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La métagénomique : principe
et applications en biologie
Patricia Luis
Université Lyon 1 - UMR CNRS 5557 / USC 1364 Ecologie Microbienne
Equipe «Adaptation des Microorganismes Eucaryotes à leur Environnement»
Lycée Saint Just 3 février 2015
Diversité des
écosystèmes
La biodiversité = la diversité des organismes vivants dans un biotope et
des fonctions qu’ils exercent
Diversité des gènes
et des fonctions
(Diversité génétique et fonctionnelle)
Fixation du CO2
(gènes rbcL codant la RuBisCO)
Fixation du N2
(gènes nif codant nitrogénase)
Dégradation de la MO
(gènes gh codant des Glycosides
Hydrolases)
Fonctions clefs:
Diversité des espèces
(Diversité taxonomique)
Elle s'apprécie en considérant :
Destruction et
modification des
habitats
Prélèvement et
surexploitation des
ressources
Introduction d’espèces
exotiques invasives
Réchauffement
climatique
Depuis toujours, l'Homme modifie l'environnement à son profit
L'impact de ces activités humaines est tel qu'il préfigure d’une modification
(baisse ?) de la biodiversité et des dysfonctionnements des écosystèmes
§  Compte tenu de son extrême complexité, il n'existe aucune mesure
universelle de la biodiversité
§  Mesurer l'ensemble de la biodiversité d'un biotope donné est une
tâche quasiment irréalisable
§  La «diversité taxonomique» estimée par la «richesse spécifique» (=
nbre d'espèces présentes) est l'unité de mesure la plus couramment
utilisée à tel point que l'on résume souvent la biodiversité à ce simple
facteur
«facilement réalisable» grâce aux inventaires faunistiques et floristiques
Etude de la diversité animale et végétale (« macro-organismes »)
Etude de la diversité microbienne « non visible » plus difficile
Microorganismes répartis dans les 3 grands domaines du vivant
•  Bactéries
•  Eucaryotes
≈ 10 millions et 1 milliards d’espèces
(Schloss & Handelsman 2004) 10-20 000 décrites
§  Diversité taxonomique la plus complexe et la plus vaste
≈ 1,3 million espèces animales décrites (dont 950 000 d’insectes)
- Champignons
≈ 0,8 à 5 millions d’espèces
(Tedersoo et al. 2014) 100 000 décrites
•  Archées
Aucune estimation du nombre d’espèces mais elles représenteraient
≈ 20% de la biomasse microbienne océanique (DeLong et Pace, 2001)
- Algues unicellulaires
≈ 0,2 à 1 million d’espèces
(Guiry et al. 2012) 30 000 décrites
Procaryotes
Pas de corrélation entre la latitude et la diversité microbienne
Diversité
des espèces
animales &
végétales
Etude de la diversité microbienne « non visible » plus difficile
§  Diversité taxonomique la plus complexe et la plus vaste
Cette diversité est variable selon les écosystèmes mais
les microorganismes sont abondamment présents partout
Dans 1 g de sol :
Bactéries: 2000 à 8,6 millions d’espèces (Roesch et al. 2007)
Champignons: 200-235 espèces (Bardgett & van der Putten 2014)
ü Fonctions indispensables au fonctionnement des écosystèmes
§  Diversité de fonctions tout aussi vaste
Cycles bio-géochimiques : (1) le cycle de l’azote
Archées
§  Diversité de fonctions tout aussi vaste
Cycles bio-géochimiques : (1) le cycle du carbone
ü Fonctions indispensables au fonctionnement des écosystèmes
ü Fonctions (production de substances naturelles ou d’enzymes)
ayant des applications biotechnologiques
§  Diversité de fonctions tout aussi vaste
Industries pharmaceutiques
Production d’antibiotiques
Industries du papier
Blanchissement du papier grâce
à des ligninases fongiques
Biocarburants 2de génération:
Bioéthanol à partir de déchets verts
Utilisation de ligninases et cellulases
fongiques
Eliminer lignine
Cellulose è glucose
Industries pétrolières
Biocarburants 1ère génération:
Bioéthanol à partir de l’amidon
Utilisation d’amylases microbiennes
(amidon è glucose avant fermentation)
Alimentation humaine et animale
Traitement des fourrages par
phytases (phosphatases) afin de
libérer du phosphate inorganique
Utilisation de cellulases/pectinases
permet de clarifier certains les jus de
fruits
Lipases utilisées dans la production
de beurres tartinables
§  Etude de la biodiversité microbienne par approches culturales
Pb: 0,1 à 1% des microorganismes sont cultivables
Isolement Identification taxonomique
Extraction d’ADN
Amplification / séquençage
de régions génétiques
« marqueurs taxonomiques »
16 S
Caractérisation
phénotypage
§  Etude de la biodiversité microbienne par les approches « Omics »
La métagénomique = procédé méthodologique qui vise à étudier le
contenu génétique (ADN) d'un échantillon issu d'un environnement
complexe (océan, sols, intestin …)
L’extraction et la purification d’ADN effectuée directement à partir des
échantillons environnementaux donne accès au génome de tous les
microorganismes
Identification taxonomique
Caractérisation des fonctions
Exploitation
des microorganismes non cultivables
Echantillons
environnementaux
ADN
environnementaux
ADN fragmenté
Fragmentation
physique
enzymatique
Analyse globale
Extraction
Amplification
PCR
Insertion dans un
vecteur d’expression
Ligation
d’adapteurs
Séquençage
haut débit
Transformation
cellule hôte
(crible fonctionnel)
Marqueurs
taxonomiques
(16S, ITS, 18S)
Gènes
de fonction
Séquençage
haut débit
Assemblage
Assemblage
Analyse de la biodiversité
Analyse ciblée
Echantillons
environnementaux
ADN
environnementaux
ADN fragmenté
Fragmentation
physique
enzymatique
Analyse globale
Extraction
Amplification
PCR
Insertion dans un
vecteur d’expression
Ligation
d’adapteurs
Séquençage
haut débit
Gènes
de fonction
Séquençage
haut débit
Assemblage
Assemblage
Analyse de la biodiversité
Analyse ciblée
Transformation
cellule hôte
(crible fonctionnel)
Marqueurs
taxonomiques
(16S, ITS, 18S)
§  L’échantillonnage
ü Les microorganismes sont répartis de façon très hétérogène
variants, we used degenerate
omycetes, which amplify a rel-
on. Until now, only the am-
r binding sites Cu1 and Cu2
a wide range of basidiomy-
from fungal culture and soil
present work confirmed the
plified region as the detected
similarity (see final alignment
ral molecular markers in the
ing proteins provide informa-
als of the detected fungi. How-
t available for laccase genes is
and most single fungal species
ded by different gene families
ns, we could not relate about
quences to any basidiomycete
es were, however, attributable
(family or genus) as they clus-
y-specific clades (Fig. S1). The
ification via their laccase se-
ly regress because of the rapid
ne database [41]. As each am-
cies specific [32], its detection
ne species. Our approach was
e diversity and spatial distri-
ccase genes in the investigated
ns about the extension of cor-
.
ents amplified, only 432 could
ed to basidiomycete laccases
flecting a diversity structure characterized by a few genes
with wide occurrence and many genes occurring rarely
and unlikely to be recorded in several soil cores. This
high gene diversity level can be related to the high di-
versity of fungi in soils [29, 49] of which a considerable
proportion present laccase activities [19, 24] and also to
the multigenic structure of laccase genes [33, 34, 51].
Up to 74% of the 167 different laccase sequences
occurred in only one horizon of the soil profile (Table 1).
This supports earlier observations of a specialized
distribution of fungi among soil horizons [13, 28]. The
Figure 3. Dissimilarity in the diversity profiles of basidiomycete
laccase genes (Sørensen distance) between soil cores taken at
increasing distances in a mixed oak-beech forest in Steinkreuz
(Bavaria, Germany). The values represent averages of the Bray–
Curtis coefficients calculated with the program PC Ord [40] for
cores separated by the same spatial distance. The curve equation is
y = 0.0704ln(x) + 0.455 with a correlation coefficient of R2
= 0.73.
Bars represent standard deviations.
La composition en espèces fongiques au sein d’échantillons de sol prélevés le long
d’un transect (30 cm à 1000 cm) diffère de 67 à 94% (Luis et al. 2005)
Approche NGS : 73% and 80%
(Orgiazzi et al. 2013)
Concernant les populations bactériennes, cette hétérogénéité
se fait à l’échelle du mm (Ranjard et al. 2003)
ü Les microorganismes sont soumis à des phénomènes
de successions
Modification de la composition des communautés microbiennes
en fonction de l ’évolution des propriétés chimiques de la litière
en décomposition (Voříšková & Baldrian 2013)
8
-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
PC 1: 20.70%
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
Mycosphaerella
Naevala
Troposporella
Trichosporon
Athelia
Cryptococcus
Sistotrema
Guignardia
Helminthosporium
Aureobasidium
Clavariopsis
Allantophomopsis
Dimelaena
Rhodocollybia
Davidiella
Cladosporium
Sympodiella
Ambispora
Ramariopsis
Hymenoscyphus
Holwaya Raffaelea
Polydesmia
Polyscytalum
Pseudeurotium
Devriesia
Gigaspora
Tirmania
Melanotaenium
Mrakia
Cylindrosympodium
Rhodotorula
Mortierella
Phlogicylindrium
Articulospora
Helicoma
Calycina
Bensingtonia Venturia
Epicoccum
Sporobolomyces
Pyrenochaeta
Trichoderma
Teratosphaeria
Tremella
Trechispora
Bullera
Scutellospora
Varicosporium
Candelariella
Devriesia*
Allantophomopsis*
-2 0 2 4 812 24
Relative abundance
0 0.1 1 10 100 %
8
8
12
1212
000
24
24
24
-2-2
-2
4
4
4
2 2
2
Mycosphaerella*
Holwaya*
Cladosporium*
Aureobasidium*
Davidiella*
Mrakia
Athelia*
Naevala*
Cryptococcus*
Rhodotorula*
Clavariopsis
Polyscytalum
Pseudeurotium*
Sympodiella*
Cylindrosympodium*
Guignardia*
Ramariopsis*
Hymenoscyphus*
Troposporella*
Melanotaenium*
Mortierella*
Sistotrema
Rhodocollybia
Dimelaena
Polydesmia*
Gigaspora*
Trichosporon*
Helminthosporium*
Ambispora*
Raffaelea*
Tirmania*
PC2:14.85%
Figure 2 (a) Principal component analysis of the relative abundance of the 50 most abundant fungal genera in Q. petraea live leaves
leaves at different stages of decomposition. Ascomycota—red, Basidiomycota—blue, Glomeromycota—yellow, Mucoromycotina—gre
Fungal succession on litter
J Vorˇı´sˇkova´ and P Baldrian
§  L’échantillonnage
ü La méthode d’échantillonnage est une étape cruciale
L’ADN extrait doit être représentatif des microorganismes présents dans
l’échantillon et dans l’écosystèmeInfluence of soil sample size on microbial community analysis 1115
RISA (B) variability performed by PCA of profiles obtained from the different sample sizes (from
epresent 90% confidence limits. Arrows indicate the plots outside the statistical ellipse.
L’ADN doit être extrait à partir
de plusieurs échantillons (4
échantillons/m2) de sol ≥1g
Nbre d’échantillons à adapter
selon le niveau de biodiversité
L’échantillonnage doit être
préférentiellement effectué à
plusieurs périodes de l’année
Echantillons
environnementaux
ADN
environnementaux
ADN fragmenté
Fragmentation
physique
enzymatique
Analyse globale
Extraction
Amplification
PCR
Insertion dans un
vecteur d’expression
Ligation
d’adapteurs
Séquençage
haut débit
Transformation
cellule hôte
(crible fonctionnel)
Gènes
de fonction
Séquençage
haut débit
Assemblage
Assemblage
Analyse de la biodiversité
Analyse ciblée
Marqueurs
taxonomiques
(16S, ITS, 18S)
Echantillons
environnementaux
ADN
environnementaux
ADN fragmenté
Fragmentation
physique
enzymatique
Analyse globale
Extraction
Amplification
PCR
Insertion dans un
vecteur d’expression
Ligation
d’adapteurs
Séquençage
haut débit
Gènes
de fonction
Séquençage
haut débit
Assemblage
Assemblage
Analyse de la biodiversité
Analyse ciblée
Transformation
cellule hôte
(crible fonctionnel)
Marqueurs
taxonomiques
(16S, ITS, 18S)
§  Extraction de l’ADN
ü Cette extraction réalisée directement à partir d’échantillons
environnementaux nécessite un protocole adapté selon leur nature (eau,
sol, …)
ü Plusieurs méthodes robustes sont actuellement disponibles dont certains
kit commerciaux
ü Il n’existe pas de protocole universel
(1) broyage des agrégats et lyse des cellules
Billes (106 micron à 2 mm) agitées à 2000 rpm
Tampon de lyse contenant du SDS (dénaturation de membrane)
(2) éliminer les substances inhibitrices (acides humiques)
Charbon actif, polyvinylpyrrolidone, Teepol, guanidine thiocyanate
(3) éliminer les ARN
Traitement RNAse
Utilisation de particules de silice fixant spécifiquement l’ADN
Echantillons
environnementaux
ADN
environnementaux
ADN fragmenté
Fragmentation
physique
enzymatique
Analyse globale
Extraction
Amplification
PCR
Insertion dans un
vecteur d’expression
Ligation
d’adapteurs
Séquençage
haut débit
Transformation
cellule hôte
(crible fonctionnel)
Gènes
de fonction
Séquençage
haut débit
Assemblage
Assemblage
Analyse de la biodiversité
Analyse ciblée
Marqueurs
taxonomiques
(16S, ITS, 18S)
Echantillons
environnementaux
ADN
environnementaux
ADN fragmenté
Fragmentation
physique
enzymatique
Analyse globale
Extraction
Amplification
PCR
Insertion dans un
vecteur d’expression
Ligation
d’adapteurs
Séquençage
haut débit
Gènes
de fonction
Séquençage
haut débit
Assemblage
Assemblage
Analyse de la biodiversité
Analyse ciblée
Transformation
cellule hôte
(crible fonctionnel)
Marqueurs
taxonomiques
(16S, ITS, 18S)
ü Technologie Illumina Miseq
§  Séquençage haut-débit des ADN fragmentés
44-50 millions de lectures paired-end en 55H
Avantages : - séquençage de tous les génomes contenant des informations
taxonomiques et fonctionnelles
- évite des biais liés à la PCR et au clonage (préférence pour
certains fragments)
Limites : L’assemblage des petits fragments et la reconstitution de tous les
génomes est impossible
Echantillons
environnementaux
ADN
environnementaux
ADN fragmenté
Fragmentation
physique
enzymatique
Analyse globale
Extraction
Amplification
PCR
Insertion dans un
vecteur d’expression
Ligation
d’adapteurs
Séquençage
haut débit
Transformation
cellule hôte
(crible fonctionnel)
Gènes
de fonction
Séquençage
haut débit
Assemblage
Assemblage
Analyse de la biodiversité
Analyse ciblée
Marqueurs
taxonomiques
(16S, ITS, 18S)
§  Séquençage haut-débit de fragments PCR
ü Régions avec de l’information taxonomique = marqueurs taxonomiques
Zone variables
Zones conservées
Avantages : - pas besoin d’assemblage car les fragments PCR ont une taille
adaptée à la méthode de séquençage
- permet de caractériser « rapidement » la diversité taxonomique
de microorganismes au sein d’échantillons environnementaux
- analyser l’effet de perturbations sur la biodiversité
ü Gènes de fonction afin de suivre la diversité de groupes fonctionnels
(gène nif = bactéries fixatrices d’N2; gènes GH = champignons dégradant
la MO …)
Limites : - les amorces même «universelles » sont déterminées à partir des
séquences disponibles disponible
- Biais PCR (amplification préférentielle, chimères)
§  Caractérisation de la biodiversité taxonomique
ü Caractérisation du microbiote du moustique tigre (Minard et al. 2014)
Dominance du genre Wolbachia chez tous
les individus femelles (incompatibilité
somatique)
Hétérogénéité du microbiote entre
individus
ü Influence de l’essence forestière sur la diversité fongique (Buée et al. 2009)
Les communautés fongiques sont
différentes selon l’essence forestière
(- 40% d’espèces communes)
Taille de l’écosystème
§  Caractérisation de la biodiversité de groupes fonctionnels
ü Effet de la gestion des terres sur certains groupes fonctionnels
responsable du cycle de l’azote (Xie et al. 2014)
Effet du pâturage sur les archées (AOA) et bactéries (AOB) nitrifiantes
(NH4 èNO2) et sur les bactéries (nirS et nirK) dénitrifiantes (NO2èN2)
Archées
differences (P ¼ 0.023) being only observed between the contin-
uous grazing (CG) and control (NG) treatments (Table 1). Soil pH
was around 5.2e5.4, and no significant difference was found across
the three treatments (P ¼ 0.123). NO3
-
-N concentration was higher
in CG than in seasonal grazing (SG) treatments (P ¼ 0.013) and NG
(P ¼ 0.019) (Table 1). No significant effects of grazing treatments
were observed on soil moisture, total phosphorus (P), available P,
total N and NHþ
4 eN (P ¼ 0.44, 0.90, 0.54, 0.69 and 0.65, respec-
tively; see Table 1). Though, a marginally significant relationship
was observed between soil moisture and the grazing intensity in-
dex (P ¼ 0.098).
3.2. Changes in the abundances of AOA, AOB, and nirK- and nirS-
harboring denitrifiers
The abundance of AOA (2.1e7.9 Â 107
copies gÀ1
soil) was higher
than that of AOB (7.7 Â 105
e3.2 Â 107
copies gÀ1
soil) in all treat-
ments (Fig. 1). Both the abundances of AOA and AOB increased with
grazing intensity, and the highest abundances of both groups
occurred in CG plots, which significantly differed to those in the SG
plots (P ¼ 0.003 and 0.019 for AOA and AOB, respectively) and NG
plots (P < 0.001 and P ¼ 0.011, respectively). In response to grazing,
the amplitude of the increase in AOA abundance with grazing was
low, abundances being 1.6- and 3.7-fold higher in SG and CG as
compared with NG, respectively. In contrast, the amplitude of the
increase in AOB abundance was higher, abundances being 3.8- and
41.9-fold higher in SG and CG as compared with NG, respectively. As
a result, the percentage of AOB relative to total nitrifiers increased
with grazing, ranging from 3.1% under NG to 10.8% under CG.
The average abundances of nirK- and nirS-harboring denitrifiers
were 2.1e5.8 Â 105
gÀ1
soil and 3.9e9.7 Â 107
gÀ1
soil, respectively.
The abundance of nirK-like denitrifiers increased significantly
(P ¼ 0.005) in response to grazing, while the abundance of nirS-like
denitrifiers tended to decrease (P ¼ 0.094) (Fig. 1). As a result, the
percentage of nirK-like relative to total nitrite reducers increased
with grazing, ranging from 0.2% under NG to 1.5% under CG.
The abundances of AOA, AOB and nirK were positively correlated
to soil NOÀ
3 concentration (R2
¼ 0.61, P ¼ 0.014; R2
¼ 0.67, P ¼ 0.007;
R2
¼ 0.46, P ¼ 0.046, respectively), while that of nirS was negatively
related to soil NO3
-
concentration (R2
¼ 0.56, P ¼ 0.02) (Table 2). Soil
total C was positively correlated to the abundance of nirS, and
negatively correlated to that of AOB and nirK, while no relationship
was found for AOA abundance (Table 2). In addition, the abundance
of nirS was positively correlated to soil moisture (R2
¼ 0.72,
P ¼ 0.004) and negatively correlated to total P (R2
¼ 0.41, P ¼ 0.066)
and available P (R2
¼ 0.74, P ¼ 0.003) (Table 2).
3.3. Changes in the overall community compositions of AOA, AOB,
and nirK- and nirS-harboring denitrifiers
The overall community compositions, in term of frequency of
major populations detected by the cloning-sequencing approach, of
respectively). Changes in the AOA community composition were
correlated to changes in C/N (R2
¼ 0.67, P ¼ 0.032) (Fig. 2a), whereas
changes in the overall AOB community composition were not
correlated to any of the soil environmental factors studied (Fig. 2b).
The overall community compositions of nirK- and nirS-
harboring denitrifiers were also significantly related to the grazing
intensity index (R2
¼ 0.76, P ¼ 0.011 and R2
¼ 0.74, P ¼ 0.021,
respectively) and were correlated to different environmental fac-
tors. The nirK community composition significantly correlated to
soil total C and NO3
-
concentrations (R2
¼ 0.74, P ¼ 0.014 and
R2
¼ 0.70, P ¼ 0.027, respectively) (Fig. 2c). In contrast, the com-
munity composition of nirS-type denitrifiers was significantly but
less strongly related to soil C/N ratio (R2
¼ 0.51, P ¼ 0.021) (Fig. 2d).
CG 5.43 ± 0.04 0.93 ± 0.04 1.16 ± 0.036 7.13 ± 0.68b 1.72 ± 1.22 9.49 ± 3.78 25.53 ± 1.85 12.81 ± 0.89b 0.42 ± 0.03 237.27 ± 8.84b
Abbreviations: TP, AP, TC, TN, NH4
þ
-N and NO3
-
-N refer to soil total phosphorus, available phosphorus, total carbon, total nitrogen, ammonium and nitrate concentrations,
respectively, and C/N refers to soil carbon-to-nitrogen ratio.
Fig. 1. Abundance of (Top) amoA sequences from AOA and AOB, and (Bottom) nirK and
NG: Sans pâturage
SG: Pâturage saisonnier
CG: Pâturage continu
Le pâturage (- de C dans le sol) favorise
l’abondance des archées et bactéries
nitrifiantes ainsi que les bactéries
dénitrifiantes nirK
Par contre, il réduit l’abondance des
bactéries dénitrifiantes nirS
Echantillons
environnementaux
ADN
environnementaux
ADN fragmenté
Fragmentation
physique
enzymatique
Analyse globale
Extraction
Amplification
PCR
Insertion dans un
vecteur d’expression
Ligation
d’adapteurs
Séquençage
haut débit
Transformation
cellule hôte
(crible fonctionnel)
Régions
« taxonomiques »
(16S, ITS, 18S)
Gènes
de fonction
Séquençage
haut débit
Assemblage
Assemblage
Analyse de la biodiversité
Analyse ciblée
Echantillons
environnementaux
ADN
environnementaux
ADN fragmenté
Fragmentation
physique
enzymatique
Analyse globale
Extraction
Amplification
PCR
Insertion dans un
vecteur d’expression
Ligation
d’adapteurs
Séquençage
haut débit
Régions
« taxonomiques »
(16S, ITS, 18S)
Gènes
de fonction
Séquençage
haut débit
Assemblage
Assemblage
Analyse de la biodiversité
Analyse ciblée
Transformation
cellule hôte
(crible fonctionnel)
§  Construction de banques métagénomiques et criblage fonctionnel
ü Clonage de fragments d’ADN générés par digestion enzymatique
(orientation) dans des vecteurs d’expression (plasmides inserts 2-9 Kb
ou cosmides inserts 20-40kb)
ü Transformation de différents hôtes bactériens (Escherichia coli,
Streptomyces coelicolor, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescence)
ü Crible fonctionnel (protéases, amylases, antibiotiques,…)
a Detection of carbonyl formation
b Detection of protease activity
Polyol Carbonyl
Positive clones
Positive clones
Indicator agar Schiff base
Carbonyl-forming phenotype
Proteolytic phenotype
Agar containing
skimmed milk
Proteolysis
C N R
Figure 2 | Examples of activity-based screens. a | Detection of clones harbouring genes
that confer carbonyl formation. Screening is based on the ability of the library-containing
Escherichia coli clones to form carbonyls from test substrates, that is, polyols43,85
, during
growth on indicator agar. The test substrates are included in the indicator agar, which contains
a mixture of pararosaniline and sodium bisulphite (Schiff reagent). The production of carbonyls
from test substrates on indicator plates by clones results in formation of a dark red Schiff base.
The carbonyl-forming colonies are red and are surrounded by a red zone, whereas colonies
failing to form carbonyls from the test substrate remain uncoloured. b | Detection of proteolytic
when samples fr
used as starting m
steps are carried
laboratory enrich
quality DNA, wh
tion of high-qua
successfully used
gene products, i
coenzyme B12
-de
agarases87
and g
Other potential m
genomes from m
soil microbial co
tion are stable iso
by M. G. Dumon
and enrichment
ence of selective
not been used in
date. To improve
a library, normal
soil DNA based
for enrichment40
R E V I E W S
Les séquences codant les enzymes et autres substances naturelles
isolées grâce à cette approche ont souvent peu d’homologie avec les
gènes connus
-  Bactéries marines capables de phototrophie grâce à la présence de
protéorhodopsine (insert de 130 kb contenant ADNr de gamma-
protéobactérie + ORF)
-  Découverte des archées nitrifiantes (NH4 èNO2)
ü De nouvelles fonctions ont ainsi pu être mises en évidence :
letter amino acid
codes are used (33),
and the numbering
is as in bacteriorho-
dopsin. Predicted
retinal binding pock-
et residues are
marked in red.
Fig. 3. (A) Proteorhodopsin-expressing E. coli cell suspension (ϩ) com
both with all-trans retinal. (B) Absorption spectra of retinal-reconstitute
membranes (17). A time series of spectra is shown for reconstituted p
(red) and a negative control (black). Time points for spectra after retina
low to high absorbance values, are 10, 20, 30, and 40 min.
Fig. 4. (A) Light-drive
proteorhodopsin-expr
The beginning and ce
yellow light Ͼ485 nm) is indicated by arrows labeled ON and OFF,
suspended in 10 mM NaCl, 10 mM MgSO4⅐7H2O, and 100 ␮M CaCl2. (
tetraphenylphosphonium ([3
Hϩ
]TPP) in E. coli right-side-out vesicles cont
dopsin, reconstituted with (squares) or without (circles) 10 ␮M retinal in
symbols) or in the dark (solid symbols) (20).
Limites : peu de gènes d’origine eucaryotes (présence
d’introns) seront isolés par une telle approche de
métagénomique
§  Construction de banques métatranscriptomiques et criblage fonctionnel
La métatranscriptomique = procédé méthodologique qui vise à
étudier les gènes exprimés (ARNm) d'un échantillon issu d'un
environnement complexe (océan, sols, intestin …)
ARNm
polyadénylés
ADNc Clonage dans vecteur
expression
Transformation
Levures
Damon et al. 2011
FUNGI!MOLLUSCS!
1
0.99
0.92
Env-GH45/AAA18YO03FL
1
Aspergillus nidulans
Grosmannia clavigera
Penicillium marneffei 2
Talaromyces stipitatus 2
Talaromyces stipitatus 1
Neosartorya fischeri
Aspergillus fumigatus
1
0.93
Penicillium decumbens
Hypocrea jecorina
Trichoderma viride
Trichoderma atroviride
Penicillium marneffei 1
Cryphonectria parasitica 2
0.81
Cryphonectria parasitica 1
0.91
0.99
0.99
0.1
“Environmental”!
sequence!
Ampullaria crossean
Ampullaria crossean
Biomphalaria glabrata
1
Biomphalaria glabrata 1
Lymnaea stagnalis
Haliotis discus
Mytilus edulis
Corbicula japonica 2
Corbicula japonica 1
Lottia gigantea 2
Lottia gigantea 1
GH45 catalytic domain!
Signal peptide!
Cellulose binding domain CBM1!
Cellulose binding domain CBM2!
ü Plusieurs nouvelles enzymes eucaryotes avec un intérêt biotechnologique
ont ainsi pu être isolées de sol forestier:
-  Une cellulase
-  Une phytase, des xylanases, des transporteurs de dipeptides
(complémentation de mutants)
!
§  Capture d’ADNc (sondes 60 pb)
!
!
Crible sur AZCL-xylane
(Bragalini et al 2014)
§  La métagénomique laisse place à la métatranscriptomique
ü Métagénomique = contenu génétique = fonctions potentielles
ü Métatranscriptomique = fonctions réellement exprimées
La durée de vie d’un ADN dans le sol hors de la cellule peut être ±
longue (jusqu’à plusieurs années)
from this
Phenylobac
aerobic soil
degradation
Fungal c
selected seq
220 OTUs
the DNA a
predicted h
LR and H
component
significant
among LD,
ences amon
In the D
was domin
(OTU2) and
dominant a
horizon, ea
ent OTU
asterophora
and Pilode
similarity t
the most a
sequences),
Cenococcum
phorus (2.9
(1.8%), Cad
Verrucaria
distribution
and H horiz
shows a str
the L or th
Table 3). S
highly enri
mentary Ta
Fungal s
(53.5% Ba
Glomeromy
sequences,
diomycota
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
unassigned
Basidiomycota
Ascomycota
AscomycotaBasidiomycota
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
L-DNA L-RNA H-DNA H-RNA
others and unclassified
Verrucomicrobia
Proteobacteria
Chlamydiae
Gemmatimonadetes
Firmicutes
Bacteroidetes
Actinobacteria
Acidobacteria
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
L-DNA L-RNA H-DNA H-RNA
other fungi
Mortierellales
Diversisporales
Archaeosporales
other Basidiomycota
Tremellales
Thelephorales
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L-DNA H-RNAH-DNAL-RNA
Figure 3 Phylogenetic assignment of bacterial, fungal and cbhI
sequences from Picea abies forest topsoil. The data represent
mean values from four study sites. (a) Bacteria, (b) fungi and
(c) cbhI sequences.
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2015 luis cours metagenomique

  • 1. La métagénomique : principe et applications en biologie Patricia Luis Université Lyon 1 - UMR CNRS 5557 / USC 1364 Ecologie Microbienne Equipe «Adaptation des Microorganismes Eucaryotes à leur Environnement» Lycée Saint Just 3 février 2015
  • 2. Diversité des écosystèmes La biodiversité = la diversité des organismes vivants dans un biotope et des fonctions qu’ils exercent Diversité des gènes et des fonctions (Diversité génétique et fonctionnelle) Fixation du CO2 (gènes rbcL codant la RuBisCO) Fixation du N2 (gènes nif codant nitrogénase) Dégradation de la MO (gènes gh codant des Glycosides Hydrolases) Fonctions clefs: Diversité des espèces (Diversité taxonomique) Elle s'apprécie en considérant :
  • 3. Destruction et modification des habitats Prélèvement et surexploitation des ressources Introduction d’espèces exotiques invasives Réchauffement climatique Depuis toujours, l'Homme modifie l'environnement à son profit L'impact de ces activités humaines est tel qu'il préfigure d’une modification (baisse ?) de la biodiversité et des dysfonctionnements des écosystèmes
  • 4. §  Compte tenu de son extrême complexité, il n'existe aucune mesure universelle de la biodiversité §  Mesurer l'ensemble de la biodiversité d'un biotope donné est une tâche quasiment irréalisable §  La «diversité taxonomique» estimée par la «richesse spécifique» (= nbre d'espèces présentes) est l'unité de mesure la plus couramment utilisée à tel point que l'on résume souvent la biodiversité à ce simple facteur «facilement réalisable» grâce aux inventaires faunistiques et floristiques Etude de la diversité animale et végétale (« macro-organismes »)
  • 5. Etude de la diversité microbienne « non visible » plus difficile Microorganismes répartis dans les 3 grands domaines du vivant •  Bactéries •  Eucaryotes ≈ 10 millions et 1 milliards d’espèces (Schloss & Handelsman 2004) 10-20 000 décrites §  Diversité taxonomique la plus complexe et la plus vaste ≈ 1,3 million espèces animales décrites (dont 950 000 d’insectes) - Champignons ≈ 0,8 à 5 millions d’espèces (Tedersoo et al. 2014) 100 000 décrites •  Archées Aucune estimation du nombre d’espèces mais elles représenteraient ≈ 20% de la biomasse microbienne océanique (DeLong et Pace, 2001) - Algues unicellulaires ≈ 0,2 à 1 million d’espèces (Guiry et al. 2012) 30 000 décrites Procaryotes
  • 6. Pas de corrélation entre la latitude et la diversité microbienne Diversité des espèces animales & végétales Etude de la diversité microbienne « non visible » plus difficile §  Diversité taxonomique la plus complexe et la plus vaste Cette diversité est variable selon les écosystèmes mais les microorganismes sont abondamment présents partout Dans 1 g de sol : Bactéries: 2000 à 8,6 millions d’espèces (Roesch et al. 2007) Champignons: 200-235 espèces (Bardgett & van der Putten 2014)
  • 7. ü Fonctions indispensables au fonctionnement des écosystèmes §  Diversité de fonctions tout aussi vaste Cycles bio-géochimiques : (1) le cycle de l’azote Archées
  • 8. §  Diversité de fonctions tout aussi vaste Cycles bio-géochimiques : (1) le cycle du carbone ü Fonctions indispensables au fonctionnement des écosystèmes
  • 9. ü Fonctions (production de substances naturelles ou d’enzymes) ayant des applications biotechnologiques §  Diversité de fonctions tout aussi vaste Industries pharmaceutiques Production d’antibiotiques Industries du papier Blanchissement du papier grâce à des ligninases fongiques Biocarburants 2de génération: Bioéthanol à partir de déchets verts Utilisation de ligninases et cellulases fongiques Eliminer lignine Cellulose è glucose Industries pétrolières Biocarburants 1ère génération: Bioéthanol à partir de l’amidon Utilisation d’amylases microbiennes (amidon è glucose avant fermentation) Alimentation humaine et animale Traitement des fourrages par phytases (phosphatases) afin de libérer du phosphate inorganique Utilisation de cellulases/pectinases permet de clarifier certains les jus de fruits Lipases utilisées dans la production de beurres tartinables
  • 10. §  Etude de la biodiversité microbienne par approches culturales Pb: 0,1 à 1% des microorganismes sont cultivables Isolement Identification taxonomique Extraction d’ADN Amplification / séquençage de régions génétiques « marqueurs taxonomiques » 16 S Caractérisation phénotypage
  • 11. §  Etude de la biodiversité microbienne par les approches « Omics » La métagénomique = procédé méthodologique qui vise à étudier le contenu génétique (ADN) d'un échantillon issu d'un environnement complexe (océan, sols, intestin …) L’extraction et la purification d’ADN effectuée directement à partir des échantillons environnementaux donne accès au génome de tous les microorganismes Identification taxonomique Caractérisation des fonctions Exploitation des microorganismes non cultivables
  • 12. Echantillons environnementaux ADN environnementaux ADN fragmenté Fragmentation physique enzymatique Analyse globale Extraction Amplification PCR Insertion dans un vecteur d’expression Ligation d’adapteurs Séquençage haut débit Transformation cellule hôte (crible fonctionnel) Marqueurs taxonomiques (16S, ITS, 18S) Gènes de fonction Séquençage haut débit Assemblage Assemblage Analyse de la biodiversité Analyse ciblée
  • 13. Echantillons environnementaux ADN environnementaux ADN fragmenté Fragmentation physique enzymatique Analyse globale Extraction Amplification PCR Insertion dans un vecteur d’expression Ligation d’adapteurs Séquençage haut débit Gènes de fonction Séquençage haut débit Assemblage Assemblage Analyse de la biodiversité Analyse ciblée Transformation cellule hôte (crible fonctionnel) Marqueurs taxonomiques (16S, ITS, 18S)
  • 14. §  L’échantillonnage ü Les microorganismes sont répartis de façon très hétérogène variants, we used degenerate omycetes, which amplify a rel- on. Until now, only the am- r binding sites Cu1 and Cu2 a wide range of basidiomy- from fungal culture and soil present work confirmed the plified region as the detected similarity (see final alignment ral molecular markers in the ing proteins provide informa- als of the detected fungi. How- t available for laccase genes is and most single fungal species ded by different gene families ns, we could not relate about quences to any basidiomycete es were, however, attributable (family or genus) as they clus- y-specific clades (Fig. S1). The ification via their laccase se- ly regress because of the rapid ne database [41]. As each am- cies specific [32], its detection ne species. Our approach was e diversity and spatial distri- ccase genes in the investigated ns about the extension of cor- . ents amplified, only 432 could ed to basidiomycete laccases flecting a diversity structure characterized by a few genes with wide occurrence and many genes occurring rarely and unlikely to be recorded in several soil cores. This high gene diversity level can be related to the high di- versity of fungi in soils [29, 49] of which a considerable proportion present laccase activities [19, 24] and also to the multigenic structure of laccase genes [33, 34, 51]. Up to 74% of the 167 different laccase sequences occurred in only one horizon of the soil profile (Table 1). This supports earlier observations of a specialized distribution of fungi among soil horizons [13, 28]. The Figure 3. Dissimilarity in the diversity profiles of basidiomycete laccase genes (Sørensen distance) between soil cores taken at increasing distances in a mixed oak-beech forest in Steinkreuz (Bavaria, Germany). The values represent averages of the Bray– Curtis coefficients calculated with the program PC Ord [40] for cores separated by the same spatial distance. The curve equation is y = 0.0704ln(x) + 0.455 with a correlation coefficient of R2 = 0.73. Bars represent standard deviations. La composition en espèces fongiques au sein d’échantillons de sol prélevés le long d’un transect (30 cm à 1000 cm) diffère de 67 à 94% (Luis et al. 2005) Approche NGS : 73% and 80% (Orgiazzi et al. 2013) Concernant les populations bactériennes, cette hétérogénéité se fait à l’échelle du mm (Ranjard et al. 2003) ü Les microorganismes sont soumis à des phénomènes de successions Modification de la composition des communautés microbiennes en fonction de l ’évolution des propriétés chimiques de la litière en décomposition (Voříšková & Baldrian 2013) 8 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 PC 1: 20.70% -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 Mycosphaerella Naevala Troposporella Trichosporon Athelia Cryptococcus Sistotrema Guignardia Helminthosporium Aureobasidium Clavariopsis Allantophomopsis Dimelaena Rhodocollybia Davidiella Cladosporium Sympodiella Ambispora Ramariopsis Hymenoscyphus Holwaya Raffaelea Polydesmia Polyscytalum Pseudeurotium Devriesia Gigaspora Tirmania Melanotaenium Mrakia Cylindrosympodium Rhodotorula Mortierella Phlogicylindrium Articulospora Helicoma Calycina Bensingtonia Venturia Epicoccum Sporobolomyces Pyrenochaeta Trichoderma Teratosphaeria Tremella Trechispora Bullera Scutellospora Varicosporium Candelariella Devriesia* Allantophomopsis* -2 0 2 4 812 24 Relative abundance 0 0.1 1 10 100 % 8 8 12 1212 000 24 24 24 -2-2 -2 4 4 4 2 2 2 Mycosphaerella* Holwaya* Cladosporium* Aureobasidium* Davidiella* Mrakia Athelia* Naevala* Cryptococcus* Rhodotorula* Clavariopsis Polyscytalum Pseudeurotium* Sympodiella* Cylindrosympodium* Guignardia* Ramariopsis* Hymenoscyphus* Troposporella* Melanotaenium* Mortierella* Sistotrema Rhodocollybia Dimelaena Polydesmia* Gigaspora* Trichosporon* Helminthosporium* Ambispora* Raffaelea* Tirmania* PC2:14.85% Figure 2 (a) Principal component analysis of the relative abundance of the 50 most abundant fungal genera in Q. petraea live leaves leaves at different stages of decomposition. Ascomycota—red, Basidiomycota—blue, Glomeromycota—yellow, Mucoromycotina—gre Fungal succession on litter J Vorˇı´sˇkova´ and P Baldrian
  • 15. §  L’échantillonnage ü La méthode d’échantillonnage est une étape cruciale L’ADN extrait doit être représentatif des microorganismes présents dans l’échantillon et dans l’écosystèmeInfluence of soil sample size on microbial community analysis 1115 RISA (B) variability performed by PCA of profiles obtained from the different sample sizes (from epresent 90% confidence limits. Arrows indicate the plots outside the statistical ellipse. L’ADN doit être extrait à partir de plusieurs échantillons (4 échantillons/m2) de sol ≥1g Nbre d’échantillons à adapter selon le niveau de biodiversité L’échantillonnage doit être préférentiellement effectué à plusieurs périodes de l’année
  • 16. Echantillons environnementaux ADN environnementaux ADN fragmenté Fragmentation physique enzymatique Analyse globale Extraction Amplification PCR Insertion dans un vecteur d’expression Ligation d’adapteurs Séquençage haut débit Transformation cellule hôte (crible fonctionnel) Gènes de fonction Séquençage haut débit Assemblage Assemblage Analyse de la biodiversité Analyse ciblée Marqueurs taxonomiques (16S, ITS, 18S)
  • 17. Echantillons environnementaux ADN environnementaux ADN fragmenté Fragmentation physique enzymatique Analyse globale Extraction Amplification PCR Insertion dans un vecteur d’expression Ligation d’adapteurs Séquençage haut débit Gènes de fonction Séquençage haut débit Assemblage Assemblage Analyse de la biodiversité Analyse ciblée Transformation cellule hôte (crible fonctionnel) Marqueurs taxonomiques (16S, ITS, 18S)
  • 18. §  Extraction de l’ADN ü Cette extraction réalisée directement à partir d’échantillons environnementaux nécessite un protocole adapté selon leur nature (eau, sol, …) ü Plusieurs méthodes robustes sont actuellement disponibles dont certains kit commerciaux ü Il n’existe pas de protocole universel (1) broyage des agrégats et lyse des cellules Billes (106 micron à 2 mm) agitées à 2000 rpm Tampon de lyse contenant du SDS (dénaturation de membrane) (2) éliminer les substances inhibitrices (acides humiques) Charbon actif, polyvinylpyrrolidone, Teepol, guanidine thiocyanate (3) éliminer les ARN Traitement RNAse Utilisation de particules de silice fixant spécifiquement l’ADN
  • 19. Echantillons environnementaux ADN environnementaux ADN fragmenté Fragmentation physique enzymatique Analyse globale Extraction Amplification PCR Insertion dans un vecteur d’expression Ligation d’adapteurs Séquençage haut débit Transformation cellule hôte (crible fonctionnel) Gènes de fonction Séquençage haut débit Assemblage Assemblage Analyse de la biodiversité Analyse ciblée Marqueurs taxonomiques (16S, ITS, 18S)
  • 20. Echantillons environnementaux ADN environnementaux ADN fragmenté Fragmentation physique enzymatique Analyse globale Extraction Amplification PCR Insertion dans un vecteur d’expression Ligation d’adapteurs Séquençage haut débit Gènes de fonction Séquençage haut débit Assemblage Assemblage Analyse de la biodiversité Analyse ciblée Transformation cellule hôte (crible fonctionnel) Marqueurs taxonomiques (16S, ITS, 18S)
  • 21. ü Technologie Illumina Miseq §  Séquençage haut-débit des ADN fragmentés 44-50 millions de lectures paired-end en 55H Avantages : - séquençage de tous les génomes contenant des informations taxonomiques et fonctionnelles - évite des biais liés à la PCR et au clonage (préférence pour certains fragments) Limites : L’assemblage des petits fragments et la reconstitution de tous les génomes est impossible
  • 22. Echantillons environnementaux ADN environnementaux ADN fragmenté Fragmentation physique enzymatique Analyse globale Extraction Amplification PCR Insertion dans un vecteur d’expression Ligation d’adapteurs Séquençage haut débit Transformation cellule hôte (crible fonctionnel) Gènes de fonction Séquençage haut débit Assemblage Assemblage Analyse de la biodiversité Analyse ciblée Marqueurs taxonomiques (16S, ITS, 18S)
  • 23. §  Séquençage haut-débit de fragments PCR ü Régions avec de l’information taxonomique = marqueurs taxonomiques Zone variables Zones conservées Avantages : - pas besoin d’assemblage car les fragments PCR ont une taille adaptée à la méthode de séquençage - permet de caractériser « rapidement » la diversité taxonomique de microorganismes au sein d’échantillons environnementaux - analyser l’effet de perturbations sur la biodiversité ü Gènes de fonction afin de suivre la diversité de groupes fonctionnels (gène nif = bactéries fixatrices d’N2; gènes GH = champignons dégradant la MO …) Limites : - les amorces même «universelles » sont déterminées à partir des séquences disponibles disponible - Biais PCR (amplification préférentielle, chimères)
  • 24. §  Caractérisation de la biodiversité taxonomique ü Caractérisation du microbiote du moustique tigre (Minard et al. 2014) Dominance du genre Wolbachia chez tous les individus femelles (incompatibilité somatique) Hétérogénéité du microbiote entre individus ü Influence de l’essence forestière sur la diversité fongique (Buée et al. 2009) Les communautés fongiques sont différentes selon l’essence forestière (- 40% d’espèces communes) Taille de l’écosystème
  • 25. §  Caractérisation de la biodiversité de groupes fonctionnels ü Effet de la gestion des terres sur certains groupes fonctionnels responsable du cycle de l’azote (Xie et al. 2014) Effet du pâturage sur les archées (AOA) et bactéries (AOB) nitrifiantes (NH4 èNO2) et sur les bactéries (nirS et nirK) dénitrifiantes (NO2èN2) Archées differences (P ¼ 0.023) being only observed between the contin- uous grazing (CG) and control (NG) treatments (Table 1). Soil pH was around 5.2e5.4, and no significant difference was found across the three treatments (P ¼ 0.123). NO3 - -N concentration was higher in CG than in seasonal grazing (SG) treatments (P ¼ 0.013) and NG (P ¼ 0.019) (Table 1). No significant effects of grazing treatments were observed on soil moisture, total phosphorus (P), available P, total N and NHþ 4 eN (P ¼ 0.44, 0.90, 0.54, 0.69 and 0.65, respec- tively; see Table 1). Though, a marginally significant relationship was observed between soil moisture and the grazing intensity in- dex (P ¼ 0.098). 3.2. Changes in the abundances of AOA, AOB, and nirK- and nirS- harboring denitrifiers The abundance of AOA (2.1e7.9 Â 107 copies gÀ1 soil) was higher than that of AOB (7.7 Â 105 e3.2 Â 107 copies gÀ1 soil) in all treat- ments (Fig. 1). Both the abundances of AOA and AOB increased with grazing intensity, and the highest abundances of both groups occurred in CG plots, which significantly differed to those in the SG plots (P ¼ 0.003 and 0.019 for AOA and AOB, respectively) and NG plots (P < 0.001 and P ¼ 0.011, respectively). In response to grazing, the amplitude of the increase in AOA abundance with grazing was low, abundances being 1.6- and 3.7-fold higher in SG and CG as compared with NG, respectively. In contrast, the amplitude of the increase in AOB abundance was higher, abundances being 3.8- and 41.9-fold higher in SG and CG as compared with NG, respectively. As a result, the percentage of AOB relative to total nitrifiers increased with grazing, ranging from 3.1% under NG to 10.8% under CG. The average abundances of nirK- and nirS-harboring denitrifiers were 2.1e5.8 Â 105 gÀ1 soil and 3.9e9.7 Â 107 gÀ1 soil, respectively. The abundance of nirK-like denitrifiers increased significantly (P ¼ 0.005) in response to grazing, while the abundance of nirS-like denitrifiers tended to decrease (P ¼ 0.094) (Fig. 1). As a result, the percentage of nirK-like relative to total nitrite reducers increased with grazing, ranging from 0.2% under NG to 1.5% under CG. The abundances of AOA, AOB and nirK were positively correlated to soil NOÀ 3 concentration (R2 ¼ 0.61, P ¼ 0.014; R2 ¼ 0.67, P ¼ 0.007; R2 ¼ 0.46, P ¼ 0.046, respectively), while that of nirS was negatively related to soil NO3 - concentration (R2 ¼ 0.56, P ¼ 0.02) (Table 2). Soil total C was positively correlated to the abundance of nirS, and negatively correlated to that of AOB and nirK, while no relationship was found for AOA abundance (Table 2). In addition, the abundance of nirS was positively correlated to soil moisture (R2 ¼ 0.72, P ¼ 0.004) and negatively correlated to total P (R2 ¼ 0.41, P ¼ 0.066) and available P (R2 ¼ 0.74, P ¼ 0.003) (Table 2). 3.3. Changes in the overall community compositions of AOA, AOB, and nirK- and nirS-harboring denitrifiers The overall community compositions, in term of frequency of major populations detected by the cloning-sequencing approach, of respectively). Changes in the AOA community composition were correlated to changes in C/N (R2 ¼ 0.67, P ¼ 0.032) (Fig. 2a), whereas changes in the overall AOB community composition were not correlated to any of the soil environmental factors studied (Fig. 2b). The overall community compositions of nirK- and nirS- harboring denitrifiers were also significantly related to the grazing intensity index (R2 ¼ 0.76, P ¼ 0.011 and R2 ¼ 0.74, P ¼ 0.021, respectively) and were correlated to different environmental fac- tors. The nirK community composition significantly correlated to soil total C and NO3 - concentrations (R2 ¼ 0.74, P ¼ 0.014 and R2 ¼ 0.70, P ¼ 0.027, respectively) (Fig. 2c). In contrast, the com- munity composition of nirS-type denitrifiers was significantly but less strongly related to soil C/N ratio (R2 ¼ 0.51, P ¼ 0.021) (Fig. 2d). CG 5.43 ± 0.04 0.93 ± 0.04 1.16 ± 0.036 7.13 ± 0.68b 1.72 ± 1.22 9.49 ± 3.78 25.53 ± 1.85 12.81 ± 0.89b 0.42 ± 0.03 237.27 ± 8.84b Abbreviations: TP, AP, TC, TN, NH4 þ -N and NO3 - -N refer to soil total phosphorus, available phosphorus, total carbon, total nitrogen, ammonium and nitrate concentrations, respectively, and C/N refers to soil carbon-to-nitrogen ratio. Fig. 1. Abundance of (Top) amoA sequences from AOA and AOB, and (Bottom) nirK and NG: Sans pâturage SG: Pâturage saisonnier CG: Pâturage continu Le pâturage (- de C dans le sol) favorise l’abondance des archées et bactéries nitrifiantes ainsi que les bactéries dénitrifiantes nirK Par contre, il réduit l’abondance des bactéries dénitrifiantes nirS
  • 26. Echantillons environnementaux ADN environnementaux ADN fragmenté Fragmentation physique enzymatique Analyse globale Extraction Amplification PCR Insertion dans un vecteur d’expression Ligation d’adapteurs Séquençage haut débit Transformation cellule hôte (crible fonctionnel) Régions « taxonomiques » (16S, ITS, 18S) Gènes de fonction Séquençage haut débit Assemblage Assemblage Analyse de la biodiversité Analyse ciblée
  • 27. Echantillons environnementaux ADN environnementaux ADN fragmenté Fragmentation physique enzymatique Analyse globale Extraction Amplification PCR Insertion dans un vecteur d’expression Ligation d’adapteurs Séquençage haut débit Régions « taxonomiques » (16S, ITS, 18S) Gènes de fonction Séquençage haut débit Assemblage Assemblage Analyse de la biodiversité Analyse ciblée Transformation cellule hôte (crible fonctionnel)
  • 28. §  Construction de banques métagénomiques et criblage fonctionnel ü Clonage de fragments d’ADN générés par digestion enzymatique (orientation) dans des vecteurs d’expression (plasmides inserts 2-9 Kb ou cosmides inserts 20-40kb) ü Transformation de différents hôtes bactériens (Escherichia coli, Streptomyces coelicolor, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescence) ü Crible fonctionnel (protéases, amylases, antibiotiques,…) a Detection of carbonyl formation b Detection of protease activity Polyol Carbonyl Positive clones Positive clones Indicator agar Schiff base Carbonyl-forming phenotype Proteolytic phenotype Agar containing skimmed milk Proteolysis C N R Figure 2 | Examples of activity-based screens. a | Detection of clones harbouring genes that confer carbonyl formation. Screening is based on the ability of the library-containing Escherichia coli clones to form carbonyls from test substrates, that is, polyols43,85 , during growth on indicator agar. The test substrates are included in the indicator agar, which contains a mixture of pararosaniline and sodium bisulphite (Schiff reagent). The production of carbonyls from test substrates on indicator plates by clones results in formation of a dark red Schiff base. The carbonyl-forming colonies are red and are surrounded by a red zone, whereas colonies failing to form carbonyls from the test substrate remain uncoloured. b | Detection of proteolytic when samples fr used as starting m steps are carried laboratory enrich quality DNA, wh tion of high-qua successfully used gene products, i coenzyme B12 -de agarases87 and g Other potential m genomes from m soil microbial co tion are stable iso by M. G. Dumon and enrichment ence of selective not been used in date. To improve a library, normal soil DNA based for enrichment40 R E V I E W S Les séquences codant les enzymes et autres substances naturelles isolées grâce à cette approche ont souvent peu d’homologie avec les gènes connus
  • 29. -  Bactéries marines capables de phototrophie grâce à la présence de protéorhodopsine (insert de 130 kb contenant ADNr de gamma- protéobactérie + ORF) -  Découverte des archées nitrifiantes (NH4 èNO2) ü De nouvelles fonctions ont ainsi pu être mises en évidence : letter amino acid codes are used (33), and the numbering is as in bacteriorho- dopsin. Predicted retinal binding pock- et residues are marked in red. Fig. 3. (A) Proteorhodopsin-expressing E. coli cell suspension (ϩ) com both with all-trans retinal. (B) Absorption spectra of retinal-reconstitute membranes (17). A time series of spectra is shown for reconstituted p (red) and a negative control (black). Time points for spectra after retina low to high absorbance values, are 10, 20, 30, and 40 min. Fig. 4. (A) Light-drive proteorhodopsin-expr The beginning and ce yellow light Ͼ485 nm) is indicated by arrows labeled ON and OFF, suspended in 10 mM NaCl, 10 mM MgSO4⅐7H2O, and 100 ␮M CaCl2. ( tetraphenylphosphonium ([3 Hϩ ]TPP) in E. coli right-side-out vesicles cont dopsin, reconstituted with (squares) or without (circles) 10 ␮M retinal in symbols) or in the dark (solid symbols) (20). Limites : peu de gènes d’origine eucaryotes (présence d’introns) seront isolés par une telle approche de métagénomique §  Construction de banques métatranscriptomiques et criblage fonctionnel La métatranscriptomique = procédé méthodologique qui vise à étudier les gènes exprimés (ARNm) d'un échantillon issu d'un environnement complexe (océan, sols, intestin …) ARNm polyadénylés ADNc Clonage dans vecteur expression Transformation Levures
  • 30. Damon et al. 2011 FUNGI!MOLLUSCS! 1 0.99 0.92 Env-GH45/AAA18YO03FL 1 Aspergillus nidulans Grosmannia clavigera Penicillium marneffei 2 Talaromyces stipitatus 2 Talaromyces stipitatus 1 Neosartorya fischeri Aspergillus fumigatus 1 0.93 Penicillium decumbens Hypocrea jecorina Trichoderma viride Trichoderma atroviride Penicillium marneffei 1 Cryphonectria parasitica 2 0.81 Cryphonectria parasitica 1 0.91 0.99 0.99 0.1 “Environmental”! sequence! Ampullaria crossean Ampullaria crossean Biomphalaria glabrata 1 Biomphalaria glabrata 1 Lymnaea stagnalis Haliotis discus Mytilus edulis Corbicula japonica 2 Corbicula japonica 1 Lottia gigantea 2 Lottia gigantea 1 GH45 catalytic domain! Signal peptide! Cellulose binding domain CBM1! Cellulose binding domain CBM2! ü Plusieurs nouvelles enzymes eucaryotes avec un intérêt biotechnologique ont ainsi pu être isolées de sol forestier: -  Une cellulase -  Une phytase, des xylanases, des transporteurs de dipeptides (complémentation de mutants)
  • 31. ! §  Capture d’ADNc (sondes 60 pb) ! ! Crible sur AZCL-xylane (Bragalini et al 2014)
  • 32. §  La métagénomique laisse place à la métatranscriptomique ü Métagénomique = contenu génétique = fonctions potentielles ü Métatranscriptomique = fonctions réellement exprimées La durée de vie d’un ADN dans le sol hors de la cellule peut être ± longue (jusqu’à plusieurs années) from this Phenylobac aerobic soil degradation Fungal c selected seq 220 OTUs the DNA a predicted h LR and H component significant among LD, ences amon In the D was domin (OTU2) and dominant a horizon, ea ent OTU asterophora and Pilode similarity t the most a sequences), Cenococcum phorus (2.9 (1.8%), Cad Verrucaria distribution and H horiz shows a str the L or th Table 3). S highly enri mentary Ta Fungal s (53.5% Ba Glomeromy sequences, diomycota 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% unassigned Basidiomycota Ascomycota AscomycotaBasidiomycota 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% L-DNA L-RNA H-DNA H-RNA others and unclassified Verrucomicrobia Proteobacteria Chlamydiae Gemmatimonadetes Firmicutes Bacteroidetes Actinobacteria Acidobacteria 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% L-DNA L-RNA H-DNA H-RNA other fungi Mortierellales Diversisporales Archaeosporales other Basidiomycota Tremellales Thelephorales Septobasidiales Russulales Cantharellales Atheliales Agaricales other Ascomycota Verrucariales Saccharomycetales Lecanorales Chaetothyriales Hypocreales Helotiales Eurotiales Capnodiales Botryosphaeriales L-DNA H-RNAH-DNAL-RNA Figure 3 Phylogenetic assignment of bacterial, fungal and cbhI sequences from Picea abies forest topsoil. The data represent mean values from four study sites. (a) Bacteria, (b) fungi and (c) cbhI sequences. Topsoil fungi and ba P Baldrian et al L’analyse des ARN totaux (ARNr et A R N m ) p e r m e t l ’ é t u d e d e s communautés réellement actives et présentes
  • 33. Merci pour votre attention