Protocole de l'extraction de l'ARN

1. Protocol
d'extraction d'ARN
Réalisé par :
HASNAOUI MANAL
HERCHI AYA
Sous la supervision de Pr. NIHAL ABITIU

2. 04
03
02
01
Rappel d’ARN
et son rôle
Outils et matériaux nécessaires
pour l'extraction de l'ARN
Étapes de l'extraction de
l'ARN
Conclusion
(Pourquoi extrait-on
l'ARN?)
PLAN

3. Rappel d’ARN et son rôle :
L'ARN est un acide nucléique essentiel présent chez
tous les êtres vivants et certains virus. C’est une
molécule constituée d'un enchaînement de
ribonucléotides (adénine, cytosine, guanine, uracile)
reliés entre eux par des liaisons nucléotidiques. les
ARN sont issus de la transcription de l'ADN par
l’enzyme ARN polymérase qui recopie en quelque
sorte la séquence.
Les ribonucléotides sont différents des
désoxynucléotides par la présence d'un groupement
OH en 2' du ribose, mais aussi par le fait que la
thymine (T) est remplacée par l'uracile (U).
THYMINE

4. Il existe de nombreuses familles d'ARN (ARNr, ARNm, ARNt, ARNsi, ARNmi, snARN...),
dont chacune possède une structure ou une fonction particulière :
les ARN messagers (ARNm) serviront de matrice pour la synthèse des protéines, en copiant et
diffusant l'information génétique de l'ADN vers les ribosomes.
les ARN ribosomiques (ARNr) entrent dans la composition des ribosomes, avec les protéines
ribosomiques, pour assurer la traduction de l'ARNm en protéines.
les ARN de transfert (ARNt) portent des acides aminés et permettent leur incorporation dans
les protéines.

5. les ARN interférents (ARNsi, ARNmi...) régulent l'expression des gènes en ciblant la
dégradation des ARN messagers spécifiques ou en inhibant la traduction des protéines.
D'autres familles existent et de nouvelles classes (ARNsno, ARNnc,...) sont régulièrement
découvertes.

6. LES METHODES D’EXTRACTION
D’ARN

7. L'extraction de l'ARN peut être réalisée à l'aide de différentes méthodes, chacune
ayant ses propres avantages et limitations. L'une des méthodes couramment
utilisées est la méthode de Trisol qui utilise le réactif Trisol pour lyser les cellules
et dénaturer les protéines, permettant ainsi de libérer l'ARN.
Il existe d'autres méthodes d'extraction d'ARN telles que:
• La méthode de phénol-chloroforme utilise une combinaison de phénol et de
chloroforme pour séparer l'ARN des autres composants de l'échantillon.
• La méthode de la colonne de purification où l'ARN est lié à une colonne à
base de silice et purifié à l'aide de différentes étapes de lavage.
• La méthode de l'acide guanidinium-thiocyanate utilise un réactif à base
d'acide guanidinium pour lyser les cellules et préserver l'ARN. Ensuite, l'ARN
est précipité et purifié à l'aide d'éthanol ou d'isopropanol.

8. Outils et matériaux nécessaires pour
l'extraction de l'ARN

9. MATÉRIAUX
Centrifugeuse réfrigérée
séparer les différentes phases d'un
échantillon à une basse
température. La réfrigération aide à
maintenir la stabilité des
échantillons pendant la
centrifugation, en évitant leur
dégradation ou leur altération.
Culture cellulaire conservée
à -30°C
ensemble de cellules cultivées en
laboratoire pour des études et
des expériences. La conservation
à moins 30° permet de préserver
la viabilité et l'intégrité des
cellules à long terme.
Hotte à flux laminaire
un équipement pour créer un
environnement stérile et protéger
les échantillons de contaminants.
Elle génère un flux d'air filtré qui
souffle de manière
unidirectionnelle, empêchant ainsi
les particules et les bactéries de
contaminer l'échantillon.

10. MATÉRIAUX
Tube Eppendorf de 2 mL
tube à centrifuger est conçu pour
contenir de petites quantités de
liquide. On l'utilise à l’extraction
d’ARN pour manipuler précisément
de petites quantités d'échantillon pour
obtenir des résultats fiables et pour
offrir une protection contre la
contamination, et préserver la qualité
de l'ARN extrait.
Pipetman de 200 µL et 1 mL
un type de pipette utilisé en
laboratoire pour mesurer et
transférer des liquides avec
précision ce qui est essentiel
pour obtenir des résultats fiables
Réfrigérateur à -30°C
un équipement pour créer un
conserver les échantillons à des
températures froides pour éviter la
dégradation de l'ARN et préserver
sa qualité.

11. LES RÉACTIFS
Trizol
un réactif utilisé lors de l'extraction d'ARN. Sa fonction
principale est de dénaturer les protéines présentes dans
l'échantillon, pour isoler l'ARN de manière efficace. Il
aide également à stabiliser l'ARN extrait, en empêchant
sa dégradation pendant le processus d'extraction.
Isopropanol
un solvant organique utilisé lors de l'extraction
d'ARN. Son rôle principal est de précipiter l'ARN,
c'est-à-dire de le faire passer de l'état liquide à l'état
solide. cela permet de séparer l'ARN des autres
composants présents dans l'échantillon, tels que les
protéines et les lipides.

12. LES RÉACTIFS
Chloroforme
un solvant organique qui utilisé à l'extraction d'ARN.
Son rôle est de séparer les phases liquides dans
l'échantillon, permettant ainsi de récupérer l'ARN dans
la phase aqueuse. Cependant, de nos jours, d'autres
méthodes d'extraction d'ARN ont été développées qui
évitent l'utilisation du chloroforme en raison de ses
propriétés toxiques.
Ethanol
composé chimique qui connu sous le nom d'alcool
éthylique. C'est une substance. Dans l'extraction
d'ARN, l'éthanol est utilisé comme solvant pour
précipiter et purifier l'ARN et de le séparer des autres
composants de l'échantillon, permettant ainsi de
récupérer un ARN de haute qualité pour des analyses
ultérieures.

13. - permet la perturbation des structures cellulaires .
- Enlever la culture cellulaire de l’étuve à CO2,
- Enlever tout le milieu de culture du Flask de culture,
- Ajouter 1 mL de Trizol qui désactive les RNases dans le flask
- Laisser au repos pendant 5 min à la température de la salle,
- Apres les 5 min, prendre la spatule pour détacher les cellules
adhérées au flask (6)
1- Homogénéisation / lyse cellulaire :
L’utilisation du Trizol permet de séparer ARN, ADN et protéines en
fonction de leurs densités relatives . (6)
Etapes d'extraction d'ARN par TRIZOL :

14. 2 - Séparation de phases :
- Transvaser le contenu du flask de culture dans des tubes
Eppendorf de 2 ml.
- Refermer les tubes et bien mélanger vigoureusement à la main
- Ajouter du chloroforme (1/5 de volume de trizol)
- Refermer les tubes et agiter pendant 15 sec
- Après agitation laisser les tubes au repos pendant 5 min à la
température de la salle,
- Après les 5 min, centrifuger les tubes à 12000 tr/min 5-15 min,
2-8°C . (6) (7)
(D) : tube Eppendorf

15. Après centrifugation, on obtient trois phases :
• une phase aqueuse supérieure contenant l’ARN,
• une phase intermédiaire visqueuse contenant l’ADN,
• une phase inférieure rougeâtre contenant les protéines,
-transférer la phase supérieure aqueuse dans un nouveau tube
veiller à ne pas aspirer l’interface blanche contenant . (7)
3 - Précipitation de l’ARN:
A la phase aqueuse récupérée, ajouter l’isopropanol (70% de la phase aqueuse
ou 1/2 volume de trizol),
- agiter délicatement jusqu’à homogénéisation totale,
- Laisser ensuite le tube au repos pendant 10 min,
(7)

16. - Après les 10 min, centrifuger à 12000 tr/min pendant 20 min à 4°C,
- Après les 20 min, débarrasser du surnageant et ajouter 1 mL d’éthanol 75%,
- Centrifuger à nouveau à 9000 tr/min pendant 5 min à 4°C,
- Rejeter le surnageant et conserver le culot d’ARN. (6) (7)
4 - Lavage de l’ARN :
- ajouter au culot d’ARN éthanol 70% préparé avec de
l’eau sans RNase et mélanger au Vortex pendant 15 s,
- Centrifuger le mélange à 9000 tr/min (7500g)
pendant 5 min à 4°C,
- Rejeter le surnageant et répéter l’opération de lavage
une seconde fois, (E) : vortex

17. - Après le 2ème lavage, ajouter 500 µL d’éthanol 75% sans mélanger. Puis on le
sèche L’ARN doit être ainsi conservé à -37°C dans un tampon pour conserver
l'échantillon et pour une utilisation ultérieure. (6) (7)
5- Évaluation de la qualité et de la pureté de l’ARN:
Le contrôle de la qualité des ARN après extraction est essentiel pour garantir la réussite
des analyses suivantes . Parmi les méthodes du contrôle :
• Dosage spectrophotométrique (B) Analyse de l'électrophorèse sur gel d'agarose : (A).

18. Pourquoi extrait-on l'ARN ?
Voici quelques raisons pour lesquelles on extrait l'ARN :
• Étude de l'expression génique : comment les gènes sont activés et comment les
protéines sont produites dans une cellule. Cela peut aider à comprendre comment les
gènes sont régulés s.
• Détection de maladies : L'extraction d'ARN peut être utilisée pour détecter des
maladies génétiques ou infectieuses, comme le cancer.
• Recherche pharmaceutique : L'extraction d'ARN peut être utilisée pour le
développement de nouveaux médicaments.

19. Références :
6- Technique d'extraction d'ARN d'une culture cellulaire par le trizol ; Gueyraud
Rolland Kipré, Hriday Shankar Pandey, Pankaj Seth, and Allico Joseph Djaman ;
American Journal of Innovative Research and Applied Sciences
7- Reef Recovery information ; extraction ARN à l'aide du trizol
8- University de LORAINE Galvanin A, Ayadi L, Helm M, Motorin Y, Marchand V

20. Références des images :
A -ENS Lyon FRANCE ;
B -Laboratryinfo ; spectrophotometer
C -USA Scientific ; cell culture flasck
D- Fisher scientific ; tube eppendrof
E -MLS France ;instruments de laboratoire ; melangeurs et agitateurs