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Techniques Chromatographiques d’Analyse
Classification des méthodes chromatographiques
LA CHROMATOGRAPHIE D'ADSORPTION :   Chromatographie liquide-solide basée sur la (ré)partition des solutés entre l'adsorbant fixe et la phase liquide mobile.  ,[object Object],Répartition des molécules entre les deux phases  les molécules sont adsorbées à la surface du solide.
L'adsorption :   fixation des molécules dissoutes par la phase solide. Cette fixation est due à l'établissement de liaisons secondaires de surface entre l'adsorbant et la molécule adsorbée : liaison dipôle-ion, ou dipôle-dipôle ou liaison de Van der Waals.     Illustration de la différence entre adsorption et absorption  DEFINITION
* Les adsorbants à faible capacité d'adsorption comme l'alumine, le talc (métasilicate acide de magnésium) ou le carbonate de sodium.  * Les adsorbants forts comme le gel de silice.  Silices polaires greffées. Adsorbants  Silices apolaires greffées.
Pour un système chromatographique donné (caractérisé par une phase stationnaire, la température, la pression et le soluté), le pouvoir éluant dépend de la polarité du solvant. Solvants :
[object Object],[object Object],[object Object],La chromatographie d'adsorption est appliquée selon différentes techniques :  Technologies Remarque :   Dans la pratique, chromatographie phase inverse ne s'applique qu'en HPLC, elle porte le nom de RP-HPLC (ou Reverse Phase HPLC, ou HPLC en phase inverse). La RP-HPLC s'applique bien à la séparation de petites molécules apolaires : lipides, acides aminés, peptides.
Structure des billes de silice utilisées pour les phases stationnaires en chromatographie en phase reverse   ,[object Object],[object Object]
Des chaînes alkylées sont greffées sur les groupements silanols ,[object Object]
Chromatographie liquide-liquide  fondée sur la (ré)partition différentielle de chacun des solutés entre deux liquides non miscibles, l'un constituant la phase stationnaire, l'autre la phase mobile. C'est une technique essentiellement qualitative.   LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE  Théorie de la partition :  La distribution d'un soluté A entre deux solvants non-miscibles, l'un aqueux (S aq ), l'autre organique (S org ), relève de l'équilibre :  * [A Sorg ] : concentration en soluté A dans la phase organique  * [A Saq ] : concentration en soluté A dans la phase aqueuse.  Remarque :   soluté plus miscible dans le solvant organique que dans le solvant aqueux.  K aura donc une valeur supérieure à 1.
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Ce type de chromatographie est encore appelé : tamisage moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel.   Séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux.  Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort (V m  ou V 0 ). Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée.  Schéma du tamisage moléculaire LA CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION
Types de gels : ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Structure du gel " Sephadex ™"  ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
 
Représentation des résultats  ,[object Object],Une molécule totalement incluse sera éluée avec un volume d'élution  V* = V m  + V i , où V i  est le volume d'eau interne aux granules de gel.  Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires.
Détermination de la masse molaire (2ème méthode)   ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
LA CHROMATOGRAPHIE SUR ECHANGEURS D'IONS :  ,[object Object]
Résine cationique :  qui échange réversiblement des cations. Une résine cationique est chargée négativement.  Résines anioniques :  qui échange réversiblement des anions. Une résine anionique est chargée positivement.  Résine-G -  / X +  + cation + <=>Résine-G -  / cation + + X +   Résine-G +  / Y - +anion - <=>Résine-G +  /anion - + Y -
[object Object]
* Résines cationiques fortes :   ** sulfoniques (très fortement ionisées, quel que soit le pH) :  * Résines cationiques intermédiaire :  ** à groupement phospho :  * Résines cationiques faibles :  ** carboxyliques (non ionisées en milieu fortement acide) :  ** à groupement carboxyméthyl :  * Résines cationiques très faibles :   ** phénoliques (uniquement ionisées en milieu alcalin) :  Résine sous forme sodique  Résine-SO 3 -  / Na + (contre-ion : Na + ) Résine sous forme acide  Résine-SO 3 -  / H +   (contre-ion : H + ) Résine-H 2 PO 4 -  / Na + Résine-H 2 PO 4 -  / H + Résine-COO -  / Na + Résine-COO -  / H + Résine-CH 2 -COO -  / Na + Résine-CH 2 -COO - /H + Résine-O -  / Na + Résine-O -  / H +
Résines anioniques fortes :  ** résines à groupements aminés quaternaires. ** résines à groupements aminés tertiaires. Résines anioniques faibles :  ** résines à groupements aminés secondaires et primaires. Les Groupements fonctionnels des résines anioniques : Capacité de rétention d'un échangeur d'ions :  C'est le nombre de millimoles (mmol) d'ions que la résine peut échanger par unité de masse. On l'exprime par gramme de résine sèche (ou moins souvent par unité de volume : par ml de résine humide).  Elution :  L'élution consiste à déplacer l'ion fixé par un autre, de densité de chargé et de concentration plus élevée on utilise de petits ions fortement chargés : Cl-, HO-, Na+, H+...
Séparation des acides aminés
Structure d'une bille de résine pour échange d'ions  ,[object Object],[object Object],[object Object]
Choix du type d'échangeur d'ions en fonction du pI de la protéine à séparer et du pH du tampon   ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
La phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique pour un soluté de l'échantillon à analyser.   ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],LA CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITÉ
Les trois étapes d'une chromatographie d'affinité.
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

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  • 2. Classification des méthodes chromatographiques
  • 3.
  • 4. L'adsorption : fixation des molécules dissoutes par la phase solide. Cette fixation est due à l'établissement de liaisons secondaires de surface entre l'adsorbant et la molécule adsorbée : liaison dipôle-ion, ou dipôle-dipôle ou liaison de Van der Waals. Illustration de la différence entre adsorption et absorption DEFINITION
  • 5. * Les adsorbants à faible capacité d'adsorption comme l'alumine, le talc (métasilicate acide de magnésium) ou le carbonate de sodium. * Les adsorbants forts comme le gel de silice. Silices polaires greffées. Adsorbants Silices apolaires greffées.
  • 6. Pour un système chromatographique donné (caractérisé par une phase stationnaire, la température, la pression et le soluté), le pouvoir éluant dépend de la polarité du solvant. Solvants :
  • 7.
  • 8.
  • 9.
  • 10. Chromatographie liquide-liquide fondée sur la (ré)partition différentielle de chacun des solutés entre deux liquides non miscibles, l'un constituant la phase stationnaire, l'autre la phase mobile. C'est une technique essentiellement qualitative. LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE Théorie de la partition : La distribution d'un soluté A entre deux solvants non-miscibles, l'un aqueux (S aq ), l'autre organique (S org ), relève de l'équilibre : * [A Sorg ] : concentration en soluté A dans la phase organique * [A Saq ] : concentration en soluté A dans la phase aqueuse. Remarque : soluté plus miscible dans le solvant organique que dans le solvant aqueux. K aura donc une valeur supérieure à 1.
  • 11.
  • 12. Ce type de chromatographie est encore appelé : tamisage moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel. Séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux. Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort (V m ou V 0 ). Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée. Schéma du tamisage moléculaire LA CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION
  • 13.
  • 14.
  • 15.  
  • 16.
  • 17.
  • 18.
  • 19.
  • 20. Résine cationique : qui échange réversiblement des cations. Une résine cationique est chargée négativement. Résines anioniques : qui échange réversiblement des anions. Une résine anionique est chargée positivement. Résine-G - / X + + cation + <=>Résine-G - / cation + + X + Résine-G + / Y - +anion - <=>Résine-G + /anion - + Y -
  • 21.
  • 22. * Résines cationiques fortes : ** sulfoniques (très fortement ionisées, quel que soit le pH) : * Résines cationiques intermédiaire : ** à groupement phospho : * Résines cationiques faibles : ** carboxyliques (non ionisées en milieu fortement acide) : ** à groupement carboxyméthyl : * Résines cationiques très faibles : ** phénoliques (uniquement ionisées en milieu alcalin) : Résine sous forme sodique Résine-SO 3 - / Na + (contre-ion : Na + ) Résine sous forme acide Résine-SO 3 - / H + (contre-ion : H + ) Résine-H 2 PO 4 - / Na + Résine-H 2 PO 4 - / H + Résine-COO - / Na + Résine-COO - / H + Résine-CH 2 -COO - / Na + Résine-CH 2 -COO - /H + Résine-O - / Na + Résine-O - / H +
  • 23. Résines anioniques fortes : ** résines à groupements aminés quaternaires. ** résines à groupements aminés tertiaires. Résines anioniques faibles : ** résines à groupements aminés secondaires et primaires. Les Groupements fonctionnels des résines anioniques : Capacité de rétention d'un échangeur d'ions : C'est le nombre de millimoles (mmol) d'ions que la résine peut échanger par unité de masse. On l'exprime par gramme de résine sèche (ou moins souvent par unité de volume : par ml de résine humide). Elution : L'élution consiste à déplacer l'ion fixé par un autre, de densité de chargé et de concentration plus élevée on utilise de petits ions fortement chargés : Cl-, HO-, Na+, H+...
  • 25.
  • 26.
  • 27.
  • 28. Les trois étapes d'une chromatographie d'affinité.
  • 29.