Ppt sur les différentes étapes d'extraction d'ADN et de purification

1. Préparé par Mme Fatmi Linda

10. Extraction et la purification des AN

11. L’extraction et la purification des AN sont les premières étapes dans la
plupart des études de biologie moléculaire.
L'AN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour
• le séquençage,
• la PCR ou
• le clonage..
Extraction et la purification des AN

12. CHOIX DE LA METHODE D'EXTRACTION
Le choix de la technique la plus adéquate repose généralement sur:
 L’acide nucléique cible.
 L’organisme source .
 Le matériel de départ .
 L’application en aval (PCR, clonage..)

13. Techniques d’extraction et de purification
Il existe différents protocoles expérimentaux pour extraire les acides
nucléiques, qui suivent approximativement le même schéma de
principe :
• -préparation de cellules
• - Lyse des cellules
• - Elimination des protéines et des lipides
• - Elimination des autres acide nucléique
• -précipitation des AN
• -conservation

14. préparation de cellules
• Culture liquide culture solide
découper en petit morceaux….

15. - Lyse des cellules
Lyse chimique
Lyse mécanique
Procaryote: La paroi est un
obstacle majeur
eucaryote
Détergents :
 SDS
 Triton X100
 Sarcosyl
Choc thermique
Choc osmotique

16. 2) Elimination des protéines
Hydrolyse enzymatique
Précipitation par un agent chaotropique
 Endoprotéase non spécifique : la protéinase K (65°c) + SDS
Précipitation dénaturants
 NaCl et (NH4)2SO4
 NaClO4
 LiCl
 TCG
 NaI

17. 3) L’inactivation des nucléases cellulaires :
telle l’EDTA ou le citrate > magnésium
(cofacteur des DNases et RNases).
4) Elimination des autres acides nucléiques :
NaOH : l’ARN est hydrolysé.
« RNase
4.1.2 Par élimination des ARN
4.1.1 par extraction phénol-chloroforme

19. Différentes variantes employées:
• l'ADN génomique (issu du ou des chromosomes des cellules
analysées)
• Ou
• l'ADN plasmidique (provenant de plasmides portés le plus souvent
par des cellules bactériennes ).

20. Différentes variantes employées:
Il existe aujourd'hui des kits commerciaux permettant de réaliser
rapidement
• l’extraction et la
• purification à l'aide de réactifs prêts à l'emploi.

21. technique d'extraction d'ADN

22. Les principaux procédés d'extraction de l ’ADN diffèrent
et peuvent se classer en trois principales types:
1- Les méthodes utilisant des solvants organiques.
2- Les méthodes utilisant des solvants non organiques.
Précipitation par un agent chaotropique

23. 1- Les méthodes utilisant des solvants organiques.

28. 2- Les méthodes utilisant des solvants non organiques.
ex: Précipitation par un agent chaotropique

29. TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET
D’ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES
29
Préparation d'ADN plasmidique

30. 3. Précipitation par un agent chaotropique

31. 3. Précipitation par un agent chaotropique
• Ces méthodes d'extraction et de purification des acides
nucléiques sont les dernières récemment apparues.
• Elles sont basées sur la propriété qu'ont les particules de
silice d'adsorber sélectivement les acides nucléiques.

34. Conservation des AN :
1) d’ADN :
 Un tampon (10mM de pH=8), à 4°c.
 Additionné d'EDTA 1mM qu’ils évitent aussi la croissance de microorganismes.
 Il peut être conservée également au réfrigérateur/2 sem. ou au congélateur à -20
°c/des périodes plus longues.
2) d’ARN :
Du fait de l’ARN plus instable que l’ADN à cause des RNases, les échantillons sont
stockés à -80°C après addition d'éthanol.

35. électrophorèse

37. Electrophorèse :
La technique la plus utilisée pour la séparation
des acides nucléiques
Principe général:
la séparation des particules se fait en fonction de leur charge
électrique ET en fonction de leur taille.

38.  Le gel est constitué d'une matrice de polymère baignant dans
un tampon conducteur.

39. Casting tray
Gel combs
Power supply
Gel tank Cover
Electrical leads

agarose gel Electrophoresis Equipment

40. L’agar-agar
Agar-agar est un mot d'origine Malaise qui désigne en extrême-orient la gelée obtenue à partir de
diverses algues rouges
gélidium
gracilaria
Au XVIIème siècle par un cuisinier Japonais. Une industrie dont le Japon conserva
seul la maîtrise jusqu'à la 2ème guerre mondiale.
Une découverte accidentelle
le gel d'agarose

42. Agarose Buffer Solution
Combine the agarose powder and buffer solution. Use a flask that is several times larger
than the volume of buffer.

43. Agarose is insoluble at room temperature (left).
The agarose solution is boiled until clear (right).
Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose to dissolve.
***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and may boil violently if it has been
heated too long in a microwave oven.
Melting the Agarose

44. Pouring the gel

46. buffer 
Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm. Make
sure each well is filled with buffer.
Cathode
(negative)
Anode
(positive)

wells
  
DNA

47. Loading the Gel
Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample. The sample should sink
into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip.

48. Running the Gel

49. Ethidium Bromide requires an ultraviolet light source to visualize

51.  100
 200
150
 1,650
 1,000
 500
 850
 650
 400
 12,000 bp
 5,000
 1500 pb
DNA Ladder Standard
Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to determine the sizes of unknown
DNAs.
-
+
DNA
migration
bromophenol blue
Note: bromophenol blue
migrates at approximately the
same rate as a 300 bp DNA
molecule

53. Le gel d’acrylamide
C'est un gel réticulé, obtenu par polymérisation :
acrylamide bis-acrylamide

54. Cas du gel de polyacrylamide
Utilisé pour la séparation des fragments d’ADN de moins de 1000 pb à la base près.
Le gel est coulé entre deux plaques de verre à l'abri de l'oxygène.
La migration est verticale.
Ses utilisations majeures :
Purifier des oligonucléotides de synthèse et éliminer des nucléotides libres
Déterminer des séquences d'ADN.
Séparer des petits fragments d'ADN

55. TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET
D’ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES
55
Efficace pour les petits fragments d’ADN entre 20 & 2000 paires de
bases. (cartographie)
GEL D’ACRYLAMIDE NATIF (L’ADN est double brin)

56. TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET
D’ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES
56
Bande à moindre mobilité
 forme relâchée
Bande à + forte mobilité
 forme superenroulée
Electrophorèse de l’ADN plasmidique

57. TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET
D’ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES
57
Formes linéaire, relâchée, super-enroulée

58. Home work
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