![L’aminopeptidase B (EC 3.4.11.6) ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP///yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBRAA7)
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Rapport stage pm
- 1. Biogenèse des Signaux Peptidiques Université Pierre et Marie Curie - ER3 BIOSIPE Responsables de stage : Sandrine Cadel, Thierry Foulon Parcours « Molécules et Cibles Thérapeutiques » Année 2009-2010 Patricia Masson Recherche d’acides aminés impliqués dans la spécificité de reconnaissance du substrat et dans le mécanisme catalytique de l’Aminopeptidase B
- 4. Modèle moléculaire de l’Aminopeptidase B NH 2 Domaine catalytique COOH
- 5. Famille M1 des Aminopeptidases HEXXHX 18 E Liaison peptidique
- 6. Mécanisme catalytique proposé pour l’activité aminopeptidase de la LTA 4 hydrolase (Tholander et al., 2008)
- 7. Objectifs But : Identifier des résidus de l’Ap-B ayant un rôle dans le mécanisme enzymatique et la spécificité de reconnaissance du substrat Mutagenèse dirigée Alignements des séquences des aminopeptidases de la famille M1 Modèle moléculaire de l’Ap-B
- 8. Matériels et Méthodes M 72 kDa M 72 kDa 170kDa 95kDa 72kDa 55kDa Mutagenèse dirigée Expression et purification des protéines (HP His trap et Sephadex G100) Test d’activité (spécificité de substrat; K M , k cat , K i , effet des ions Cl - ) Electrophorèse et Western Blot
- 9. Cibles de mutagenèse dirigée Reconnaissance et la fixation du substrat? Mécanisme catalytique?
- 10. Les mutants Y 228 F, Y 408 F, Y 413 F et Y 440 F Tyr 408 Tyr 413 Tyr 228 Tyr 440
- 15. Les mutants D 403 V, D 405 N, D 405 V et D 406 N Gel D 403 , D 405 et D 406 D 368 , D 371 , D 373 et D 375 de la LTA 4 hydrolase
- 16. Les mutants D 403 V et D 406 N : spécificité de reconnaissance du substrat D 406 N D 403 V Activité majoritaire avec les substrats basiques : Arg et Lys Elargissement de la spécificité de reconnaissance : Arg, Lys, Ala, Pro, Leu, Tyr, Phe, His et Met
- 17. Les mutants D 405 N et D 405 V : spécificité de reconnaissance du substrat Diminution d’un facteur 2 de l’activité vis-à-vis de substrat s basiques pour le D 405 V par rapport au D 405 N Elargissement de la spécificité de reconnaissance : Arg, Lys, Ala, Pro, Leu, Tyr, Phe, His, Met
- 18. Les mutants D 403 V, D 405 N et D 405 V WT D 403 V D 405 N D 405 V L-Arg kcat ( s -1 ) 28 0,9 2,7 0,5 Km ( µM) 115 114 136 63 kcat/Km (µM -1 .s -1 ) 0,243 0,008 (÷30) 0,020 (÷12) 0,007 ( ÷ 35) L-Lys kcat ( s -1 ) 9 1,3 - - Km ( µM) 188 176 - - kcat/Km (µM -1 .s -1 ) 0,047 0,007 ( ÷ 3) - - L-Ala kcat ( s -1 ) Liaison peptique non hydrolysée 2,4 1,3 Km ( µM) 401 212 kcat/Km (µM -1 .s -1 ) 0,005 0.006 L-Pro kcat ( s -1 ) 1,5 - Km ( µM) 252 - kcat/Km (µM -1 .s -1 ) 0,005 -
- 22. Perspectives Confirmer les résultats obtenus Effet du chlore : paramètres cinétiques (K M , k cat ) en fonction du substrat et de la mutation Concevoir d’autres mutants: Simples: F 296 Y, K 599 G, Y 408 G… Doubles: F 296 Y/K 599 R; D 405 N/D 406 N, D 405 V/D 406 V … Triples: D 403 A/D 405 A/D 406 A…. Activité vis-à-vis de différents peptides Informations structurales (dichroïsme circulaire, spectroscopie de fluorescence) Structure 3D avec un inhibiteur confirmation du modèle proposé
- 23. À plus long terme : Décrypter les mécanismes catalytiques Différences entre ApB et la LTA 4 hydrolase (bifonctionnalité) Conception d’ inhibiteurs spécifiques de chacune des activités de l’ApB Cibler pathologies Identifier les substrats peptidiques physiologiques de l’ApB
- 25. MUTAGÉNÈSE POUR FAIRE UN SITE ACTIF SIMILAIRE À CELUI DE LA LTA 4 HYDROLASE
- 27. Liaison électrostatique entre le groupement aminé et le carboxylate C-terminal du peptide: Arg -NA pas d’intérêt Effet des inhibiteurs est moindre avec le mutant K 599 R Liaison électrostatique avec le E 569 moins forte ?? K 599 E 569 R 704 Le mutant K 600 R : Hypothèses/Conclusions
Notes de l'éditeur
- L’ap-B est une enzyme monomérique de 72 kDa. Elle est ubiquitaire chez les vertébrés. C’est une Zn2+ métallopeptidase portant la signature d’un site de fixation d’un cation Zn2+ de type HEXXHX18E caractérisant les aminopeptidases de la famille M1 Elle enlève les résidus basiques (arg et lys) à l’extréminté nh2 terminal des peptides tel que les arg-enképhalines Elle est activé par les ions chlores vis-à-vis de substrat chromogéniques de type l-arg b na Et est phylogénétiquement très proche de la lta4h De plus elle présente une activité lta4h résiduelle in vitro, c’est-à-dire qu’elle est capable d’hydrolyser la liaison époxyde du leukotriène a4 pour le transformer en ltb4 qui est un médiateur lipidique puissant de l’inflammation. Ce qui en fait une enzyme bifonctionnelle.
- Quant à la lta4h, c’est une protéine monomérique de 69kda. C’est également une enzyme bifonctionnelle, puisqu’en plus de son activité lta4h, elle posséde une activité aminopeptidase mais qui ne se restreint pas au seul acides aminés basiques puisqu’elle est capable d’hydrolyser la liaison peptidique au niveau de l’alanine, la proline et la leucine. Elle appartient donc à la famille m1 des aminopeptidases Tout comme l’ap-B elle est activé par les ions chlores Et sa structure 3d obtenu par thunissen et ses collaborateurs en 2001 à permis d’établir un modèle moléculaire de l’ap-b basé sur celui de la lta4h
- Et comme nous pouvons le voir sur cette figure, Cette protéine est constitué de 3 domaines : Domaine nh2 ter constitué de feuillets béta Domaine cooh ter constitué d’hélice alpha Un domaine catalytique majoritairement constitué d’hélice alpha, présentant l’atome de zinc en rouge avec les résidus important interagissant dans le site actif
- Au niveau de son mécanisme, un premier modèle établit qu’un glutamate agit comme une base pour polarisé une molécule d’eau afin de permettre une attaque nucléophile au niveau du carboxylate du premier résidu du substrat dans le but de rompre la liaison peptidique du substrat. Cette liaison peptidique est aussi visible à ce niveau ci sur cette figure. On a également 2 histidine et un glutamade interagissant avec l’atome de zinc, présent dans le motif de fixation de l’atome de zinc HEXXHX18E et un glutamate présent dans le motif de fixation de l’extrémité NH ter GXmen caractérisant également les aminopetidase de la famille m1 qui interagit avec l’extrémité nh2 ter du substrat. De plus nous avons une tyrosine qui agit comme un donneur de proton à la fonction amine du second résidu du substrat.
- Cependant récement un nouveau mécanisme catalytique nous a été proposé pr l’activité aminopeptidase de la lta4h par tholander et ses collaborateurs. Ce mécanisme différent du premier du fait que la tyrosine 383 correspondant à la tyrosine 413 de l’ap-b, établit une liaison hydrogéne relativement forte entre son hydroxyle et le carboxylate du premier résidu du subtrat ici en rose afin de le maintenir. Nous voyons comme précédement que un glutamate ici, correspondant au glu326 intervient pour polaryser une molécule d’eau. Cependant, comme indiqué dans les encadré c et d, on vois que ce glutamate après avoir agit comme base, va agir comme donneur de proton à la fonction aminé du second résidu du substrat. La tyrosine 413 n’est donc plus le donneur de proton
- Le but de ce projet de stage été d’identifier des résidus importants pour la spécificité de reconnaissance du substrat et impliqués dans le mécanisme enzymatique. Des alignements de séquence on permis l’identification de résidus potentiels impliqués dans le mécanisme catalytique de l’Ap-B ou la reconnaissance du substrat. Ces résidus sont des cibles intéressantes donc pour la mutagenèse dirigée. Nous utiliserons, pour ce faire, un certain nombre d’outils mis au point au laboratoire: - un système d’expression chez E. coli pour les mutants(Pham et al., 2007); - un modèle moléculaire de la structure 3D de l’Ap-B, comme vu précédement(Pham et al., 2007).
- La méthode expérimentale du laboratoire est d’utilisé de la mutagenèse dirigée afin d’obtenir des mutants. Une fois obtenu, les mutants sont exprimé par transformation de bactéries E.coli. La protéine mutante ainsi produite est ensuite purifié sur colonne de nickel his trap et colonne d’exclusion sephadex g100 et les fractions post purification sont soumis à un test d’activité afin d’identifier dans quelles fractions ce situe la protéine mutante. La présence de la protéine mutantes est confirmer par électrophorése et ou western blot (comme on eu le voir sur c’est 2 images, on a bien des bandes à 72kDa) Après concentrations des fractions, la protéine mutants est soumis a des test d’activité afin d’étudier sa spécificité de substrat, de déterminer les paramètres cinétiques tel que le kcat et km, de voir le profil d’inhibition et déterminer le ki et enfin de déterminer l’effet des ions chlores. .
- En ce qui concerne les cibles de mutagenèses dirigées, nous nous sommes intéressé à des acides aminés présent dans le site actif mais aussi des acides aminés plus éloigné pour voir s’il été impliqué dans la reconnaissance et la fixation du substrat et ou le mécanisme catalytique.
- Parmes ces cibles, nous avons des tyrosines Dont la tyr 413, 440 et 228 qui sont des tyrosines conservées chez tout les aminopeptidases de la famille m1 et une tyrosine 408 proche de la tyrosine 413 et qui n’est conservé quant à elle que chez les aminopeptidases b et les lta4h. Ces tyrosines ont été muté en phénylalanine par le laboratoire afin de voir si la perte de la focntion hydroxyle joue un rôle important dans le mécanisme catalytique.
- Une fois l’enzyme purifiée, les résultats montrent que les activités des mutants Y408F et Y440F se restreignent toujours à l’hydrolyse au niveau des acides aminés basiques, l’Arg et le Lys-β-Naphtylamide. D’autre part et de manière similaire à l’enzyme sauvage, le chlore augmente l’activité de ces deux mutants d’un facteur 3 à une concentration de 150mM de NaCl comme on peu le voir sur ces graphes
- Nous pouvons voir sur ce tableau que les tyrosines 228 et 413 une fois muté en phénylalanine perdent leur activité, nous nous sommes donc concentré sur les tyrosines 408 et 440 muté en phe pour établir les paramètres cinétiques vis-à-vis du subtrat l-Arg Bna et nous constatons une diminution de l’efficacité catalytique d’un facteur 3 pour ces 2 mutants
- Des test d’inhibition vis-à-vis d’inhibiteurs spécifiques ont également été réalisé. Ce sont des arphaménines a et b et la bestatine qui sont des analogues de substrats dipeptidique non clivable. Les résultats obtenu nous montre que l’on a une modification du profil d’inhibition pour ces 2 mutants par rapport au sauvage. De plus le ki vis-à-vis de l’aphaménine obtenu pour le mutant y440f traduit donc une moins bonne affinité
- Ainsi les résultats obtenu au sujet de ces mutants tyrosines, nous montre qu’il y a 2 tyrosines dont la fonction hydroxyle est essentielle dans l’activité de l’ap-b étant donné que lorsque l’on a muté ces 2 tyrosines qui sont la tyrosines 413 et la 228 en phe, nous n’avions plus d’activité aminopeptidase. Le modèle moléculaire de l’ap-b présente sur cette figure nous à permis d’émettre des hypothéses quand au rôle de ces 2 tyrosine. La tyrsosine 413 polarise et maintient le carbonyle de la liaison peptidique clivée en établissant une liaison avec celui-ci. La tyr 228, elle, établi une liaison hydrogéne avec le glu 300 qui établit lui-même une liaison avec l’extrémité amino ter du petide de type arg – ser – arg. ainsi cette tyrosine qui apparaît avoir un rôle secondaire, a un rôle tout de même important puisque indirectement, en maintenant la position du glutamate 300 elle permet de maintenanir le peptide dans la poche catalytique. La tyrosine 408 quant a elle établit une interaction pi avec le grpt guanidinium ou aminé du subtrat, on se demande alors si elle n’aurai pas un rôle dans la spécificité de subtrat. De plus cette tyrosine 408 proche de la tyrosine 413 établit une liaison hydrogène avec celle-ci. La tyr 440 qui est conservée, comme on peu le voir sur ce modèle a son hrydroxyle qui pointe vers l’extérieur de la protéine. Ceci est étonnant puisqu’elle est est entouré d’un environnement relativement hydrophobe. Elle aurai donc un rôle architecturale en étavblissant des interactions hydrophobes avec d’autres résidus ou un rôle dans l’actration de molécule d’eau pour la catalyse.
- Nous nous sommes également interressé à des aspartates. En effet comme on peu le voir sur cette figure, nous
- Ces mutations interférent de manière notable avec le kcat ce qui induit une diminution de l’efficacité catalytique allant jusqu’à un facteur 35 Concernant le D405N l’efficacité catalytique est plus forte d’un facteur 4 vis-à-vis du l-Arg que par rapport au L-Pro et L-Ala, en revanche pour le D405V elle est identique pr le l’Arg et l-Ala De plus la mutation D405V par rapport à la D405N, diminue le km d’un facteur 2, le kacat d’un facteur 5 et l’efficacité catalytique d’un facteur 4, indiquant que la valine, n’est pas un environnement défavorable pour le positionnement d’un subtrat portant un charge positive Quand au mutant D403V on a le kcat et l’efficacité catalytique d’affecter, mais plus faiblement l’affinité
- Figure 17 : mise en évidence de la proximité et des interactions entre un substrat (Arg 702-Ser703-Arg 704) positionné dans le site actif de l’Ap-B avec les résidus Asp 403, Asp 406, Asp407, Tyr 409 et K600 (sur le modèle établi les résidus correspondants sont Asp 402, Asp 405, Asp406, Tyr 408 et K599 car il a été construit avec la séquence de l’Ap-B de rat dénuée de la Met initiatrice). les résidus Asp 406 et 407 joue un rôle essentiel dans la restriction de l’activité Ap-B vis à vis des résidus basiques. En effet leur mutation en Asn et Val élargit la spécificité de reconnaissance de l’enzyme en lui permettant d’hydrolyser un autre résidu basique, l’histidine ainsi que des résidus hydrophobes comme l’alanine, la proline, la phénylalanine, la tyrosine et dans une moindre mesure la glutamine et la méthionine. A part la tyrosine qui a un groupement hydrophobe, les acides aminés non chargés polaires ne sont pas reconnus. Les résidus acides ne sont pas non plus reconnus. Il apparaît que la charge négative des résidus Asp 406 et 407 gouverne l’interaction de la chaine latérale du substrat basique dans le site actif et empêche le clivage d’un résidu hydrophobe.
- A plus long terme, décrypter mécanisme catalytique, concevoir inhibiteur spé pour découvrir les hormones cibles et ses différents rôles, notament dans les pathologies en cas de dysfonctionnement
- Alors que pour le mutant K600R l’affinité vis à vis du LArg-b-NA est augmentée d’un facteur 1,5 au regard du sauvage, la constante catalytique est quant à elle diminuée d’un facteur 4,3 si bien que l’efficacité catalytique est diminuée d’un facteur 2,7X.