PowerPoint de parasitologie rendant compte sur les techniques de concentration pour la recherche des parasites.

1. Dr HAMOUDA O

2.  On appelle concentrations les techniques par
lesquelles on essaie á partir de la grande quantité
des matières fécales recueillies d´obtenir dans
un faible volume les œufs, larves, kystes voire
formes végétatives fixées de parasites par
élimination des résidus de la digestion.
 Seront donc envisagées successivement les
méthodes physiques, les méthodes physico-
chimiques et les méthodes combinées .Dans le
grand nombre de méthodes proposées seront
présentées celles qui pour leur commodités et
leur efficacité, sont les plus utilisées dans les
laboratoires dont les résultats semblent très
fiables sur les plan international.

4.  Dans ces techniques, les éléments
parasitaires des selles sont concentrés sous
l'action de la pesanteur.
 On les retrouve donc dans le sédiment des
solutions où les selles ont été diluées. Le plus
souvent on travaille en tube et on examine le
sédiment obtenu après prélèvement à la
pipette. Ce matériel est déposé sur une lame
de microscope, coloré par le lugol et
recouvert d'une lamelle .

5.  PRODUITS À UTILISER•
 NaCl : 9 g
 Eau distillée : 1 000 ml•
 Lugol double
 TECHNIQUE
 - Triturer 10 à 20 g de selles avec 10 à 20 ml d’eau physiologique
 - Tamiser sur une passette métallique
 - Mettre la dilution dans un verre à pied puis le remplir complètement
 - Laisser reposer 1 heure
 - Reprendre le culot dans de l’eau physiologique et ainsi de suite jusqu’à
l’obtention d’un liquide surnageant clair
 - Homogénéiser le dernier culot (sans ajouter d’eau)
 LECTURE
 Examiner des gouttes du sédiment entre lame et lamelle, en ajoutant une goutte
de lugol double pour colorer les éléments parasitaires.
 RÉSULTATS
 Technique artisanale peu efficace et grande consommatrice de temps, réservée à
des laboratoires démunis de matériel (laboratoire de brousse de pays en voie de
développement).

7.  TECHNIQUE
 Même technique que ci-dessus mais la
sédimentation passive est remplacée par des
centrifugations à 1 500 tr/min pendant 1
minute.
 INTÉRÊT
 Technique plus rapide mais d’une efficacité
inférieure à la moyenne.

8.  Le principe est basé sur l’emploi d’un liquide très
dense qui provoque la flottation des éléments
parasitaires à sa surface. La difficulté de leur
prélèvement est contournée par la possibilité que
l’on a de remplir un tube avec plus de liquide
qu’il ne peut contenir, provoquant ainsi la
création d’un ménisque convexe en haut du tube.
Le prélèvement des éléments parasitaires
flottants est fait en touchant ce ménisque avec la
face inférieure d’une lamelle, qui est ensuite
déposée sur une lame préparée avec une goutte
de lugol double.

9.  Il s’agit d’une méthode de concentration par flottation des
éléments parasitaires dans une solution de sulfate de zinc à
33 % de densité 1,180.
 PRODUITS À UTILISER•
 Solution de sulfate de zinc à 33 %
 Dissoudre 1,5 kg de sulfate de zinc dans 2 l d’eau du robinet
chaude.Filtrer sur papier Whatman n° 1.Au moment de
l’emploi, ajuster la densité du liquide à 1,180 à l’aide d’un
densimètre gradué de 1,100 à 1,200•
 Lugol double

10.  TECHNIQUE
 - Délayer environ 5g de selles dans une passette à l’aide d’un
agitateur en verre avec 20 ml d’eau du robinet sur un bécher
en plastique à usage unique.
 - Verser 20 ml de cette dilution dans un tube à centrifuger en
plastique à usage unique à fond rond.
 - Centrifuger à 2 500 tr/min pendant 45 secondes. Décanter
le surnageant.
 - Recommencer ces opérations jusqu’à ce que le surnageant
soit clair.
 - Reprendre le dernier culot avec environ 20 ml de solution
de sulfate de zinc. Bien homogénéiser le sédiment, puis
compléter le remplissage jusqu’à 1 cm du bord du tube.
 - Centrifuger comme précédemment.
 - Disposer le tube sur un portoir et y ajouter avec précaution
avec une pipette Pasteur de la solution de sulfate de zinc
jusqu’à l’obtention d’un ménisque convexe au sommet du
tube.
 - Attendre 12 minutes.
 - Prélever la surface du ménisque en l’effleurant avec la partie
centrale d’une lamelle 22 x 22 mm, que l’on dépose ensuite
sur une lame préparée avec une goutte de lugol double.
 - Garder les lames ainsi préparées dans des boîtes
hermétiques jusqu’à la lecture, pour éviter la dessiccation.

11.  LECTURE
 La lecture se fait au microscope aux grossissements 16×,
40× voire 100×-immersion.
 RÉSULTATS
 C’est une bonne technique pour la plupart des parasites.
Cependant toutes les formes végétatives de protozoaires qui
auraient pu subsister depuis la défécation sont détruites par
l’eau du robinet.
 Les kystes de protozoaires se rétractent à la longue et leur
identification peut devenir difficile.
 Comme dans la plupart des techniques de flottation, les
temps de dilution des selles, de concentration et de
prélèvement doivent être exécutés assez rapidement au
risque de laisser descendre les œufs d’Ascaris lumbricoides
non fécondés, de Fasciola hepatica imprégnés de liquide.

12.  La flottation des éléments parasitaires se fait dans
une solution aqueuse d’iodo-mercurate de potassium
de densité 1,440
 PRODUITS À UTILISER•
 Solution d’iodo-mercurate de potassium
 Dissoudre 110 g d’iodure de potassium dans 100 ml
d’eau distillée, puis ajouter, par petites quantités,
150 g de bi-iodure de mercure, tout en agitant.
 Compléter à 400 ml avec de l’eau distillée. Ajuster la
densité du liquide à 1,440 à l’aide d’un densimètre.
 La solution se conserve indéfiniment à température
ambiante dans un flacon en verre. En pratique, il vaut
mieux la renouveler tous les 2 ou 3 mois.
 Lugol double

13.  TECHNIQUE
 - Triturer 5g de selles avec 20 ml de la solution
d’iodo-mercurate de potassium, tamiser sur une toile
métallique à mailles de 1 mm.
 - Centrifuger à 2 500 tr/min pendant 3 minutes.
 - Disposer le tube sur un portoir et y ajouter avec
précaution avec une pissette ou une pipette Pasteur
de la solution d’iodo-mercurate jusqu’à l’obtention
d’un ménisque convexe au sommet du tube.
 - Attendre 1 minute
 - Prélever la surface du ménisque en l’effleurant avec
la partie centrale d’une lamelle 22 × 22, que l’on
dépose ensuite sur une lame préparée avec une
goutte
 de lugol double.
 - Garder les lames ainsi préparées dans des boîtes
hermétiques jusqu’à la lecture, pour éviter la
dessiccation.

14.  LECTURE
 La lecture se fait au microscope aux
grossissements 16×, 40× voire 100×-
immersion.
 RÉSULTATS
 Cette technique concentre particulièrement bien
les œufs de Fasciola hepatica, des schistosomes,
des ankylostomidés, des Hymenolepis et les
larves d’anguillules.
 Vu la densité du liquide, les kystes de
protozoaires sont très rapidement déformés,
serétractent et leur identification devient de ce
fait pratiquement impossible.

15.  Intérêt
 Dans les enquêtes épidémiologiques, cette technique présents
l´avantage de la simplicité d´exécution, de la rapidité et d´un
faible prix de revient Elle concentre bien les œufs
d'ancylostomidés et d'hyménolépidés.
 -Inconvénients
 La solution de chlorure de sodium pénètre assez facilement dans
les œufs et il ne faut pas
 Dépasser le temps prescrit dans le déroulement de la technique.
 -Déroulement de la technique
 Les selles sont diluées au dixième environ dans une solution
aqueuse de chlorure de sodium á saturation (25 grammes dans
100 ml environ; densité 1200), puis filtrées rapidement. La
suspension obtenue est versée dans un tube jusqu'à la limite
supérieure (léger bombement du Liquide au dessus du bord).
 On place alors délicatement une lamelle qui doit recouvrir tout le
tube sans bulle d'air.
 Un quart d'heure plus tard on retire la lamelle qui Est déposée
sur une
 Lame et la lecture de la concentration est effectuée avant
évaporation de l'eau et cristallisation du sel Ce qui, en pays
chaud, peut se produire rapidement.

16.  Ces méthodes utilisent les propriétés de
l'éther , qui d'une part, est un solvant des
graisses et d'autre part n'est pas miscible
avec l'eau, pour séparer les éléments
parasitaires du reste de la selle. Le solvant
employé pour diluer les fèces joue aussi un
rôle non négligeable qui sera détaillé avec
chaque technique.

17.  PRODUITS À UTILISER•
 Tampon acéto-acétique pH 5 obtenu avec :
 Acétate de Na cristallisé : 15 g
 Acide acétique : 3,60 ml
 Eau distillée :qsp 1 000 ml
 Ajuster le pH à 5 avec de l’acide acétique au pH-
mètre.
 •Éther sulfurique
 •Lugol simple (peut être obtenu par dilution de
moitié du lugol double avec de l’eau distillée).

18.  TECHNIQUE
 - Délayer 3g de selles avec 10 fois leur volume de tampon, laisser sédimenter
pendant moins d’une minute.
 - Décanter dans un tube à centrifuger à fond conique et à bouchon à vis.
 - Ajouter un volume égal d’éther sulfurique, en ménageant un espace d’1 cm dans
le haut du tube. Obturer le tube et l’agiter vigoureusement pendant 30 secondes
de façon à former une émulsion entre les deux liquides. Vérifier la tenue de
l’émulsion. Si elle se dissocie immédiatement, rajouter un peu de tampon et
reprendre l’agitation.
 - Centrifuger à 2 000 tr/min pendant 1 minute. Le contenu du tube se sépare en 4
couches :
 • la couche supérieure, constituée d’éther chargé de graisses
 • la couche suivante, très épaisse, adhérente au verre, formée de résidus
lipophiles
 • la troisième constituée par la solution de dilution
 • la quatrième, le culot.
 - Désobturer le tube et le retourner d’un coup sec afin de faire tomber les 3
couches supérieures et ne garder que le culot, bien fixé au fond du tube. (On peut
éventuellement essuyer les parois du tube avec un coton-tige, pendant qu’il est
maintenu la tête en bas).
 - Prélever le culot à la pipette et confectionner autant de lames que le culot le
permettra, en déposant des échantillons dans des gouttes de lugol simple
(lugoldouble dilué de moitié) sur chaque lame.

20.  LECTURE
 La lecture se fait au microscope aux
grossissements 10×, 40×
 RÉSULTATS
 Bonne technique qui permet de concentrer la
majorité des éléments parasitaires, sans
déformation des kystes de protozoaires.
 Ici, il convient d’examiner la totalité du culot de
sédimentation, qui peut être volumineux et
nécessiter la préparation de plusieurs lames.


21.  Cette méthode physicochimique utilise le
formol et l’éther.
 PRODUITS À UTILISER
 •solution de NaCl à 0,9 % en eau distillée.
 •Solution de formol constitué de :
 • formol commercial : 100 ml
 • eau distillée : qsp1000 ml
 •Lugol simple

22.  TECHNIQUE
 - Délayer 3 à 5g de matières fécales avec 10 fois leur volume d’eau physiologique.
 - Tamiser. Verser dans un tube à centrifuger à fond conique et à bouchon à vis.
 - Centrifuger à 1 500 tr/min pendant 2 minutes.
 - Décanter le surnageant et reprendre le culot comme précédemment jusqu’à ce
que le liquide de lavage soit clair.
 - Sur le dernier culot, le diluer dans la solution de formol. Laisser fixer pendant 5
minutes.
 - Ajouter 3 ml d’éther sulfurique, en ménageant un espace d’1 cm dans le haut du
tube. Obturer le tube et l’agiter vigoureusement pendant 30 secondes defaçon à
former une émulsion entre les 2 liquides. Vérifier la tenue de l’émulsion. Si elle se
dissocie immédiatement, rajouter un peu de tampon et reprendre l’agitation.
 - Centrifuger à 1 500 tr/min pendant 2 minutes. Le contenu du tube se sépare en
4 couches :
 • la couche supérieure, constituée d’éther chargé de graisses
 • la couche suivante, très épaisse, adhérente au verre, formée de résidus
lipophiles.
 • la troisième constituée par la solution de dilution
 • la quatrième, le culot.
 - Désobturer le tube et le retourner d’un coup sec afin de faire tomber les 3
couches supérieures et ne garder que le culot, bien fixé au fond du tube. (On peut
éventuellement essuyer les parois du tube avec un coton-tige, pendant qu’il est
maintenu la tête en bas.)
 - Prélever le culot à la pipette et confectionner autant de lames que le culot le
permettra, en déposant des échantillons dans des gouttes de lugol simple (lugol
double dilué de moitié) sur chaque lame.

23.  LECTURE
 La lecture se fait au microscope aux
grossissements 16×, 40× voire 100×-
immersion.
 RÉSULTATS
 Cette méthode est très efficace pour les œufs
d’Ascaris , y compris les œufs non fécondés, les
œufs de schistosomes et les kystes de toutes les
amibes.

24.  Méthode de Kato –Miura
 Cette technique est à la frontière entre l'examen direct et les méthodes de
concentration, d'une part parce que l'on ne « concentre » pas les éléments
parasitaires, mais d'autre part elle permet d'observer sur une seule lame le
matériel qui aurait nécessité 10 à 15 lames par examen direct pour être
correctement analysé. Cette technique est basée sur l'éclaircissement du
matériel fécal par la glycérine ou le polyéthylène glycol, les éléments
parasitaires, restés opaques, se révélant alors sur ce fond transparent.
 PRODUITS À UTILISER
 SOLUTION 1
 • Glycérine pure : 100 ml
 • Eau distillée : 100 ml
 • Vert de malachite : 1 ml (solution à 3% en eau distillée)
 SOLUTION 2
 - Solution A
 • Formol : 1 volume
 • Solution saturée de NaCl : 1 volume
 - Solution B
 • Polyéthylène glycol 300 : 1 volume
 • Solution saturée de NaCl : 1 volume
 Mélanger à parties égales les solutions A et B

25.  CELLOPHANE
 Découper des rectangles de cellophane de
2×3cm.
 Ces rectangles sont mis à tremper au moins
24 heures dans la solution 1 ou 2. Cette
réserve se conserve simplement par
exemple dans une boîte de Pétri ou un
autre récipient à température ambiante
jusqu’à épuisement des rectangles de
Cellophane, moment que l’on mettra à
profit pour tout renouveler.

26.  TECHNIQUE
 - Déposer une noisette de selles sur une lame
propre.
 - La recouvrir avec un rectangle de cellophane
imprégné du liquide de Kato.
 - Retourner la lame sur un matelas de 4 ou 5
couches de papier filtre et écraser la selle entre la
lame et la cellophane, en répartissant la selle de
façon homogène.
 - Répéter 3 fois ce geste sur des parties propres
du matelas de papier filtre.
 - L’éclaircissement des selles se fait en :
 - 1/2 heure à la température ambiante
 -5à7 minutes à 45 °C sur platine chauffante.
 EXAMEN MICROSCOPIQUE
 Il se fait directement au microscope ordinaire, la
cellophane jouant le rôle de lamelle.
 Les objectifs 10×, 16×, 40× voire 100×-
immersion sont applicables.

28.  RÉSULTATS
 Les œufs d’helminthes ainsi que les coccidies sont
parfaitement identifiables.
 Les gros œufs (grande douve, schistosomes) sont
quelquefois déformés, voire rompus. Les œufs fragiles
(ankylostomidés,Hymenolepis nana) deviennent
rapidement transparents et échappent alors à
l’observation.
 Les œufs de schistosomes s’éclaircissent rapidement, ne
laissant visible que la coque
 Les selles liquides ne peuvent pas être analysées par la
méthode de Kato, la mise en œuvre chassant tout le
matériel.
 Cette méthode éclaircit aussi tous les kystes de tous les
protozoaires, les rendant invisibles.

30.  Réalisation
 Appliquer un morceau de scotch au niveau de
la marge anale le matin, avant défécation et
avant toute toilette intime.
Appliquer le scotch sur une lame porte objet
Observer au microscope
 Intérêt
 Technique de référence pour la mise en
évidence d'oeufs d'E. vermicularis.

32.  C'est une méthode de concentration "biologique" basée sur
l'hygrotropisme et le thermotropisme des larves d'anguillule.
 Réalisation
 Mettre des selles sur de la gaze disposée sur une passoire
Poser la passoire dans un entonnoir (fermé) contenant de l'eau
tiède
Laisser reposer 2-3H
Récupérer le liquide
Centrifuger 3 min à 1500tr/min
Réaliser un examen microscopique sur le culot de centrifugation
 Intérêt
 Technique de référence pour le diagnostic d'anguillulose.
Elle permet la mise en évidence de larves rhabditoïdes