Le document traite de la dynamique intracellulaire des protéines et des méthodes pour étudier leur comportement en temps réel. Il aborde les différents types de structures protéiques, leurs interactions, ainsi que les avancées technologiques en protéomique pour explorer des mécanismes fondamentaux. Les applications des protéines fluorescentes et des outils de bioluminescence pour suivre ces dynamiques dans des systèmes cellulaires sont également discutées.

1. Dynamique intracellulaire des
protéines en temps réel
Mourad FERHAT, Ph.D
Spécialiste analyse cellulaire et protéomique
Promega France

2. La révolution de la protéomique

3. Comprendre des mécanismes fondamentaux grâce à la
dynamique des protéines
The role of receptor diffusion in the organization of the postsynaptic membrane.
Daniel Choquet & Antoine Triller. Nature Reviews Neuroscience 4, 251-265 (April 2003)

4. Au programme
Que savons-nous des protéines ? Quelles sont leurs dynamiques ? Quelles méthodes d’étude ?

5. Que savons-nous des protéines ?

6. A la source … les acides aminés

7. Quatre niveaux de structure
Structure primaire
Séquence en aa
Structure secondaire
Feuillet β
Helice α
Structure quaternaire
Structure tertiaire
Interactions hydrophobe
Liaisons ionique
Pont disulfure

8. Une diversité de localisation et de fonction
Cellules HeLa
2000 µm3
2 X 109 Protéines*
(E.coli : 2,36 X 106)
Récepteurs
< 100 molécules
Enzymes
(Signalisation)
1000 -10000
Protéines
structurales
108 molécules
Christopher E. Sims and Nancy L. Allbritton. Analysis of single mammalian cells on-chip, Lab Chip, 2007, 7, 423 – 440.
Siwiak M, Zielenkiewicz P. Transimulation - protein biosynthesis web service. PloS ONE. 2013 Sep 05 8(9): e73943.

9. Quelles sont leur dynamique ?

10. Les protéines possèdent une dynamique interne
Glycogène synthase (GS)

11. Dynamique à l’échelle de la protéine
Liaisons Hydrogènes
Vibration
Liaisons Hydrogènes
- Ruptures
- Réarrangements
- Rotations
Published in: Yao Xu; Martina Havenith; The Journal of Chemical Physics 2015, 143,
Mouvements des
chaines latérales
Mouvements de la
protéine
Changements
conformationnels

12. Les molécules d’eau participent à cette dynamique
Rotation Rotation
Translation
Mouvement des molécules d’eau
à la surface des protéines
Protéine inactive Protéine active

13. Approcher la dynamique des
protéines
Méthodes d’étude

14. Approcher la dynamique des protéines
A l’échelle de la protéine A l’échelle de la cellule

15. Méthodes d’approches à l’échelle de la protéine
Normal Mode Analysis of Biomolecular Structures: Functional Mechanisms of Membrane Proteins Ivet Bahar,
Timothy R. Lezon, Ahmet Bakan, and Indira H. Shrivastava Chemical Reviews 2010 110 (3), 1463-1497
Real-Time NMR Characterization of Structure and Dynamics in a Transiently Populated Protein Folding
Intermediate. Enrico Rennella et al. †J. Am. Chem. Soc., 2012,
Modélisation/Simulation
Diffraction aux Rayon X
Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

16. Méthodes à l’échelle cellulaire
 Gènes rapporteurs
 Photoblanchiment (Photobleaching)
 Mesure des interactions protéiques

17. L’approche gènes rapporteurs
 Fusion :
 Transcriptionnelle : séquence régulatrice (promoteurs, élément de réponse …)
 Traductionnelle : expression d’une protéine hybride

18. Suivi de la translocation
Cellules HeLa : Nluc (luciférase) – GR fusion
Cytoplasme Noyau
Translocation
+ dexamethasone
(15 min)
Engineered luciferase reporter from a deep Sea Shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.
ACS Chem. Biol. 2012, 7, 1848−1857

19. Flurophores pour l’imagerie : la GFP
 GFP : Green Fluorescent Protein
 Protéine de 27 kDa
 Issue de la méduse Aequora victoria (1962)
 Premier clonage en 1992
 Structure : tonneau β (11 feuillets β/1 hélice α)
 4variants initialement dérivés
238 aa, 27 kDa
3 nm
4 nm
Chromophore :
Tyrosine/Glycine/Serine

20. Les protéines fluorescentes les plus courantes
Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues
Dmitriy M. Chudakov et al. Physiological Reviews Published 1 July 2010 Vol. 90 no. 3, 1103-1163
.
BFP-H2B - GFP-actin -
RFP-golgi

21. Fluorescence et dynamique

22. FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching
+ Tunicamycine
VSVG-GFP
Mobilité
Immobilité
VSVG : Vesicular stomatitis virus G protein.

23. FRAP : des données quantitatives
Diminution de la constante D (Diffusion) :
 Augmentation de la viscosité
 Formation d’agrégats ou de complexes
 Interaction
Augmentation de la constante D :
 Mouvement dirigé
 Diminution de la viscosité
Température
Viscosité

24. FLIP : Fluorescence Loss Induced by Photobleaching
 Photobleaching toutes les 40 s
 Disparition de la fluorescence au bout de 18 min
 Continuité ER
Diminution de fluorescence

25. Interactions protéiques

26. Les interactions protéiques
 Signalisation cellulaire
 Interaction Récepteur ligand
 Assemblage de récepteurs
150 000 à 300 000 interactions
Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy
Andrei A. Ivanov et Fadlo R. Khuri.
Trends Pharmacol Sci. 2013 Jul; 34(7): 393–400.

27. Interactions protéiques : les approches
Transfert d’énergie
. FRET
. BRET
Complémentation fonctionnelle
. Luciférase
. Protéine fluorescente

28. FRET : Fluorescence Resonnance Energy Transfer
CFP : Cyan Fluorescent Protein
YFP : Yellow Fluorescent Protein
No FRET FRET
Interaction protéique
< 10 nm
Pas d’interaction protéique
> 10 nm

29. BRET : Bioluminescence Resonance Energy Transfer
Substrat :
Ex : Coelenterazine
RLuc

30. PCA : Protein complementation Assay
Fluorescent and Bioluminescent Protein-Fragment Complementation Assays in the
Study of G Protein-Coupled Receptor Oligomerization and Signaling
Pierre-Alexandre Vidi and Val J. Watts; Molecular Pharmacology April 2009, 75 (4) 733-739;
Luciférase
Protéine
Fluorescente

31. BiFc : Bimolecular Fluorescence complementation
GFP 157-158 485/500 Ghosh et al., 2000
YFP, Citrine,
Venus
154-155;
172-173 515/528
Hu et al., 2002; Shyu et
al., 2006
CFP,
Cerulean
154-155;
172-173 452/478
Hu et al., 2002; Shyu et
al., 2006
Venus/Cerul
ean
154-155;
172-173 504/513
Hu and Kerppola,
2003; Shyu et al., 2006
mRFP1-
Q66T
154-155;
168-169 549/570 Jach et al., 2006
mCherry 159-160 587/610 Fan et al., 2008

32. BiFc : dimérisation de récepteurs
 Etude de GPCR : capacité à former des
homo ou hétérodimères
 Dimérisation de récepteurs Adénosine
 Complémentation YFP
 Etude live-cell

33. BiLc : Bimolecular luminescence complementation
RLuc 110-111 Ch/485 Stefan et al., 2007
GLuc 93-94 Ch/480
Remy and
Michnick, 2006

34. Interaction Récepteur ligand
Leigh A Stoddart et al. (2015) Application of BRET to monitor ligand binding to GPCRs. Nature Methods 12, 661-3.
 Récepteur β2 adrénergique β2AR tagué avec une
nanoLuciférase (Nluc)
 Ligand CA200645 (antagoniste) – fluorophore (BODIPY)
 DPCPX : Antagoniste non marqué
NLucCA200645
- BODIPY

35. Etude de voies de signalisation : BRET
Bioluminescent tools for the analysis of G-protein-coupled receptor and arrestin interactions
Mitsuru Hattoria and Takeaki Ozawa*a
RSC Adv., 2015,5, 12655-12663

36. Suivi des changements conformationnels
Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jan 6; 112(1): 148–153..
Closed conformation
Autoinhibition
Open conformation
Conformation active (activité GEF)  Rabin 8 (activité GEF) régule Rab8 impliqué
dans le traffic intracellulaire
 BRET :
Luciférase : NanoLuc
Fluorophore couplé à un tag : HaloTag
 Le passage à la conformation active (Open)
est dépendante de la phosphorylation
Kinase ERK2 active
Constituvely Active (CA)
Kinase ERK2 inactive
Kinase Dead (KD)

37. Combinaison des approches pour l’étude d’oligomères
Combinaisons
 BiLc : Dimère 1
 BiFc : Dimère 2
 BRET : Tétramère

38. Suivi en temps réel

39. Suivi en temps réel : de la molécule à la cellule
FRET sur molécules uniques
Single-molecule FRET
Complémentation luciférase

40. FRET sur molécule unique : ATPase
ATP synthase :
. Domaine F1 statique
. Domaine F0 membranaire : Rotation
 Détection d’une molécule
 Accès à une dynamique sur une
très courte échelle de temps (ms)
 Détecteur ultrasensibles de
photon
 Excitation concentrée sur de petits
volumes

41. FRET sur molécule unique
Marquages :
. ʏ (rotation) : TMR
. b (statique) : Cy5

42. Luciférase pour le suivi en temps réel
Luciférase
 Luciférase de petite taille 19 kDa
 Très brillante > Rluc > Fluc
 Utilisable en complémentation réversible :
Clivable en deux fragments : 11aa/156aa
 Temps de ½ vie : > 2 h

43. Application à l’étude d’une voie de signalisation
ATP
Agonist
(ISO)
LgBiTSmBiT
CA R2A R2A
R2A
AMPc
Récepteur β adrénergique
(ADBR2)
Inactive
PKA CA R2A
Active
PKA
Reversible if
[cAMP]↓
Biosenseur pour le
suivi de l’AMPc
Complémentation luciférase
pour le suivi de la PKA
Antagonist
(PRO)
Activateur Adenylate
Cyclase (FSK)
. Isoproterenol (ISO): ADRB2 agonist (cAMP ↑)
. Propranolol (PRO): ADRB2 antagonist (cAMP ↓)
. Forskolin (FSK): activator of adenylate cyclase (cAMP ↑)
Ligand domain : Site de laison à l’AMPc
Sensor domain
Domaines N et C Ter de la firefly
luciférase
Biosenseur :
La liaison de l’AMPc induit un changement
coformationnel, l’activation de la luciférase
et l’émission d’un signal Luminescent

44. Suivi dynamique : associations/dissociations PKA
0 2 0 4 0 6 0
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
0 .1
1
1 0
1 0 0
1 0 0 0
T im e (m in )
NanoBiT
(%signaldecrease)
GloSensorcAMP22F
(foldsignalincrease)
N a n o B iT
IS O P R O F S K
G lo S e n s o r c A M P 2 2 F
↓[cAMP] ↑[cAMP]↑[cAMP]
NBiT
GS
ATP
Agoniste (ISO)
ou Antagoniste (PRO)
LgBiTSmBiT
CA R2A R2A
R2A
cAMPInactive
PKA
CA R2A
Active
PKA
Activateur Adenylate
Cyclase (FSK)
NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein
Interactions in Cells. Andrew S. Dixon et al. ACS Chem. Biol., 2016, 11 (2), pp 400–408
Complémentation luciférase
AMPc : Biosenseur
. Isoproterenol (ISO): ADRB2 agonist (cAMP ↑)
. Propranolol (PRO): ADRB2 antagonist (cAMP ↓)
. Forskolin (FSK): activator of adenylate cyclase (cAMP ↑)

45. Conclusion

46. Les apports de l’exploration dynamique des protéines
 Pas une mais plusieurs dynamiques :
. Vibration, changement de conformation, translocation,
interactions protéiques …
 Les technologies développées permettent aujourd’hui
d’apprécier non plus seulement la fonction d’une
protéine mais sa dynamique propre et au sein de la
cellule et d’un organisme (in vivo)
Luminescent
proteins

47. Des application concrètes
Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein–protein interaction challenge
Duncan E. Scott, Andrew R. Bayly,Chris Abell & John Skidmore
Nature Reviews Drug Discovery Volume:15,Pages:533–550 (2016)

48. Venez nous rencontrer