Depuis la fin de la phase de screening jusqu’à l’enregistrement du médicament, au travers des phases non-cliniques et cliniques, Quality Assistance met au point des solutions personnalisées: nous définissons les protocoles analytiques, développons des méthodes d’analyse spécifiques et/ou réalisons les études de caractérisation, de stabilité, de pharmacocinétique, les tests de biomarqueurs et d’immunogénicité ainsi que le contrôle des lots permettant d’évaluer l’innocuité, l’efficacité et la qualité des produits confiés. Nous occupons une position unique sur le marché grâce à : - la centralisation de tous nos laboratoires sur un seul site - 180 professionnels hautement qualifiés - plus de 35 ans d'expérience en sciences analytiques Dr Arnaud Delobel, R&D Director, a présenté les nouveaux outils pour la caractérisation et l'analyse structurale des mAbs et ADCS : MS native, 2D-LC/MS et HDX, au Forum Pharma et Biopharma 2019 (Waters). 5 Février 2019, à Paris, France Visitez www.quality-assistance.com pour plus d'informations

1. 1Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Nouveaux outils pour la
caractérisation et l'analyse
structurale des mAbs et ADCs :
MS native, 2D-LC/MS et HDX
05 février 2019
Waters Forum Pharma & Biopharma, Paris
Arnaud Delobel, PhD
Director, R&D
Forum Pharma & Biopharma – Waters – Paris, 05 février 2019

2. 2Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Quality Assistance sa
100% analytical services
100% (bio)pharmaceutical industry
181 highly-qualified employees
> 60% university graduates
102 worldwide R&D companies
& 197 projects (2018)
Product dedicated support
Customised project management
Compliance with EMA / FDA regulations
From discovery to market place
All laboratories on one site
5700 m²
23000 hours
7 clients
11 projects
ADC expertise
(2015-2017)
35 years experience
~1.1 M € in machinery
& equipment (2018)
23700 hours
18 clients
35 projects
mAbs expertise
(2017)

3. 3Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
MS systems for protein analysis at Quality Assistance

4. 4Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Caractérisation des
mAbs & ADCs par
LC/MS

5. 5Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Spectre ESI de Humira® (adalimumab)
Informations :
• Principaux glycoformes
• Masse moléculaire (exactitude < 20 ppm)
Analyse de mAbs intacts – Masse moléculaire et glycoformes
Spectre ESI de Humira® (adalimumab)
déconvolué par MaxEnt®
Spectre ESI de Humira® (adalimumab) après
digestion par la Rapid PNGase F (New
England Biolabs), 10-15’ @ 50°C
Informations :
• Masse moléculaire (exactitude < 20 ppm)
• Clipping des lysines C-term

6. 6Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Analyse d’anticorps conjugués intacts par RP-LC/MS
DARaverage = 3.8
(en supposant que toutes les
espèces ont le même rendement
d’ionisation)
vs spectroscopie UV :
DARav = 3.9
• Kadcyla® (trastuzumab
emtansine) – conjugaison Lys
• Déglycosylation par la Rapid
PNGase F en conditions non-
réductrices (15’)
• Analyse HPLC-MS
 Désalage en ligne (Agilent
PLRP-S)
 Détection ESI-MS (QTOF)
 1 µg injecté
• Process et reporting des
données automatisés
𝐷𝐴𝑅 𝑎𝑣𝑒𝑟𝑎𝑔𝑒 =
𝑖=1
𝑛
(𝐷𝑟𝑢𝑔#𝑖 × 𝐼𝑖)
𝑖=0
𝑛
𝐼𝑖

7. 7Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
0
2
4
6
8
Analyse d’anticorps conjugués intacts par MS « native »
DARaverage = 3.9 (en supposant que toutes les
espèces ont le même
rendement d’ionisation)
(vs HIC/UV : DARav = 3.7)
• En raison de la réduction partielle des ponts
S-S inter-chaines, il est nécessaire de
travailler en conditions non-dénaturantes
(MS « native »)
• Déglycosylation par la Rapid PNGase F en
conditions non-réductrices (15’)
• Analyse HPLC-MS
 Désalage en ligne sur une colonne SEC
(Waters UPLC BEH200 SEC, 1.7 µm)
 Elution isocratique avec 100 mM ammonium
acetate pH 7.0
 Détection ESI-MS (QTOF) – Conditions de
sources optimisées
 20 µg injectés (sensibilité plus faible en MS
native)

8. 8Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Une enzyme de choix pour la caractérisation des mAbs et
ADCs : IdeS (Fabricator®)

9. 9Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Analyse d’anticorps monoclonaux au niveau « sous-unités »

10. 10Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Suivi de l’oxydation des mAbs au niveau « sous-unités »

11. 11Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Analyse d’Adcetris® au niveau « sous-unités »
Fc/2
LC LC +1 drug
Fd
Fd + 1 drug
Fd + 2 drugs
Fd + 3 drugs
DAR calculé = 4.1
(sur base des données UV)

12. 12Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Peptide mapping par RP-UPLC-MSE
• Digestion avec une protease spécifique pour générer les peptides
• Des couvertures de sequence de ~ 100% sont
maintenant facilement accessibles en routine :
▪ Colonnes sub-2 µm : cartes peptidiques à haute résolution
▪ HRMS : identification des peptides avec une precision en
masse < 5 ppm
▪ Mode d’acquisition MSE : données de fragmentation MS/MS-like
▪ UNIFI : process et reporting automatiques des données dans
un cadre GMP
▪ Informations sur les modifications post-traductionnelles

13. 13Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
La MS au service du peptide mapping pour des tests
d’identification utilisés pour la libération de lots
Antibody identification by peptide mapping using
UPLC-MS. Determination of glycosylation sites and
post-translational modifications
Pool Humira digest QA - Prise en main QDa
Project Name: DEV_R D_QDAReported by User: AVAAS (avaas)
Result Id 1891, 1882, 1883, 1889, 1890, 1886, 1887, 1892, 1884, 1885, 1888Injection Id 1811
Channel Id 1812, 1817, 1819, 1820, 1815, 1816, 1821, 1813, 1814, 1818, 1822
Current Date: Friday, November 25, 2016
1: QDa Positive(+) SIR Ch1 631.30 Da, CV=30
1: QDa Positive(+) SIR Ch2 703.70 Da, CV=30
1: QDa Positive(+) SIR Ch3 749.30 Da, CV=30
1: QDa Positive(+) SIR Ch4 838.50 Da, CV=30
1: QDa Positive(+) SIR Ch5 1055.10 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch10 1069.40 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch11 1117.80 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch6 535.40 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch7 745.60 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch8 752.00 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch9 888.50 Da, CV=30
2:T5+++
1:T8-9++
2:T3&+++
1:T9++
2:T3&++
1:T9+
1:T3-4++
1:T6++
1:T2&+
1:T3-4+++
1:T3+
Intensity
0.0
2.0x105
4.0x105
6.0x105
8.0x105
1.0x106
1.2x106
1.4x106
1.6x106
1.8x106
2.0x106
Minutes
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
Pool Humira digest QA - Prise en main QDa
Project Name: DEV_R D_QDAReported by User: AVAAS (avaas)
Result Id 1891, 1882, 1883, 1889, 1890, 1886, 1887, 1892, 1884, 1885, 1888Injection Id 1811
Channel Id 1812, 1817, 1819, 1820, 1815, 1816, 1821, 1813, 1814, 1818, 1822
Current Date: Friday, November 25, 2016
1:T9++1:T9+
Intensity
0.0
2.0x105
4.0x105
6.0x105
8.0x105
1.0x106
Minutes
18.20 18.40 18.60 18.80 19.00
1:T3-4++1:T3-4+++
Intensity
0.0
2.0x105
4.0x105
6.0x105
8.0x105
1.0x106
1.2x106
Minutes
28.90 29.00 29.10 29.20
2:T3&+++2:T3&++
Intensity
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
Minutes
37.00 37.20 37.40 37.60 37.80 38.00
2:T3&+++
2:T3&++
Intensity
420000.0
440000.0
460000.0
Minutes
37.58 37.60
Pool Humira digest QA - Prise en main QDa
Project Name: DEV_R D_QDAReported by User: AVAAS (avaas)
Result Id 1891, 1882, 1883, 1889, 1890, 1886, 1887, 1892, 1884, 1885, 1888Injection Id 1811
Channel Id 1812, 1817, 1819, 1820, 1815, 1816, 1821, 1813, 1814, 1818, 1822
Current Date: Friday, November 25, 2016
1: QDa Positive(+) SIR Ch1 631.30 Da, CV=30
1: QDa Positive(+) SIR Ch2 703.70 Da, CV=30
1: QDa Positive(+) SIR Ch3 749.30 Da, CV=30
1: QDa Positive(+) SIR Ch4 838.50 Da, CV=30
1: QDa Positive(+) SIR Ch5 1055.10 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch10 1069.40 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch11 1117.80 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch6 535.40 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch7 745.60 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch8 752.00 Da, CV=30
2: QDa Positive(+) SIR Ch9 888.50 Da, CV=30
2:T5+++
1:T8-9++
2:T3&+++
1:T9++
2:T3&++
1:T9+
1:T3-4++
1:T6++
1:T2&+
1:T3-4+++
1:T3+
Intensity
0.0
2.0x105
4.0x105
6.0x105
8.0x105
1.0x106
1.2x106
1.4x106
1.6x106
1.8x106
2.0x106
Minutes
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00

14. 14Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
2D-LC/MS pour les
études de
caractérisation
avancées

15. 15Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Heart-cutting 2D-LC/MS avec technologie « at-column dilution »
• Process automatisé
• Désalage efficace
• Système robuste
• Focusing et désalage sur une colonne de “trap”
(Waters X-Bridge BEH300 C4 ; 30 mm, 3.5 µm)
• Applicable à tous types de separation
(SEC, IEX, HIC …)
Step 1 : 1D configuration  1st dim. column to UV detector
Step 2 : Peak heart-cutting  1st dim. column to trap
Step 3 : 2D configuration  trap to 2nd dim. column to MS

16. 16Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Profil WCX-HPLC d’adalimumab après stress basique (100 mM Tris, pH 8)
 Heart-cutting de chaque pic, désalage et analyse MS
Analyse de variants de charge d’Humira® par 2D-LC/MS

17. 17Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Analyse de variants de charge par 2D-LC/MS
• Identification des différente espèces après désalage

18. 18Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Avantages de la 2D-LC/MS pour la caractérisation des ADCs
• La chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC) est une méthode de choix pour la
caractérisation des ADCs
▪ Détermination de l’anticorps nu pour les ADC Lys (ou technologies site-spécifique)
▪ Détermination du DAR et de la drug load distribution pour les conjugués Cys
• En raison de la concentration extrêmement élevée en sels non-volatils dans la phase
mobile, impossible de coupler directement à la MS pour l’identification des pics
• La collecte de fraction suivie du désalage est longue, et peu applicable aux espèces
minoritaires (effets de dilution)
La 2D-LC/MS est la solution pour l’identification
des pics observés sur les chromatogrammes HIC

19. 19Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Application de la HIC-RP 2D-LC/MS à Adcetris®

20. 20Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
DARaverage (HIC/UV) = 3.7
Application de la HIC-RP 2D-LC/MS à Adcetris®

21. 21Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Investigations sur la nature de fragments de mAbs
par SEC-RP-LC/MS
• Case study:
▪ mAb en étude de stabilité
(6 mois, 25°C) contient une
quantité significative de
fragments (jusque 10%)
▪ 2 fragments distincts
détectés, explicables par
un clivage du mAb en 2
sous-unités

22. 22Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Analyse des fragments par heart-cutting SEC-RP LC/MS
• Trois cuts:
▪ Monomère (contrôle)
▪ Fragments de haute masse
moléculaire
▪ Fragments de basse
masse moléculaire
• 3 runs LC nécessaires
(seulement un cut par run
avec notre configuration)

23. 23Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
SEC-RP LC/MS : analyse du monomère
Brut Deconvolué
Correspond à la masse attendue, pas de Lys C-term, acide
pyroglutamique Q, glycosylation G0F/G0F - D = 2.5 ppm
Oxydation possible de 2 Cys en acides sulfoniques
Glycosylation, untruncated
lysines, oxidation

24. 24Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
SEC-RP LC/MS : analyse des fragments de basse masse
moléculaire
Site de fragmentation Cysteine sur la HC
(Fd du côté N-terminal) :
---KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGP---
Site de fragmentation Cysteine sur la LC
(Fd du côté N-terminal) :
---LSSPV TKSFN RGEC
Brut Deconvolué
Fd
LC – Cys

25. 25Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
SEC-RP LC/MS : analyse des fragments de basse masse
moléculaire
• Le TIC a été combiné par sections pour donner des spectres moins
hétérogènes, les différentes espèces éluant différemment sur la
colonne RP.
Section 2
Autres sites de
fragmentation possible sur
la HC :
KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC
PAPELLGGP
Section 1
LC - Cys
Reduced LC
*
*
*

26. 26Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
SEC-RP LC/MS : analyse des fragments de haute masse
moléculaire
Brut Deconvolué
Autres sites de fragmentation observes :
---KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGP---
*
*
* *
* *
Glycosylation, untruncated
lysines, oxidation
LC + HC + Fc/2
Site de fragmentation Cystéine
(correspondant au site de frag. principal du Fd)
(Fc/2 est du côté C-terminal) :
---KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPD---
*

27. 27Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Résumé des résultats
• Pic principal : monomère
(mais le spectre de masse est très complexe, ce qui pourrait indiquer une coélution avec des produits de
dégradation)
• Fragments de basse masse moléculaire :
▪ Fd (hétérogénéité dans les site de fragmentation de la HC (region charnière))
▪ LC (observée sans Cys C-term ou réduite)
▪ Les fragments pourraient exister sous forme de Fab non-covalent (denaturé sur la colonne RP)
• Fragments de haute masse moléculaire : LC + HC + Fc/2
▪ hétérogénéité dans les site de fragmentation de la HC (region charnière)
▪ Complementaires des fragments Fd

28. 28Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
L’HDX pour la
caractérisation
structurale et les études
d’epitope mapping

29. 29Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Qu’est-ce que l’HDX?
H
Solution de D2O
Engen JR. Anal Chem. 2009 Oct 1;81(19):7870-5.
Les H les plus
accessibles s’échangent
plus vite
Les H les moins accessibles
s’échangent plus lentement
H vs. D
1 Da 2 Da
L’échange H/D est mesuré
via l’augmentation de masse
de la protéine ou du peptide

30. 30Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Workflow HDX-MS au niveau protéine et/ou peptide

31. 31Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Pourquoi l’HDX maintenant chez Quality Assistance ?

32. 32Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
• 3 mAbs ciblant un récepteur interleukine
▪ Echange de tampon : Na Phosphate 10 mM, 100 mM NaCl, pH 6.8
▪ Concentration finale : 22 µM (Kd de l’ordre du nM)
• HDX
▪ 30 min dans 90% D2O (même tampon)
• Quench / denaturation / réduction
▪ Na Phosphate 100 mM, pH 2.3 + 400 mM TCEP + 4 M guanidine
▪ Mélange 1:1, 1.0°C, 2 min
• La liaison d’une protéine à une autre généralement imlplique une diminution de la vitesse d’incorporation
de deuterium, car les acides amines impliqués sont moins accessibles et/ou établissent de Nouvelles
liaisons H-H
• L’epitope peut être determine en identifiant les regions qui présentent une incorporation de dutérium
réduite après liaison.
Case study : epitope mapping de 3 mAbs ciblant un récepteur
interleukine

33. 33Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Couverture de séquence et incorporation de deutérium
-2
0
2
4
6
8
10
Deuteriumuptake(Da)
Pooled SD CD127 CD127+OSE127 Difference
71—85
93—125
IL Complex
-2
0
2
4
6
8
Deuteriumuptake(Da)
67—93 93—125 125—141
-2
0
2
4
6
8
Deuteriumuptake(Da)
67—85 93—108
mAbA
mAbB
mAbC

34. 34Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Analyse statistique
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
-3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
SSMD
Average log2 fold change
Dual-flashlight plot
78-84
78-85
79-84 74-81
72-85
71-77
Magnitude of change protectiondeprotection
Effectsize
-7.5
-2.5
2.5
7.5
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0
SSMD
Average log2 fold change
107-125
109-123
85-93
72-77
93-101
216-224
 {SSMD > 5; log2 fold change > 1}
𝑺𝑺𝑴𝑫 =
𝑫𝑰𝑳 − 𝑫 𝒄𝒑𝒍𝒙
𝑺𝑫𝑰𝑳
𝟐
+ 𝑺𝑫 𝒄𝒑𝒍𝒙
𝟐
=
∆𝑫
𝑺𝑫 𝑷

35. 35Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Heatmaps
mAb A mAb CmAb B
Relative fractional uptake (%)
No protection Maximum protection

36. 36Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Que conclure de cette étude d’epitope mapping ?
• Les 3 anticorps se lient sur le même
épitope du recepteur interleukine
• Un des 3 anticorps semble se lier à un
épitope secondaire
• Ces résultats confirment les résultats
obtenus par des techniques
orthogonales

37. 37Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
Conclusions
• La spectrométrie de masse est un outil indispensable pour la caractérisation
des protéines thérapeutiques à différents niveaux :
▪ Intact
▪ Sous-unités
▪ Peptides
▪ Glycosylations
• Ces outils sont maintenant utilisables en routine dans un contexte GMP.
• La détection MS (ex : QDa) peuvent aussi être un outil complémentaire aux
détections optiques dans un environnement QC
• Les techniques telles que l’HDX et la 2D-LC/MS sont des outils robustes
permettant d’aller un niveau plus loin dans la caractérisation.

38. 38Arnaud Delobel, PhD – Forum Pharma & Biopharma, Waters – Paris – 05 février 2019
arnaud.delobel@quality-assistance.be
+32 71 53 47 81
www.quality-assistance.com
Technoparc de Thudinie, 2
B-6536 Donstiennes (Belgium)
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