- La dispersion aléatoire de cellules pose un autre problème, celui de la spécialisation du
tissu. Même s’il est possible de déposer plusieurs types cellulaires différents sur une
structure 3D, l’absence de contrôle des quantités ne permet pas d’instaurer d’organisation
précise dans le tissu.
- Après différentiation l’absence de vascularisation efficace entraine une nécrose rapide des
cellules, le plus souvent au centre de la structure imprimées18
.
- Une problématique supplémentaire qui ne trouve pas de solution actuellement est
l’impossibilité de manipuler les cellules après leur dépôt sur leur matrice de polymère. Les
migrations des cellules sur la matrice ne peuvent être contrôlées de même que l’ajout
différé dans le temps de cellules supplémentaires dans la matrice ne peut être effectué.
Figure 2 : Diagramme d’utilisation des polymères
naturels (rouge) et synthétiques (bleu), dans le
domaine de l’impression 3D Biologique.

7. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 7
3.3. La Méthode de Lévitation Magnétique (MLM)
La MLM est une méthode d’étude In Vitro permettant de faire de la culture cellulaire 3D en
lévitation dans une solution aqueuse et de simuler des migrations cellulaires. Les cellules
d’intérêts sont cultivées dans un gel contenant des nanoparticules d’oxyde de Fer (FeO) ou d’Or
(Au). Ces particules vont s’incorporer dans les cellules et après lavage du gel superflu. Les
cellules peuvent être remises en suspension dans une solution de culture pour être étudiée19
.
Cette approche récente permet de répondre à une partie des problématiques non résolues par
l’impression 3D, notamment sur l’aspect dynamique de l’évolution d’un tissu cellulaire. La
possibilité de pouvoir faire migrer un type cellulaire à travers un autre, pour simuler une étape
du développement d’un organisme (par exemple la migration des cellules des crêtes neurales
chez le fœtus), ou l’invasion d’un tissu par des cellules tumorales20
, est une avancée
conséquente.
Toutefois des doutes persistes sur la fiabilité de cette approche pour l’étude des migrations
cellulaires, à cause de l’implication de nanoparticules. En effet une problématique majeure de
la MLM est posée par l’utilisation de nanoparticules dont les effets sont incertains sur le
métabolisme des cellules21 22 23 24
. Il a été montré que l’utilisation de nanoparticules de manière
générale augmentait la production de Dérivés Réactifs de l'Oxygène (DRO) dans les cellules25
,
qui ont un effet toxique sur les cellules et entraine leur apoptose. Des effets prolifératifs accrus,
potentiellement tumoraux, ont également été constaté chez les cellules exposées26
.
Les études actuelles n’ont pas encore permis de définir le seuil de toxicité en nanoparticules
pour les cellules, pour plusieurs raisons : la production de nanoparticules pour la recherche en
laboratoire n’est pas standardisée27
, et les seuils de toxicités des nanoparticules pourraient
dépendre des types cellulaires étudiés28 29
.
Des études approfondies sont donc encore nécessaires avant de pouvoir envisager son utilisation
en ingénierie tissulaire pour des greffes chez l’humain.
3.4. Les Ultrasons
Les ultrasons décrivent l’ensemble des ondes dont la fréquence est comprise entre 20kHz et 10
MHz. Ils ont été découvert en 1883 par Francis Galton. On doit la création du premier émetteur
à ultrasons à Paul Langevin. Les ultrasons trouvent aujourd’hui des applications diverses et
variées dans le domaine médical en échographie, dans la navigation maritime, dans l’industrie
minière.
Parmi ces applications les ultrasons ont également trouvé une utilité basée sur les ondes
stationnaires pour la manipulation de petits objets sans contact physique. Plusieurs équipes ont
réussi à faire léviter des objets de petites taille en les piégeant dans les nœuds de pression d’une
ou plusieurs ondes ultrasonores (Figure 3)30 31
. La superposition des nœuds de pressions de
différentes sources d’émission d’ultrasons créé un point focal, au niveau duquel la position de
la particule en lévitation sera stable. Plus il y a de sources ultrasonores convergent vers le même
point focal, plus la position de la particule piégée en ce point de l’espace sera stable. Les
pressions agissant sur la particule piégée dans un nœud de pression d’une onde ultrasonore sont
résumées à la Figure 432
.

8. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 8
Une équipe de chercheur a notamment réussi à faire croitre in vitro une culture cellulaire de
cellules hépatiques tumorales (HepG2) en lévitation dans un nœud de pression d’une onde
ultrasonore après les avoir encapsulées ensemble dans un polymère, le poly(2-hydroxyethyl
methacrylate) (P-HEMA)33 34
. Toutefois leur protocole ne permettait pas de concevoir une
structure 3D précise, ni de manipuler les cellules de façon individuelles. L’étude ne fait pas non
plus état de la potentielle cytotoxicité liée à la fréquence et à la densité d’énergie des ultrasons
utilisés pour la lévitation des cellules.
Figure 3 : Résumé des différentes méthodes utilisant le principe des ondes stationnaires des
ultrasons pour la lévitation de particule35
.
Plus récemment une pince acoustique a été
développée dans un laboratoire de l’Institut des
Nanosciences de Paris (Université Pierre et Marie
Curie – Paris 6) permettant la manipulation d’objets
de tailles variant du millimètre à la dizaine de
micromètres36
. L’utilisation de la pince acoustique
repose sur le principe du vortex acoustique. Un
vortex acoustique peut se définir comme une onde
tridimensionnelle en hélice capable de se propager
en milieu liquide. Le vortex acoustique (Figure 5)37
à la particularité de pouvoir piégé une particule en
son cœur où la pression de radiation est nulle. Il
confère néanmoins une rotation à la particule, dû au
flux acoustique hélicoïdale. Les propriétés du vortex
acoustique permettent ainsi la manipulation d’objet
de très petite taille en exerçant un minimum de
contrainte mécanique dessus et en fait un excellent
candidat pour la manipulation de cellules
biologiques38
.
Concernant les effets des ultrasons sur les cellules,
une équipe de chercheurs a déjà prouvé que ces
effets dépendaient majoritairement de trois
paramètres : l’intensité des ultrasons, la densité
Figure 4 : Schéma (à droite) de la
moyenne quadratique des pressions,
des vitesses agissant sur un objet
sphérique de petite taille et (à gauche)
du flux acoustique externe. PN : Nœud
de Pression ; dS : variation
infinitésimale où la surface est
considérée plane. 𝑛 : vecteur normal à
la surface de la particule.

9. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 9
d’énergie (ou dose) des ultrasons utilisés ainsi que le type cellulaire étudié39
. Toutes les cellules
ne semblent pas réagir de la même façon à l’exposition d’ultrasons.
Des études complémentaires sont encore nécessaires pour adapter au mieux les ultrasons à la
manipulation de cellule
unique, et mieux
déterminer les effets
qu’ils ont sur les cellules
qu’ils soient délétères ou
favorables pour les
prendre en compte dans
les modèles de
prédiction de croissance
cellulaire.
3.5. Matrice Isotrope de Vecteurs
La matrice isotrope de vecteurs (MIV) est un concept venant
des mathématiques et de la physique. C’est une construction
dans laquelle toutes les arrêtent et tous les angles sont égaux.
Elle a été décrite en premier par Buckminster Fuller en 1975.
La MIV est souvent décrite comme le schéma d’organisation
permettant d’organiser au mieux la matière dans un minimum
d’espace, c’est une représentation de l’équilibre parfait. On
retrouve ses applications dans un grand nombre de domaines
(en Thermodynamiques, en Chimie et en Biochimie entre
autres)40
. La MIV est également retrouvé dans l’organisation
des cellules de certain tissus biologiques41
. La MIV a d’autres
propriétés intéressantes : des études en ondulatoire ont permis
de montrer que la MIV était particulièrement perméable aux ondes hautes fréquences et de
faibles longueurs d’onde42
. Autrement dit, une onde ultrasonore pourrait traverser la MIV avec
des interférences minimes dû à sa structure.
Après recherche dans la littérature de l’impression 3D en biologie il semblerait que cette
structure n’ait jamais été envisagée pour la construction de matrice de culture en ingénierie
tissulaire. Ses propriétés de mimétisme de l’organisation des cellules dans un tissu, ainsi que sa
perméabilité aux ultrasons en font une potentielle matrice très favorable à la culture cellulaire
assistée par ultrasons.
Figure 5 : (a) schéma d’un vortex acoustique ultrasonore. (b)
schéma des déplacements de la particule en lévitation en vue
longitudinale du vortex acoustique.
(a)
(b)
Figure 6 : Matrice Isotrope
de Vecteurs.

10. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 10
4.Le Projet
4.1 Le Robot
Le robot (Figure 7) sera équipé de :
- Un bac en polystyrène cristal : ce bac sera rempli par le technicien avec la solution (le
milieu de culture qu’il souhaite), les panneaux, les pinces acoustiques, ainsi que les
objectifs des microscopes seront immergés dans le bac. Ils seront donc étanches.
- 2 caméras-microscopes optiques : une
fixée sur la face supérieure interne du
bac, une autre fixée dans un coin du bac.
- 4 panneaux d’émetteurs à ultrasons (2
visibles Figure 7) disposé chacun sur une
face verticale du bac.
- 10 pinces acoustiques accrochée à la face
supérieure interne du bac.
- Un emplacement permettant de charger
une cartouche de cellules d’intérêt sera
également présent avec un lot de
cartouches plastiques en question.
- Une interface informatique tactile, qui
permettront au technicien de sélectionner
les paramètres nécessaires pour sa culture
cellulaire.
4.2 Le Logiciel
Le logiciel (Figure 8) sera composé de 2 programmes :
Un premier programme d’imagerie biomédicale et de contrôle qualité capable de détecter des
cellules dans un espace 3D en faisant varier le focus des 2 microscopes caméras. Les cellules
seront comptées et leur nombre comparé au nombre attendu prédit par le modèle de croissance
associé au protocole choisi, et ce à chaque étape. Les coordonnées 3D seront également
récupérées et communiquer au programme permettant la manipulation des pinces acoustiques.
Les données de comptage des cellules à chaque étape seront associées à un score de qualité
pour chaque étapes. L’ensemble de ces scores seront rassemblé dans un document texte qui fera
office de rapport en fin de protocole. En parallèle ces données seront communiquées par un
internet à l’équipe de bioinformatique (voir partie 5.2) qui pourra recouper les résultats venant
des robots utilisés par les laboratoires clients et publier, le cas échéant, une review sur les
résultats des protocoles menés avec le robot. Le programme sera développé en Java, pour
pouvoir utiliser des packages développés initialement pour FIJI/ImageJ largement utilisé en
imagerie.
Un programme de manipulation des pinces acoustiques et des panneaux d’émetteurs d’ultrasons
utilisera en entrée 3 tableaux de coordonnées 3D : un tableau avec les coordonnées 3D des
sommets de la MIV (préalablement imprimée en 3D avec la technologie 3D Bioplotter System),
Figure 7 : Schéma 3D du robot permettant
la culture cellulaire 2D et 3D assistée par
ordinateur (Vue Ouverte).

11. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 11
un tableau avec les coordonnées 3D des cellules dans la cartouche et un tableau avec les
coordonnées 3D des nœuds de pression générés par les panneaux d’émetteurs d’ultrasons en
fonction de la longueur d’onde choisie pour le protocole.
Le programme devra donc ajuster les vortex acoustiques des pinces pour piéger les cellules
visées. Les pinces devront ensuite charger la grille de nœuds de pression avec les cellules ligne
par ligne (selon l’axe x). Après une première division cellulaire, qui concernera l’ensemble des
cellules piégées dans les nœuds de pression à un temps t spécifique du protocole suivi, les vortex
acoustiques des pinces seront orientés vers les positions d’une ligne de 10 nœuds des pressions
et capteront, chacune, 1 cellule par nœud de pression, avant de les déposer aux barycentres des
4 coordonnées des sommets de chaque tétraèdre, en partant du haut de la MIV (un pas pourra
être défini pour ne remplir qu’une partie des tétraèdres, dans l’optique de remplir l’autres partie
des tétraèdres avec un autre type cellulaire a posteriori). Le cycle « division cellulaire puis
remplissage des tétraèdres de la MIV », se répète alors autant de fois qu’il y a de barycentres
calculés pour la structure de la MIV.
Pour un protocole de culture cellulaire 2D classique, le principe de fonctionnement du
programme restera le même, à la différence que les coordonnées 3D des sommets de la MIV
seront remplacées par des coordonnées générées par le programme en fonction de la densité
cellulaire précisée dans le protocole. La gestion des tableaux de coordonnées 3D ainsi que le
rapport de contrôle qualité se fera avec un module R, qui appellera des modules Python
responsables des actions du robot.
Un programme de text mining : Lorsque le technicien rentrera un DOI sur l’interface du robot,
le programme recherchera le protocole correspondant dans la base de données Springer
Protocols et extraira les données nécessaires pour les étapes du protocole sélectionné. Ces
données seront utilisées en entrée par le programme d’imagerie biomédicale et le programme
de manipulation des pinces et des panneaux à ultrasons.
Figure 8 : Workflow du logiciel et interactions avec les outils du robot.
Programme de Manipulation des
Pinces et des Panneaux
Entrée : Tableau Coordonnées 3D
Cellules, Matrice et Nœuds de
pression
Sortie : Panneaux et Pinces puis
Caméras-Microscopes
Pinces
Acoustiques
Panneaux
d’émetteurs
ultrasonores
Caméras-
Microscopes
Interface Machine
Entrées : DOI ou Protocole
+ Lancement du Protocole
Programme de Text
Mining
Entrée : Protocole de
Springer Protocols
Sortie : Paramètres du
protocole +
Paramètres ultrasons
Programme d’Imagerie &
Contrôle Qualité
Entrée : Lancement Protocole +
Piles d’Images
Sortie : Tableaux Coordonnées
3D + Scores Qualité + Caméras

12. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 12
5.Partenariats, Recherche et Développement
Les recherches sur ce projet seront menées par 3 équipes de recherches différentes chacune
dans un domaine d’expertise :
Une première équipe, d’acousticiens, sera en charge d’adapter l’utilisation des ultrasons à la
manipulation précise de cellules animales.
Une deuxième équipe de bioinformaticiens sera en charge du développement du programme
nécessaire au bon fonctionnement du robot qui devra mettre en œuvre les protocoles de culture
cellulaire et récolter un ensemble de données sur l’exécution de chaque étape de la culture ainsi
que sur les résultats des protocoles.
Enfin, une troisième équipe de biophysiciens aura pour mission de caractériser les effets des
ultrasons, à la fréquence et à la dose déterminées par la première équipe, sur les cellules selon
leur type cellulaire.
Dans un souci de parité, chaque équipe sera composé d’autant de femmes que d’hommes pour
garantir une bonne cohésion sociale.
En parallèle un partenariat sera mis en place avec l’éditeur Springer pour avoir accès à la base
de données Springer Protocols.
5.1. Equipe 1 : Acoustique et manipulation de cellule unique
Cette équipe sera constituée des chercheurs du laboratoire « Acoustique pour les
Nanosciences » de l’Institut des Nanosciences de Paris, à l’origine de la création de la pince
acoustique. Leur objectif sera d’adapter la pince acoustique déjà existante à la manipulation de
cellule unique dans un milieu liquide tout en garantissant la survie des cellules. La manipulation
d’une cellule devra être stable et permettre son passage entre les mailles de la MIV imprimée
en 3D avec du PCL (Figure 9).
Figure 9 : schéma 3D d’une MIV
imprimée en PCL. Les sphères
rouges représentent des cellules
placées dans la matrice. Les
flèches bleues indiquent les
angles d’approche où l’espace est
libre pour déposer une cellule à
l’aide de la pince acoustique. La
sphère bleue indique la position
hypothétique d’une cellule à
placer qui pourra être d’un type
cellulaire différent des cellules
rouges.

13. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 13
5.2. Equipe 2 : Bioinformatiques et culture cellulaire assistée
Cette équipe sera constituée de 4 bioinformaticiens :
- Un bioinformaticien spécialisé dans le développement de logiciel d’imagerie biomédicale
en Java. il développera un programme permettant la détection des cellules à partir des 2
caméras-microscopes et d’enregistrer leur position dans un espace 3D. le programme devra
également pouvoir effectuer un comptage des cellules à chaque étape d’un protocole et de
produire un score de qualité associé au déroulement de chaque étape.
- Un bioinformaticien spécialisé dans le text mining. Il devra développer un programme
permettant l’extraction des informations nécessaire à un protocole de culture cellulaire à
partir du DOI d’un protocole de culture cellulaire de la base de données Springer Protocols.
Il devra également rendre ce protocole interprétable par le robot.
- Une bioinformaticienne spécialisée dans la robotique appliquée à la biologie. Elle aura pour
tâche de s’occuper de la coordination et de la synchronisation des actions effectuées par le
robot pendant le déroulement d’un protocole de culture cellulaire. Elle devra articuler tous
les programmes développés par les autres bioinformaticiens.
- Une bioinformaticienne spécialisée dans les biotechnologies, qui sera en charge de la
conception et de la fabrication du robot.
5.3. Equipe 3 : Biophysique des ultrasons
Cette équipe sera constituée de 4 biophysiciens et biophysiciennes ayant des connaissances
avancées sur les ultrasons appliqués au domaine du vivant. Ils devront apporter des réponses
quant aux effets observés sur le métabolisme de différents types cellulaires et devront produire
un nouveau modèle de croissance de culture cellulaire contenant un paramètre lié à l’utilisation
d’ultrasons et dont la valeur sera spécifique du type cellulaire d’intérêt.
6.Calendrier Prévisionnel
Les recherches et le développement du projet se fera en quatre grandes phases sur 3 ans :
- Phase 1 : Développement d’une pince acoustique permettant la manipulation de cellule
unique dans un milieu liquide au sein d’une MIV (équipe 1).
- Phase 2 : Caractérisation des ultrasons sur différents types cellulaires (équipe 3).
- Phase 3 : Développement du logiciel et prototypage du robot (équipe 2).
- Phase 4 : Tests de mise en situation pour le robot et son programme avec différents
protocoles de culture cellulaire (équipe 2).
Tableau 1 : Calendrier Prévisionnel
12 Trimestres (36 mois)
Phases 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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14. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
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7.Budget Prévisionnel
Tableau 2 : Budget Prévisionnel
Frais de fonctionnement
Administratif Diverse (Salaires, Charges, Sécurité, Impôts) 250 000 €
Tests et Prototypage 60 000 €
Brevetage 6 000 €
Frais d’équipement
Matériel d’Acoustique 40 000 €
Matériel Informatique 30 000 €
Matériel de Biologie (Wet-Lab) 60 000 €
Montant Total 446 000 €
Références
1
Simone Gilgenkrantz, “Regard Sur Soixante Années de Culture de Cellules HeLa,” Histoire Des Sciences
Médicales XLVIII, no. 1 (2014).
2
Ian A. Cree, ed., Cancer Cell Culture, vol. 731, Methods in Molecular Biology (Totowa, NJ: Humana Press,
2011), http://link.springer.com/10.1007/978-1-61779-080-5.
3
Kursad Turksen, ed., Bioreactors in Stem Cell Biology, vol. 1502, Methods in Molecular Biology (New York,
NY: Springer New York, 2016), http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-6478-9.
4
Scott H. Randell and M. Leslie Fulcher, eds., Epithelial Cell Culture Protocols, 2nd ed, Methods in Molecular
Biology 945 (New York: Humana Press ; Springer, 2012).
5
Anthony Atala, Essentials of 3d Biofabrication and Translation (Boston, MA: Elsevier, 2015).
6
Diego Baresch, Jean-Louis Thomas, and Régis Marchiano, “Observation of a Single-Beam Gradient Force
Acoustical Trap for Elastic Particles: Acoustical Tweezers,” Physical Review Letters 116, no. 2 (January 11, 2016),
doi:10.1103/PhysRevLett.116.024301.
7
Diego Baresch, “Pince Acoustique: Piégeage et Manipulation D’un Objet Par Pression de Radiation D’une Onde
Progressive” (Paris 6, 2014), http://www.theses.fr/2014PA066542.
8
Yoichi Ochiai, Hoshi Takayuki, and Jun Rekimoto, “Three-Dimensional Mid-Air Acoustic Manipulation by
Ultrasonic Phased Arrays,” arXiv.org, n.d.
9
D. Bazou et al., “Long-Term Viability and Proliferation of Alginate-Encapsulated 3-D HepG2 Aggregates
Formed in an Ultrasound Trap,” Toxicology in Vitro 22, no. 5 (August 2008): 1321–31,
doi:10.1016/j.tiv.2008.03.014.
10
Mohamed Al-Rubeai, ed., Animal Cell Culture, vol. 9, Cell Engineering (Cham: Springer International
Publishing, 2015), p. 297, http://link.springer.com/10.1007/978-3-319-10320-4.
11
Thomas Robert Malthus, Parallel Chapters from the First and Second Editions of an Essay on the Principle of
Population (Macmillan, 1909).
12
Turksen, Bioreactors in Stem Cell Biology.
13
Atala, Essentials of 3d Biofabrication and Translation, 6.
14
Al-Rubeai, Animal Cell Culture, 10:265.
15
Atala, Essentials of 3d Biofabrication and Translation, chap. 13.
16
Ibid., 6.

15. M2 BiB – Université Paris Diderot (Paris 7) 01 décembre 2016
Y. PAGEAUD 15
17
Ibid., 158.
18
Ibid., 338.
19
Glauco R. Souza et al., “Three-Dimensional Tissue Culture Based on Magnetic Cell Levitation,” Nature
Nanotechnology 5, no. 4 (April 2010): 291–96, doi:10.1038/nnano.2010.23.
20
Jennifer R. Molina et al., “Invasive Glioblastoma Cells Acquire Stemness and Increased Akt Activation,”
Neoplasia 12, no. 6 (June 2010): 453–IN5, doi:10.1593/neo.10126.
21
Neenu Singh et al., “Potential Toxicity of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles (SPION),” Nano
Reviews 1, no. 0 (September 21, 2010), doi:10.3402/nano.v1i0.5358.
22
Ali S. Arbab et al., “Characterization of Biophysical and Metabolic Properties of Cells Labeled with
Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles and Transfection Agent for Cellular MR Imaging,” Radiology 229,
no. 3 (December 2003): 838–46, doi:10.1148/radiol.2293021215.
23
Farideh Namvar et al., “Cytotoxic Effect of Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Synthesized via Seaweed
Aqueous Extract,” International Journal of Nanomedicine, May 2014, 2479, doi:10.2147/IJN.S59661.
24
Marcela Gonzales et al., “Cytotoxicity of Iron Oxide Nanoparticles Made from the Thermal Decomposition of
Organometallics and Aqueous Phase Transfer with Pluronic F127,” Contrast Media & Molecular Imaging 5, no.
5 (September 2010): 286–93, doi:10.1002/cmmi.391.
25
Yu Pan, Matthias Bartneck, and Willi Jahnen-Dechent, “Cytotoxicity of Gold Nanoparticles,” in Methods in
Enzymology, vol. 509 (Elsevier, 2012), 227.
26
Ibid., p. 232.
27
Ibid., pt. 2. 2. Dosage and Quantification of Gold Nanoparticles.
28
Stefaan J.H. Soenen and Marcel De Cuyper, “How to Assess Cytotoxicity of (Iron Oxide-Based) Nanoparticles.
A Technical Note Using Cationic Magnetoliposomes,” Contrast Media & Molecular Imaging 6, no. 3 (May 2011):
153–64, doi:10.1002/cmmi.415.
29
Stefaan J.H. Soenen et al., “Cytotoxic Effects of Iron Oxide Nanoparticles and Implications for Safety in Cell
Labelling,” Biomaterials 32, no. 1 (January 2011): 195–205, doi:10.1016/j.biomaterials.2010.08.075.
30
Daniele Foresti et al., “Investigation of a Line-Focused Acoustic Levitation for Contactless Transport of
Particles,” Journal of Applied Physics 109, no. 9 (2011): 93503.
31
Ochiai, Takayuki, and Rekimoto, “Three-Dimensional Mid-Air Acoustic Manipulation by Ultrasonic Phased
Arrays.”
32
D. Foresti, M. Nabavi, and D. Poulikakos, “On the Acoustic Levitation Stability Behaviour of Spherical and
Ellipsoidal Particles,” Journal of Fluid Mechanics 709 (October 2012): 581–92, doi:10.1017/jfm.2012.350.
33
Bazou et al., “Long-Term Viability and Proliferation of Alginate-Encapsulated 3-D HepG2 Aggregates Formed
in an Ultrasound Trap.”
34
Baresch, Thomas, and Marchiano, “Observation of a Single-Beam Gradient Force Acoustical Trap for Elastic
Particles.”
35
Yoichi Ochiai, Takayuki Hoshi, and Jun Rekimoto, “Pixie Dust: Graphics Generated by Levitated and Animated
Objects in Computational Acoustic-Potential Field,” ACM Transactions on Graphics 33, no. 4 (July 27, 2014): 1–
13, doi:10.1145/2601097.2601118.
36
Baresch, Thomas, and Marchiano, “Observation of a Single-Beam Gradient Force Acoustical Trap for Elastic
Particles.”
37
Jean-Louis Thomas and Antoine Riaud, “How to Generate a Swirling Surface Acoustic Wave?,” Fait d’Actu,
December 2015, INSP-Institut des Nanosciences de Paris edition.
38
Baresch, “Pince Acoustique.”
39
A. Schuster et al., “Cell Specific Ultrasound Effects Are Dose and Frequency Dependent,” Annals of Anatomy
- Anatomischer Anzeiger 195, no. 1 (January 2013): 57–67, doi:10.1016/j.aanat.2012.03.008.
40
R. Buckminster Fuller, Synergetics (Pacific Tape Library, 1975)
41
Ibid., sec. 1025.10 Closest Packing of Bubbles.
42
Ibid., sec. 1033.10 Octave System of Polyhedral Transformations.