UNIVERSITÉ	
  EVRY	
  VAL	
  D’ESSONNE	
  
Des	
  génomes	
  aux	
  organismes	
  
Laboratoire	
  d’Epigénétiq...
 
	
  
 
	
   -­‐	
  1	
  -­‐	
  	
  
Remerciements	
  
A	
  l’issue	
  de	
  la	
  rédaction	
  de	
  ce	
  manuscrit,	
  je	
  ...
 
	
  -­‐	
  2	
  -­‐	
  
Aux	
  personnes	
  extérieures	
  à	
  l’équipe	
  qui	
  ont	
  contribué	
  au	
  bon	
  déro...
 
	
   -­‐	
  3	
  -­‐	
  	
  
Résumé	
  
Ce	
   travail	
   de	
   thèse	
   comporte	
   trois	
   projets	
   visant	
 ...
 
	
  -­‐	
  4	
  -­‐	
  
Abstract	
  
This	
  thesis	
  is	
  composed	
  of	
  three	
  projects	
  looking	
  to	
  imp...
 
	
   -­‐	
  5	
  -­‐	
  	
  
Table	
  des	
  matières	
  
Remerciements	
  ................................................
 
	
  -­‐	
  6	
  -­‐	
  
 
	
   -­‐	
  7	
  -­‐	
  	
  
Liste	
  des	
  figures	
  
Figure	
  1	
  :	
  De	
  l’ADN	
  aux	
  chromosomes.	
  ........
 
	
  -­‐	
  8	
  -­‐	
  
Figure	
  46	
  :	
  Profils	
  des	
  marques	
  d’histones	
  au	
  niveau	
  d’un	
  promoteu...
 
	
   -­‐	
  9	
  -­‐	
  	
  
Figure	
  84	
  :	
  Clusterisation	
  des	
  données	
  d’expression	
  de	
  lignées	
  c...
 
	
  -­‐	
  10	
  -­‐	
  
	
   	
  
 
	
   -­‐	
  11	
  -­‐	
  	
  
Liste	
  des	
  tableaux	
  
Tableau	
  1	
  :	
  Techniques	
  expérimentales	
  d’étude	...
 
	
  -­‐	
  12	
  -­‐	
  
Tableau	
  38	
  :	
  Concentration	
  en	
  ADN	
  circulant	
  de	
  plasma	
  ou	
  sérum	
 ...
 
	
   -­‐	
  13	
  -­‐	
  	
  
Abréviations	
  et	
  acronymes	
  
3C	
  :	
  Chromosome	
  Conformation	
  Capture	
  
4...
 
	
  -­‐	
  14	
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DNMT	
  :	
  ADN	
  méthyltransférase	
  
ETS	
  :	
  E-­‐Twenty-­‐Six	
  
FAIRE-­‐seq	
  :	
  ...
 
	
   -­‐	
  15	
  -­‐	
  	
  
RNA-­‐seq	
  :	
  séquençage	
  de	
  l’ARN	
  	
  
RPKM	
  :	
  Read	
  Per	
  Kilo	
  pe...
 
	
  -­‐	
  16	
  -­‐	
  
	
   	
  
 
	
   -­‐	
  17	
  -­‐	
  	
  
Introduction	
  	
  
Cette	
  dernière	
  décennie,	
  l’avènement	
  du	
  séquençage	
  ...
 
	
  -­‐	
  18	
  -­‐	
  
d’un	
  test	
  de	
  diagnostic	
  basé	
  sur	
  la	
  détection	
  sensible	
  de	
  biomarq...
 
	
  -­‐	
  19 -
Chapitre	
  I	
  :	
  Mise	
  en	
  contexte	
  des	
  projets	
  
1.	
  Organisation	
  de	
  la	
  chr...
Chapitre	
  I	
  :	
  Mise	
  en	
  contexte	
  des	
  projets	
  
	
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  20	
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1. Organisation	
  de	
  ...
  Organisation	
  de	
  la	
  chromatine	
  et	
  régulation	
  de	
  la	
  transcription	
  
	
   -­‐	
  21	
  -­‐	
  	
 ...
Chapitre	
  I	
  :	
  Mise	
  en	
  contexte	
  des	
  projets	
  
	
  -­‐	
  22	
  -­‐	
  
1.1.4. Organisation	
  des	
  ...
  Organisation	
  de	
  la	
  chromatine	
  et	
  régulation	
  de	
  la	
  transcription	
  
	
   -­‐	
  23	
  -­‐	
  	
 ...
Chapitre	
  I	
  :	
  Mise	
  en	
  contexte	
  des	
  projets	
  
	
  -­‐	
  24	
  -­‐	
  
Dans	
   cette	
   partie,	
  ...
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
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Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"
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Manuscrit de thèse comprenant 3 projets :
- recherche de mutations conductrices de l'adénocarcinome du rein à cellules claires (ccRCC) dans l'ADN non-codant par l'utilisation de données de ChIP-seq, d'ATAC-seq, de RNA-seq et de séquençage pangénomique
- analyse des altérations moléculaires de la voie FGF/FGFR dans le ccRCC par analyse de données RNA-seq, 450K (méthylation) et séquençage pangénomique
- mise au point d'un test de détection du ccRCC basé sur la méthylation de l'ADN circulant.

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Thèse : "Génétique et épigénétique de l'adénocarcinome du rein à cellules claires"

  1. 1.       UNIVERSITÉ  EVRY  VAL  D’ESSONNE   Des  génomes  aux  organismes   Laboratoire  d’Epigénétique  et  Environnement  –  CNG  –  CEA             THÈSE     présentée  et  soutenue  publiquement  le  09  avril  2015     pour  l’obtention  du  grade  de   Docteur  de  l’Université  d’Evry  Val  d’Essonne   Discipline  ou  Spécialité  :  Génétique  et  épigénétique   par  :     Aurélie  BOUSARD       Étude  génétique  et  épigénétique  de   l’adénocarcinome  du  rein  à  cellules  claires   COMPOSITION DU JURY Président : Monsieur PAGÈS Gilles Rapporteur : Madame ARIMONDO Paola Rapporteur : Monsieur DEFOSSEZ Pierre-Antoine Examinateur : Monsieur MIOTTO Benoit Directeur de thèse : Madame BIHOREAU Marie-Thérèse Co-directeur de thèse : Monsieur TOST Jorg Co-directeur de thèse : Madame LEPAGNOL-BESTEL Aude-Marie
  2. 2.    
  3. 3.     -­‐  1  -­‐     Remerciements   A  l’issue  de  la  rédaction  de  ce  manuscrit,  je  suis  convaincue  que  la  thèse  n’est  pas  un  travail  aussi  solitaire   qu’il   n’y   paraît.   En   effet,   de   nombreuses   personnes   ont   contribué   par   leurs   conseils   scientifiques,   leurs   aides  techniques  ou  encore  par  leur  support  moral  à  l’aboutissement  de  ce  travail.     Je  tiens  donc  à  adresser  mes  remerciements…   A  mes  directeurs  de  thèse  :  Jorg,  Aude-­‐Marie  et  Marie-­‐Thérèse.  A  Jorg  plus  particulièrement  pour  m’avoir   permis   d’effectuer   ma   thèse   au   sein   du   Laboratoire   Épigénétique   et   Environnement   et   pour   m’avoir   accordé   sa   confiance   dans   la   gestion   de   ce   projet,   en   me   laissant   une   grande   liberté   d’action   tout   en   gardant  un  œil  bienveillant  sur  l’avancée  de  mes  travaux.  A  Aude-­‐Marie  pour  sa  disponibilité,  son  accueil   lors  de  mon  passage  au  CPN  et  sa  contribution  dans  la  relecture  de  ce  manuscrit.   Aux  membres  du  jury  qui  ont  accepté  de  lire  ce  manuscrit  et  d’y  apporter  leur  jugement  :  à  Paola  Arimondo   et   à   Pierre-­‐Antoine   Defossez   en   tant   que   rapporteurs,   à   Gilles   Pagès   et   Benoît   Miotto   en   tant   qu’examinateurs.   A  Jean-­‐François,  d’avoir  accepté  de  financer  les  six  derniers  mois  de  cette  thèse,  qui  ont  représenté  un  délai   précieux  pour  finaliser  au  mieux  mes  projets,  et  d’avoir  insufflé  une  nouvelle  dynamique  scientifique  et   relationnelle  au  CNG.   A  l’équipe  du  laboratoire  Épigénétique  et  Environnement,  qui  s’est  agrandie  et  enrichie  depuis  mon  arrivée   de   personnes   aux   compétences,   cultures   et   caractères   diversifiés   et   avec   qui   il   a   été   très   agréable   de   travailler.  A  Christian  pour  avoir  apporté  sa  grande  expérience  technique   au   profit   de   mes   projets   mais   aussi  pour  avoir  partagé  de  nombreux  moments  de  réflexion  mais  aussi  d’avoir  su  garder  secrètes  certaines   de  mes  «  boulettes  »  de  manip  pour  m’éviter  d’être  la  risée  du  CNG.  A  Fabien  pour  son  apport  déterminant   dans  les  analyses  bio-­‐informatiques,  sans  lequel  mes  données  seraient  peut-­‐être  encore  occupées  en  train   de  charger  sur  Galaxy,  pour  sa  patience  face  à  mes  multiples  requêtes  et  pour  m’avoir  initiée  au  monde  de   la  bioinformatique.  A  Florence  (alias  Bubu),  qui  m’a  chaleureusement  accueillie  au  sein  de  l’équipe,  qui  n’a   cessé  de  m’encourager  à  grand  renfort  de  chocolats  et  sur  qui  j’ai  pu  toujours  compter  depuis  mon  arrivée.   A   Sylvain   avec   qui   j’ai   partagé   de   nombreuses   discussions   scientifiques   (ou   pas…),   qui   a   activement   participé  à  ma  veille  scientifique  et  qui  m’a  apporté  de  nombreux  encouragements  dans  la  dernière  ligne   droite.  A  Shu-­‐Fang  de  s’être  constamment  inquiétée  de  l’évolution  de  mon  moral  ;  son  sens  de  l’écoute  m’a   été  salutaire.  A  toutes  les  personnes  qui  ont  passé  du  temps  sur  la  correction  de  ce  manuscrit,  notamment   Sylvain,  Florence  M,  Florence  B  et  Christian.  A  toutes  les  autres  personnes  du  laboratoire  :  Céline  pour  son   énergie  communicative,  Olexy,  à  Chao  et  Yimin  pour  leurs  sourires  permanents,  Kevin  pour  son  humour   décalé,  Anne  pour  avoir  partagé  l’écriture  de  la  revue  avec  moi,  Nico,  Gitte  et  Andreas  pour  leur  grande   gentillesse.    
  4. 4.    -­‐  2  -­‐   Aux  personnes  extérieures  à  l’équipe  qui  ont  contribué  au  bon  déroulement  de  cette  thèse.  A  Sophie  pour   le   partage   de   réflexions   sur   les   aspects   chromatiniens   et   l’apport   de   son   regard   critique   sur   certaines   parties   de   ce   manuscrit.     A   Anne   et   à   l’équipe   de   la   banque   pour   avoir   si   gentiment   préparé   mes   échantillons  et  accepté  ma  présence  dans  leur  salle  de  culture  cellulaire.  A  Marie-­‐Thérèse  et  à  l’équipe  de   séquençage  pour  la  prise  en  charge  de  mes  échantillons.  A  l’équipe  de  bio-­‐informatique  d’avoir  été  de  bon   conseil.  A  notre  petit  groupe  de  filles  avec  qui  j’ai  partagé  d’agréables  pauses  de  déjeuner.  A  toutes  les   autres  personnes  du  CNG  qui  contribuent  à  la  bonne  ambiance  générale.   Aux   personnes   extérieures   au   CNG   avec   qui   j’ai   collaboré.   A   Alex   d’avoir   apporté   son   expérience   sur   certains   aspects   de   mes   projets.   A   Victor   et   Louis   de   m’avoir   aidée   à   percer   les   mystères   de   la   bio-­‐ informatique.  Au  Consortium  Cagekid  pour  la  mise  à  disposition  de  leurs  nombreuses  données.   Aux  gens  qui  m’entourent  et  qui  participent  grandement  à  mon  épanouissement  personnel.  A  mes  parents   de  m’avoir  laissé  une  grande  liberté  dans  mes  choix  de  vie  et  de  m’avoir  toujours  soutenue  dans  les  défis   que   je   me   lançais.   A   ma   sœur,   mon   frère   et   mes   amis   d’avoir   été   si   compréhensifs   face   à   mon   indisponibilité   croissante   durant   cette   thèse.   A   mon   mari   de   m’avoir   encouragée   à   suivre   mes   envies,   d’avoir  vécu  les  hauts  et  les  bas  avec  moi,  d’avoir  assuré  l’intendance  quotidienne  lors  de  ces  derniers  mois   et  de  m’avoir  soutenue  pendant  ces  trois  ans  et  demi.  
  5. 5.     -­‐  3  -­‐     Résumé   Ce   travail   de   thèse   comporte   trois   projets   visant   à   approfondir   la   caractérisation   moléculaire   des   adénocarcinomes  du  rein  à  cellules  claires  (ccRCC)  et  à  en  améliorer  le  diagnostic  en  utilisant  les  données   génétiques  et  épigénétiques  du  consortium  Cagekid.   Le   premier   projet   traite   de   l’identification   de   mutations   oncogéniques   présentes   dans   les   éléments   régulateurs   actifs   du   génome   des   ccRCC.   L’utilisation   de   données   de   séquençage   pangénomique   d’une   centaine   de   patients   atteints   de   ccRCC   et   de   données   épigénétiques   (ChIP-­‐seq   et   ATAC-­‐seq)   issues   de   lignées  cellulaires  de  cancer  du  rein  a  permis  l’identification  d’îlots  de  mutations  situés  dans  ces  éléments   régulateurs.   Parmi   ces   derniers,   on   compte   de   nombreux   promoteurs   de   gènes   associés   à   des   cancers   urogénitaux.  De  plus,  l’utilisation  de  données  de  RNA-­‐seq  a  permis  d’associer  certains  de  ces  îlots  à  des   changements  d’expression  génique.  Un  îlot  de  mutation  a  ainsi  pu  être  identifié  sur  un  élément  régulateur   actif  situé  dans  le  premier  intron  du    gène  WWC1  qui  appartient  à  la  voie  Hippo.  Cette  voie  est  connue  pour   être   impliquée   dans   l’oncogenèse,   ce   qui   renforce   l’intérêt   potentiel   des   mutations   de   cet   élément   régulateur  dans  le  ccRCC.  D’autres  îlots  de  mutations  ont  pu  être  identifiés  en  association  avec  l’expression   de  gènes  comme  IGF1R.  Ce  travail  novateur  dans  sa  démarche  d’intégration  de  données  génomiques  et   épigénétiques   constitue   la   première   étude   à   permettre   l’identification   de   mutations   non-­‐codantes   localisées  sur  des  éléments  régulateurs  actifs  définis  dans  le  type  cellulaire  correspondant  à  la  pathologie   d’intérêt.   Le  deuxième  volet  de  ce  travail  consiste  en  une  étude  focalisée  sur  les  altérations  moléculaires  de  la  voie   FGF/FGFR  qui  est  la  cible  de  thérapies  en  cours  d’essais  cliniques  dans  le  ccRCC.  Il  a  permis  de  suggérer  une   implication  de  l’activation  de  la  voie  FGF/FGFR  dans  l’oncogenèse  du  ccRCC  et  dans  le  pronostic  vital  des   patients,  notamment  par  l’action  de  régulateurs  négatifs  de  cette  voie  tel  que  SEF.   Enfin,  la  troisième  partie  concerne  la  mise  au  point  d’un  test  de  diagnostic  non-­‐invasif  du  ccRCC  à  partir  de   l’ADN  circulant.  Il  a  abouti  à  l’identification  de  biomarqueurs  hyperméthylés  et  au  développement  de  tests   sensibles  basés  sur  des  qPCR  spécifiques  de  la  méthylation.     Les   différentes   approches   abordées   s’inscrivent   dans   le   cadre   de   l’amélioration   de   la   caractérisation   moléculaire   des   tumeurs   qui   a   été   rendue   possible   par   l’avènement   des   nouvelles   techniques   de   séquençage.  Les  promesses  en  termes  de  diagnostic  et  de  prise  en  charge  des  patients  sont  multiples  et   devraient   permettre   dans   un   avenir   proche   d’aller   vers   des   approches   thérapeutiques   plus   ciblées   et   le   développement  de  la  médecine  personnalisée.       Mots-­‐clés  :   adénocarcinome   du   rein   à   cellules   claires,   éléments   régulateurs,   mutations   de   l’ADN   non-­‐ codant,  FGF/FGFR,  ADN  circulant,  biomarqueurs.  
  6. 6.    -­‐  4  -­‐   Abstract   This  thesis  is  composed  of  three  projects  looking  to  improve  molecular  characterization  and  diagnosis  of   clear  cell  renal  cell  carcinoma  (ccRCC).  To  achieve  this  goal,  genetic  and  epigenetic  data  from  the  CAGEKID   consortium  have  been  used.   The  first  project  concern  the  identification  of  oncogenic  mutations  located  on  active  regulatory  elements  of   ccRCC.  The  use  of  whole-­‐genome  sequencing  data  of  an  hundred  patients  affected  by  ccRCC  and  epigenetic   data  (ChIP-­‐seq  and  ATAC-­‐seq)  from  renal  cancer  cell  lines  enabled  the  identification  of  mutation  islands   located  in  these  active  regulatory  elements.  Among  those,  numerous  mutated  promoters  were  known  to   be  involved  in  urogenital  cancers.  Moreover,  the  use  of  RNA-­‐seq  data  highlighted  the  association  between   some   mutation   islands   and   gene   expression   changes.   One   mutation   island   has   been   identified   on   a   regulatory   element   located   in   the   first   intron   of   WWC1.   This   gene   is   a   member   of   the   Hippo   pathway   known  to  be  involved  in  ccRCC  tumorigenesis  making  the  potential  interest  of  those  mutations  reinforced.   Other   mutation   islands   have   been   identified   in   association   with   gene   expression,   such   as   IGF1R.   This   pioneer   work   in   integrating   approach   of   genetic   and   epigenetic   data   consists   in   the   first   study   that   describes  non-­‐coding  mutations  located  on  active  regulatory  elements  identified  on  a  cell  type  relevant  to   the  study.     The   second   project   consists   of   a   study   of   the   molecular   alterations   of   the   FGF/FGFR   pathway,   that   is   currently   the   target   of   therapies   tested   on   clinical   assays   in   ccRCC.   It   suggests   an   involvement   of   the   FGF/FGFR   pathway   activation   in   ccRCC   tumorigenesis   and   in   patient   prognosis,   partly   through   the   expression  alterations  of  negative  regulators  of  this  pathway  such  as  SEF.   Finally,   the   set-­‐up   of   a   ccRCC   non-­‐invasive   diagnostic   test   from   circulating   DNA   has   been   initiated.   Hypermethylated  biomarkers  have  been  identified  and  sensible  tests  based  on  methylation-­‐specific  qPCR     have  been  set  up  in  the  third  project.     Those  different  approaches  fall  into  the  improvement  of  tumor  molecular  characterization  that  has  been   allowed   through   the   progress   of   the   next-­‐generation   sequencing   technologies.   The   promises   in   term   of   diagnosis  and  patient  management  are  multiple  and  should  allow  the  expansion  of  the  development  of   targeted  therapies  and  personalized  medicine  in  the  next  future.       Keywords:   clear   cell   renal   cell   adenocarcinoma,   regulatory   elements,   non-­‐coding   mutations,   FGF/FGFR,   circulating  DNA,  biomarkers.        
  7. 7.     -­‐  5  -­‐     Table  des  matières   Remerciements  ...........................................................................................................................  1   Résumé  .......................................................................................................................................  3   Abstract  .......................................................................................................................................  4   Table  des  matières  ......................................................................................................................  5   Liste  des  figures  ...........................................................................................................................  7   Liste  des  tableaux  ......................................................................................................................  11   Abréviations  et  acronymes  ........................................................................................................  13   Introduction  ..............................................................................................................................  17   Chapitre  I  :  Mise  en  contexte  des  projets  ...................................................................................  19   1.  Organisation  de  la  chromatine  et  régulation  de  la  transcription  ............................................................  20   2.  Les  cancers  :  caractéristiques  biologiques,  génétique,  épigénétique  .....................................................  40   3.  L’adénocarcinome  du  rein  à  cellules  claires  ...........................................................................................  60   4.  Sujet  de  thèse  .........................................................................................................................................  71   Chapitre  II  :  Identification  de  mutations  dans  les  éléments  régulateurs  actifs  du  ccRCC  .............  73   1.  Objectif  ...................................................................................................................................................  74   2.  Matériels  et  méthodes  ............................................................................................................................  74   3.  Résultats  .................................................................................................................................................  95   4.  Discussion  .............................................................................................................................................  130   5.  Conclusions  et  perspectives  ..................................................................................................................  149   Chapitre  III  :  Analyse  des  altérations  de  la  voie  FGF/FGFR  dans  le  ccRCC  ..................................  151   1.  Objectif  .................................................................................................................................................  152   2.  Matériels  et  méthodes  ..........................................................................................................................  152   3.  Résultats  ...............................................................................................................................................  159   4.  Discussion  .............................................................................................................................................  171   5.  Conclusions  et  perspectives  ..................................................................................................................  177   Chapitre  IV  :  Mise  au  point  d’un  test  de  détection  de  la  méthylation  de  l’ADN  circulant  de   patients  atteints  de  ccRCC  .......................................................................................................  179   1.  Objectif  .................................................................................................................................................  180   2.  Matériels  et  méthodes  ..........................................................................................................................  180   3.  Résultats  ...............................................................................................................................................  185   4.  Discussion  .............................................................................................................................................  193   5.  Conclusions  et  perspectives  ..................................................................................................................  200   Conclusions  générales  .............................................................................................................  201   Bibliographie  ...........................................................................................................................  203   Annexes  ..................................................................................................................................  218   Communications  ......................................................................................................................  234        
  8. 8.    -­‐  6  -­‐  
  9. 9.     -­‐  7  -­‐     Liste  des  figures   Figure  1  :  De  l’ADN  aux  chromosomes.  ...........................................................................................................  21   Figure  2  :  Euchromatine  et  hétérochromatine.  ...............................................................................................  21   Figure  3  :  Organisation  de  la  chromatine  dans  le  noyau.  ................................................................................  22   Figure  4  :  Territoires  chromosomiques  et  agencement  radial  dans  le  noyau.  ................................................  23   Figure  5  :  Les  modèles  d’interactions  entre  territoires  chromosomiques.  .....................................................  23   Figure  6:  ADN  non-­‐codant.  ..............................................................................................................................  25   Figure  7  :  Les  promoteurs  et  les  enhancers,  acteurs    de  la  transcription  d’un  gène.  ......................................  26   Figure  8  :  Méthylation  des  cytosines  et  reconnaissance  par  les  MBP  .............................................................  28   Figure  9  :  Oxydation  des  groupements  méthyles  par  les  enzymes  TET  et  déméthylation  de  l’ADN.  .............  29   Figure  10  :  Structure  d’un  nucléosome.  ..........................................................................................................  30   Figure  11  :  Modifications  d’histones.  ..............................................................................................................  31   Figure  12  :  États  chromatiniens  proposés  à  partir  de  modifications  d'histones  par  Ernst  el  al.  .....................  32   Figure  13  :  Modifications  d’histones  et  liaisons  aux  enzymes  de  remodelage  de  la  chromatine.  ..................  33   Figure  14  :  Positionnement  des  nucléosomes.  ...............................................................................................  35   Figure  15  :  Les  caractéristiques  d’un  cancer.  ..................................................................................................  40   Figure  16  :  L'invasion  et  la  diffusion  métastatique.  ........................................................................................  43   Figure  17  :  Les  mutations  conductrices.  ..........................................................................................................  45   Figure  18  :  Gènes  les  plus  fréquemment  mutés  dans  différents  types  de  tumeurs.  ......................................  46   Figure  19  :  Hétérogénéité  inter-­‐  et  intra-­‐tumorale.  ........................................................................................  49   Figure  20  :  Identification  des  gènes  conducteurs  par  comparaison  du  taux  de  mutation  par  rapport  au  bruit   de  fond  mutationnel.  ...............................................................................................................................  49   Figure  21  :  Éléments  de  recherche  de  mutations  non-­‐codantes  conductrices  de  tumeurs.  ...........................  51   Figure  22  :  Profils  de  méthylation  de  cellules  normales  et  tumorales.  ...........................................................  52   Figure  23  :  Mutations  des  enzymes  épigénétiques  identifiées  dans  les  cancers.  ...........................................  55   Figure  24  :  Schéma  de  l'ADN  circulant  issu  des  cellules  tumorales.  ................................................................  56   Figure  25  :  L’ADN  circulant,  biomarqueur  clinique  de  suivi  des  tumeurs.  ......................................................  58   Figure  26  :  Anatomie  du  rein  et  cellules  à  l’origine  des  carcinomes  des  cellules  rénales  (RCC).  ....................  61   Figure  27  :  Coupes  histologiques  d'adénocarcinomes  du  rein  à  cellules  claires  et  papillaires.  ......................  61   Figure  28  :  L’anatomie  du  rein.  .......................................................................................................................  63   Figure  29  :  Altérations  génétiques  et  épigénétiques  de  la  voie  VHL/HIF  dans  le  ccRCC.  ................................  64   Figure  30  :  Modifications  génétiques  et  épigénétiques  des  enzymes  de  remodelage  de  la  chromatine  et  des   modificateurs  d’histones.  ........................................................................................................................  65   Figure  31:  Cibles  des  traitements  utilisés  contre  l’adénocarcinome  du  rein  à  cellules  claires.  ......................  68   Figure  32  :  Composition  des  récepteurs  à  facteur  de  croissance  des  fibroblastes  (FGFRs)  et  épissage   alternatif  IIIb/IIIc.  .....................................................................................................................................  69   Figure  33  :  Résumé  de  la  voie  signalétique  de  FGF/FGFR  et  des  facteurs  intra  et  extra  cellulaires  qui  la   régulent.  ...................................................................................................................................................  70   Figure  34  :  Principe  et  étapes  de  contrôles  du  ChIP.  .......................................................................................  75   Figure  35  :  Les  modifications  post-­‐traductionnelles  des  histones  démarquent  les  éléments  fonctionnels  du   génome.  ...................................................................................................................................................  76   Figure  36  :  Principe  du  FAIRE  et  étapes  de  contrôle.  ......................................................................................  80   Figure  37  :  Protocole  simplifié  et  étapes  de  contrôles  de  l'ATAC-­‐seq.  ............................................................  82   Figure  38  :  Principe  du  séquençage  Illumina/Solexa.  ......................................................................................  85   Figure  39  :  Principe  de  l'identification  de  pics.  ...............................................................................................  87   Figure  40:  Échantillons  Cagekid  dont  les  données  de  séquençage  et  d’expression  sont  disponibles.  ............  89   Figure  41  :  Méthode  d’identification  des  éléments  régulateurs  actifs  consensus  et  des  îlots  de  mutations.  90   Figure  42  :  Modèles  de  recherche  de  mutations  entraînant  l'expression  différentielle  d'un  gène  associé.  ..  91   Figure  43  :  Principe  du  pyroséquençage.  ........................................................................................................  93   Figure  44  :  Visualisation  des  étapes  de  contrôle  du  ChIP-­‐seq.  ........................................................................  95   Figure  45  :  Répartition  des  reads  des  ChIP-­‐seq  ciblant  les  modifications  d'histones  de  la  lignée  786-­‐O.  ......  96  
  10. 10.    -­‐  8  -­‐   Figure  46  :  Profils  des  marques  d’histones  au  niveau  d’un  promoteur  actif  dans  la  lignée  786-­‐O.  ................  96   Figure  47  :  Comparaison  des  données  de  ChIP-­‐seq  H3K27ac  des  échantillons  tumoral/non-­‐tumoral  de   Cagekid  et  la  lignée  786-­‐O.  ......................................................................................................................  98   Figure  48  :  Comparaison  des  données  de  ChIP-­‐seq  H3K27ac  des  deux  échantillos  du  NIH  et  de  la  lignée  786-­‐ O.  ..............................................................................................................................................................  98   Figure  49  :  Visualisation  des  profils  obtenus  au  Bioanalyzer  aux  étapes  de  contrôle  du  FAIRE-­‐seq.  ..............  99   Figure  50  :  Répartition  des  reads  de  FAIRE-­‐seq  autour  des  TSS.  ...................................................................  100   Figure  51  :  Profils  des  librairies  ATAC-­‐seq  en  fonction  de  la  concentration  en  Igepal.  .................................  102   Figure  52  :  Exemple  de  profil  de  librairie  ATAC-­‐seq  et  interprétation.  .........................................................  103   Figure  53  :  Nombre  de  reads  disponibles  après  chaque  étape  de  filtrage  des  données  des  différentes  lignées   cellulaires.  ..............................................................................................................................................  104   Figure  54  :  Répartition  des  reads  autour  du  TSS  et  en  fonction  de  leurs  tailles.  ..........................................  104   Figure  55:  Signal  ATAC-­‐seq  au  niveau  du  promoteur  d’un  gène.  ..................................................................  105   Figure  56  :  Reproductibilité  des  résultats  d’ATAC-­‐seq.  .................................................................................  105   Figure  57  :  Recoupement  des  pics  identifiés  en  ChIP-­‐seq  ciblant  H3K4me1,  H3Kme2  et  H3K4me3  dans  la   lignée  786-­‐O.  ..........................................................................................................................................  106   Figure  58  :  Identification  des  éléments  régulateurs  actifs  de  la  lignée  786-­‐O.  .............................................  107   Figure  59  :  Identification  des  éléments  régulateurs  actifs  consensus  des  trois  lignées  cellulaires.  ..............  108   Figure  60  :  Comparaison  des  co-­‐localisations  de  marques  d’histones  sur  la  lignée  cellulaire  786-­‐O  et  les   échantillons  Cagekid.  .............................................................................................................................  109   Figure  61  :  Analyse  critique  du  nombre  de    promoteurs  actifs  identifiés.  ....................................................  109   Figure  62  :  Comparaison  entre  gènes  exprimés  et  promoteurs  actifs  identifiés  des  lignées  cellulaires.  ......  110   Figure  63  :  Analyse  critique  des  promoteurs  actifs  identifiés.  ......................................................................  110   Figure  64  :  Identification  des  éléments  régulateurs  actifs  consensus  à  partir  des  données  ChIP-­‐seq  et  ATAC-­‐ seq.  .........................................................................................................................................................  112   Figure  65  :  Signaux  ChIP-­‐seq  et  îlots  de  mutations  présents  sur  les  promoteurs  de  WNT2B  et  USP28.  .......  116   Figure  66  :  Visualisation  des  signaux  de  ChIP-­‐seq  et  de  l’îlot  de  mutation  dans  un  promoteur  alternatif  de   FGF1.  ......................................................................................................................................................  116   Figure  67  :  Localisation  de  l’îlot  de  mutations  de  l’élément  régulateur  actif  dans  l’intron  d’IGF1R  et   association  avec  l’expression  d’IGF1R.  ..................................................................................................  117   Figure  68  :  Localisation  de  l’îlot  de  mutations  de  l’élément  régulateur  actif  en  aval  de  TNFSF14  et   association  des  mutations  avec  l’expression  de  TNFSF14.  ....................................................................  118   Figure  69  :  Répartition  des  mutations  localisées  dans  les  éléments  régulateurs  consensus  identifiés  par   ChIP-­‐seq  et  ATAC-­‐seq.  ............................................................................................................................  119   Figure  70  :  Visualisation  de  la  localisation  de  l’îlot  de  mutations  de  l’élément  régulateur  actif  dans  l’intron  1   de  WWC1  et  association  des  mutations  avec  l’expression  de  WWC1.  ..................................................  119   Figure  71  :  Validation  des  mutations  de  WWC1  par  pyroséquençage.  .........................................................  120   Figure  72  :  Résultats  de  la  validation  au  pyroséquençage  de  la  mutation  sur  l'élément  régulateur  actif   associé  à  TNFSF14.  .................................................................................................................................  121   Figure  73  :  Expression  RNA-­‐seq  de  WWC1  en  fonction  des  variations  du  nombre  de  copies.  .....................  122   Figure  74  :  Expression  de  WWC1  dans  les  cohortes  Cagekid  et  TCGA.  .........................................................  123   Figure  75  :  Association  entre  expression  et  paramètres  cliniques  de  WWC1  dans  la  cohorte  TCGA.  ..........  123   Figure  76  :  Expression  de  IGF1R  et  association  avec  les  paramètres  cliniques  dans  la  cohorte  TCGA.  ........  124   Figure  77  :  Expression  de  TNFSF14  dans  les  cohortes  Cagekid  et  TCGA.  ......................................................  125   Figure  78  :  Association  entre  expression  et  paramètres  cliniques  de  TNFSF14  dans  les  cohortes  TCGA  et   Cagekid.  ..................................................................................................................................................  126   Figure  79  :  Signal  des  ChIP-­‐seq  ciblant  H3K27ac  au  niveau  du  promoteur  de  TERT.  ....................................  126   Figure  80  :  Expression  de  TERT  dans  les  cohortes  Cagekid  et  TCGA.  ............................................................  128   Figure  81  :  Association  de  l'expression  de  TERT  et  des  paramètres  cliniques  dans  la  cohorte  TCGA.  ..........  129   Figure  82  :  Clusterisation  des  données  de  méthylation  des  puces  450K  sur  les  échantillons  Cagekid  et  les   lignées  cellulaires  de  RCC.  ......................................................................................................................  136   Figure  83  :  Comparaison  des  gènes  exprimés  par  les  lignées  cellulaires  de  RCC  et  les  échantillons  tumoraux   et  non-­‐tumoraux.  ...................................................................................................................................  137  
  11. 11.     -­‐  9  -­‐     Figure  84  :  Clusterisation  des  données  d’expression  de  lignées  cellulaires  issues  de  divers  types  de  tumeurs.  ...............................................................................................................................................................  137   Figure  85  :  Comparaison  du  bruit  de  fond  mutationnel  global  et  des  critères  de  recherche  d'îlots  de   mutations.  ..............................................................................................................................................  141   Figure  86  :  Altérations  moléculaires  de  la  voie  Hippo  dans  le  ccRCC.  ...........................................................  146   Figure  87  :  Expression  des  FGFRs  dans  les  échantillons  normaux  et  tumoraux.  ...........................................  159   Figure  88  :  Changement  d’expression  relatif  dans  les  échantillons  pairés  des  cohortes  Cagekid  et  TCGA.  .  160   Figure  89  :  Isoformes  IIIb  et  IIIc  de  FGFR2  dans  les  échantillons  tumoraux  et  non-­‐tumoraux  de  la  cohorte   Cagekid.  ..................................................................................................................................................  161   Figure  90  :  Hyperméthylation  du  promoteur  de  FGFR2  dans  la  cohorte  Cagekid.  .......................................  161   Figure  91  :  Expression  des  FGFs  dans  les  cohortes  Cagekid  et  TCGA.  ...........................................................  163   Figure  92  :  Confirmation  des  changements  d’expression  de  FGF1,  FGF5,  FGF7  et  FGF9  par  RT-­‐qPCR.  ........  163   Figure  93  :  Changement  d’expression  de  FGF2  dans  les  cohortes  Cagekid  et  TCGA.  ...................................  164   Figure  94  :  Changement  d’expression  de  FGF5  et  association  avec  des  paramètres  cliniques  dans  la  cohorte   TCGA.  .....................................................................................................................................................  165   Figure  95  :  Changement  d’expression  RNA-­‐seq  de  SEF  dans  les  cohortes  Cagekid  et  TCGA.  .......................  166   Figure  96  :  Confirmation  du  changement  d'expression  de  SEF  par  RT-­‐qPCR.  ...............................................  166   Figure  97  :  Association  de  l’expression  de  SEF  et  des  paramètres  cliniques.  ................................................  167   Figure  98  :  Association  du  z-­‐score  intégrant  l’expression  de  FGF5,  FGF7,  FGF17,  FGF23,  SEF  et  SPRY2  et  des   paramètres  cliniques.  .............................................................................................................................  168   Figure  99  :  Représentation  de  l’expression  des  FGF/FGFR  et  des  régulateurs  négatifs  des  cohortes  Cagekid   et  TCGA.  .................................................................................................................................................  172   Figure  100  :  Associations  des  paramètres  cliniques  avec  l’expression  des  FGFs  et  des  régulateurs  des  FGFs   des  données  TCGA.  ................................................................................................................................  175   Figure  101  :  Corrélation  entre  expression  des  ARNm  et  des  protéines.  .......................................................  176   Figure  102  :  Annotation  des  CpG  dans  les  données  de  puces  450K.  .............................................................  186   Figure  103  :  Validation    de  la  méthylation  des  biomarqueurs  par  pyroséquençage.  ....................................  186   Figure  104  :  Optimisation  de  la  qPCR  méthylation-­‐spécifique  PPFIA4  en  FAM.  ...........................................  187   Figure  105  :  Signal  qPCR  du  triplex  ALB  (FAM)/PRKCB(LC670)/TFAP2B  amp1  (LC610).  ................................  188   Figure  106  :  Nombre  d’échantillons  non-­‐tumoraux  dont  la  méthylation  est  significative.  ...........................  189   Figure  107  :  Nombre  d’échantillons  tumoraux  dont  la  méthylation  est  supérieure  à  différents  seuils.  ......  190   Figure  108  :  Corrélations  entre  β-­‐valeurs  associées  aux  CpG  sélectionnés.  .................................................  190   Figure  109  :  Nombre  d’échantillons  tumoraux  méthylés  sur  1  à  6  des  CpG  sélectionnés  dans  le  test   MethyLight.  ............................................................................................................................................  191   Figure  110  :  Comparaison  des  kits  d'extraction  InnuConvert  et  Norgen  sur  du  plasma  sain.  .......................  191   Figure  111  :  Comparaison  des  rendements  de  l'étape  de  bisulfite  de  l’ADN  circulant.  ................................  192   Figure  112  :  Comparaison  des  rendements  finaux  d’extraction  et  bisulfite  de  l’ADN  circulant.  ..................  192   Figure  113  :  Répartition  des  mutations  non-­‐synonymes  sur  la  protéine  VHL  dans  le  ccRCC.  .......................  195   Figure  114  :  Méthylation  du  cg18674980  (CA3)  dans  différents  types  de  tumeurs.  ....................................  198   Figure  115  :  Pourcentage  de  patients  avec  une  quantité  d'ADN  circulant  détectable  dans  différents  types  de   cancers  avancés.  ....................................................................................................................................  199        
  12. 12.    -­‐  10  -­‐      
  13. 13.     -­‐  11  -­‐     Liste  des  tableaux   Tableau  1  :  Techniques  expérimentales  d’étude  de  l’épigénome.  .................................................................  38   Tableau  2  :  Kits  de  détection/prédiction  basés  sur  des  biomarqueurs  de  méthylation.  ................................  53   Tableau  3  :  Kits  de  détection  de  cancers  basés  sur  la  méthylation  de  l'ADN  circulant  actuellement   commercialisés.  .......................................................................................................................................  59   Tableau  4  :  Classification  TNM  des  tumeurs  rénales.  .....................................................................................  62   Tableau  5  :  Attribution  des  stades  en  fonction  des  critères  TNM  du  cancer  du  rein.  .....................................  63   Tableau  6  :  Thérapies  ciblant  la  voie  FGF/FGFR  en  cours  d’essais  thérapeutiques  dans  le  traitement  des  RCC.  .................................................................................................................................................................  68   Tableau  7  :  Anticorps  utilisés  pour  les  immunoprécipitations:  références  et  quantités.  ................................  77   Tableau  8  :  Amorces  de  PCR  utilisées  pour  les  qPCR  de  contrôle  d’enrichissement  des   immunoprécipitations.  .............................................................................................................................  78   Tableau  9  :  Amorces  d’amplification  PCR  et  de  pyroséquençage  utilisées  pour  les  validations  de  mutations.  .................................................................................................................................................................  94   Tableau  10  :  Pics  identifiés  par  ChIP-­‐seq  ciblant  différentes  marques  d’histones.  .........................................  97   Tableau  11  :  Pics  identifiés  en  FAIRE-­‐seq  et  reproductibilité  dans  les  différentes  lignées  de  RCC.  ..............  101   Tableau  12  :  Calculs  des  rendements  des  extractions  FAIRE  des  différentes  lignées  de  RCC.  ......................  101   Tableau  13  :  Identification  des  pics  ATAC-­‐seq  dans  les  lignées  cellulaires.  ..................................................  105   Tableau  14  :  Identification  des  éléments  régulateurs  actifs  par  les  marques  d’histones  des  différentes   lignées  cellulaires.  ..................................................................................................................................  107   Tableau  15  :  Motifs  de  facteurs  de  transcription  enrichis  dans  les  éléments  régulateurs  actifs  identifiés.  .  111   Tableau  16  :  Identification  des  éléments  régulateurs  actifs  par  présence  des  marques  d’histones  et  du  signal   ATAC-­‐seq.  ...............................................................................................................................................  112   Tableau  17  :  Motifs  de  facteurs  de  transcription  enrichis  dans  les  éléments  régulateurs  actifs  identifiés.  .  113   Tableau  18  :  Mutations  somatiques  de  95  échantillons  de  ccRCC  à  travers  le  génome  et  sur  les  éléments   régulateurs  actifs.  ..................................................................................................................................  114   Tableau  19  :  Nombre  d’îlots  de  mutations  identifiés  dans  les  éléments  régulateurs  actifs  des  ccRCC.  .......  115   Tableau  20  :  Liste  des  gènes  associés  aux  cancers  urogénitaux  et  dont  un  élément  régulateur  contenant  un   îlot  de  mutations  est  situé  à  proximité  du  TSS.  .....................................................................................  115   Tableau  21  :  Nombre  d’îlots  de  mutations  associés  à  un  changement  d’expression  d’un  gène  situé  à  une   distance  déterminée.  .............................................................................................................................  117   Tableau  22  :  Nombre  et  répartition  des  mutations  somatiques  totales  et  localisées  sur  les  éléments   régulateurs  actifs  identifiés  par  ChIP-­‐seq  et  ATAC-­‐seq.  .........................................................................  118   Tableau  23  :  Scores  de  conservation  et  motifs  de  liaison  créés  par  les  mutations  de  l’élément  régulateur  de   WWC1.  ...................................................................................................................................................  123   Tableau  24  :  Scores  de  conservation  et  motifs  de  liaison  créés  par  les  mutations  de  l’élément  régulateur  de   IGF1R.  .....................................................................................................................................................  124   Tableau  25  :  Données  qualitatives  associées  aux  mutations  du  promoteur  de  TERT.  ..................................  127   Tableau  26  :  Expression  des  échantillons  mutés  dans  le  promoteur  de  TERT  et  interprétation.  .................  128   Tableau  27  :  Nombre  de  données  utilisées  pour  l’analyse  des  dérégulations  du  système  FGF/FGFR.  .........  152   Tableau  28  :  Données  cliniques  associées  aux  échantillons  tumoraux  séquencés  en  RNA-­‐seq.  ..................  153   Tableau  29  :  Liste  des  amorces  de  qPCR.  ......................................................................................................  155   Tableau  30  :  Amorces  de  PCR  et  de  pyroséquençage.  ..................................................................................  157   Tableau  31  :  Expression  RNA-­‐seq  des  FGF/FGFRs,  des  FHFs  et  des  régulateurs  SEF  et  SPRY2  dans  les   cohortes  Cagekid  et  TCGA.  .....................................................................................................................  170   Tableau  32  :  Liste  des  amorces  et  sondes  utilisées  pour  les  qPCR  MethyLight.  ...........................................  182   Tableau  33  :  Séquences  des  amorces  et  sondes  utilisées  pour  la  quantification  de  l’ADN  bisulfité.  ............  184   Tableau  34  :  Liste  des  biomarqueurs  hyperméthylés  retenus  après  analyse  des  données  de  puces  450K.  .  185   Tableau  35  :  Liste  des  qPCR  méthylation-­‐spécifique  validées.  ......................................................................  187   Tableau  36  :  Longueurs  d'onde  d'excitation  et  d'émission  des  sondes  FAM,  LC610  et  LC670  sur  Light  Cycler   480.  ........................................................................................................................................................  188   Tableau  37  :  qPCR  optimisées  en  triplex.  ......................................................................................................  189  
  14. 14.    -­‐  12  -­‐   Tableau  38  :  Concentration  en  ADN  circulant  de  plasma  ou  sérum  de  patients  sains  ou  atteints  d’un  RCC   localisé  ou  métastatique.  .......................................................................................................................  199    
  15. 15.     -­‐  13  -­‐     Abréviations  et  acronymes   3C  :  Chromosome  Conformation  Capture   4C  :  Circular  Chromosome  Conformation  Capture   5C  :  Carbon-­‐Copy  Chromosome  Conformation  Capture   5CaC  :  5  carboxylcytosine   5fC  :  5  formylcytosine   5hmC  :  5  hydroxyméthylcytosine   5mC  :  5  méthyl  cytosine   A  :  adénine   Ac  :  acétyl   ADN  :  acide  désoxyribonucléique   ARN  :  acide  ribonucléique   ARNm  :  ARN  messager   ARNe  :  ARN  codé  par  un  enhancer     ATAC-­‐seq  :  Assay  of  Transposase  Accessible  Chromatin  Sequencing   ATP  :  adénosine  triphosphate   C  :  cytosine   ccRCC  :  adénocarcinome  du  rein  à  cellules  claires   ChIA-­‐PET  :  Chromatin  Interaction  Analysis  by  Paired-­‐End  Tag  sequencing   ChIP-­‐seq  :  Chromatin  Immuno-­‐Precipitation  Sequencing   chr  :  chromosome   chRCC  :  adénocarcinome  du  rein  chromophobe   CIMP  :  CpG  Island  Methylator  Phenotype   CNV  :  variation  du  nombre  de  copies   CpG  :  nucléotide  C  suivi  d’un  nucléotide  G   CT  :  territoire  chromosomique   DNaseI-­‐seq  :  DNase  I  hypersensitive  sites  sequencing  
  16. 16.    -­‐  14  -­‐   DNMT  :  ADN  méthyltransférase   ETS  :  E-­‐Twenty-­‐Six   FAIRE-­‐seq  :  Formaldheyde  Assisted  Isolation  of  Regulatory  Elements  Sequencing   FGF  :  facteur  de  croissance  des  fibroblastes   FGFR  :  récepteur  de  croissance  des  fibroblastes   G  :  guanine   GTF  :  facteur  général  de  la  transcription   GWAS  :  étude  d’association  pangénomique   H  :  histone   HAT  :  histone  acétyltransférase   HDAC  :  histone  désacétylase   Hi-­‐C  :  étude  des  interactions  de  la  chromatine  à  l’échelle  du  génome   HMT  :  histone  méthyltransférase   IC  :  compartiment  inter-­‐chromatinien   K  :  lysine   kb  :  kilo  paires  de  bases   KDM  :  histone  déméthylase   MBD  :  methyl-­‐binding  domain   Me  :  méthyl   MeDIP-­‐seq  :  Methylated  DNA  ImmunoPrecipitation  Sequencing     MNase-­‐seq  :  Micrococcal  Nuclease  digestion  followed  by  Sequencing   p  :  p-­‐valeur  de  test  statistique   pb  :  paire  de  bases   PCR  :  réaction  en  chaîne  par  polymérase   PIC  :  complexe  de  pré-­‐initiation  de  la  transcription   pRCC  :  adénocarcinome  du  rein  papillaire   qPCR  :  réaction  en  chaîne  par  polymérase  quantitative   RCC  :  adénocarcinome  du  rein  
  17. 17.     -­‐  15  -­‐     RNA-­‐seq  :  séquençage  de  l’ARN     RPKM  :  Read  Per  Kilo  per  Million  map  reads   SAM  :  adénosylméthionine   SNP  :  single  nucleotide  polymorphism   SONO-­‐seq  :  SONication  of  cross-­‐linked  chromatin  Sequencing   T  :  thymine   TDG  :  thymine  DNA  glycosylase   TF  :  facteur  de  transcription   TSS  :  site  de  démarrage  de  la  transcription   UTR  :  région  non  traduite   WGBS  :  whole  genome  bisulfite  sequencing   WGS  :  séquençage  pangénomique          
  18. 18.    -­‐  16  -­‐      
  19. 19.     -­‐  17  -­‐     Introduction     Cette  dernière  décennie,  l’avènement  du  séquençage  haut  débit  a  permis  d’améliorer  considérablement  la   caractérisation  des  altérations  génétiques  et  épigénétiques  des  tumeurs.  L’accumulation  de  ces  nouvelles   connaissances  permet  de  mieux  comprendre  les  processus  biologiques  menant  à  la  tumorigenèse  et  a  un   impact  grandissant  dans  la  capacité  à  diagnostiquer,  traiter  et  prévenir  les  cancers.     Parmi  les  nouveaux  cas  de  cancers  diagnostiqués  chaque  année  dans  le  monde,  330  000  sont  des  cancers   du  rein,  dont  la  majorité  sont  des  adénocarcinomes  du  rein  à  cellules  claires  (ccRCC).  La  mise  en  œuvre   d’études  génétiques  et  épigénétiques  du  ccRCC  a  permis  la  découverte  de  voies  de  signalisation  impliquées   dans  l’initiation  et  la  progression  tumorale  et  la  mise  au  point  de  thérapies  ciblées.  L’identification  du  lien   entre  les  altérations  du  gène  VHL  et  l’activation  de  l’angiogenèse  a  abouti  au  développement  de  thérapies   anti-­‐angiogéniques.   De   même,   l’activation   de   la   voie   mTOR   dans   le   ccRCC   fait   l’objet   de   stratégies   thérapeutiques   ciblées.   Bien   que   les   patients   répondent   souvent   positivement   à   ces   thérapies,   des   résistances  apparaissent  rapidement  et  la  maladie  finit  par  progresser  [1,  2].  Approfondir  la  caractérisation   moléculaire  des  ccRCC  constitue  donc  un  enjeu  majeur  pour  améliorer  la  prise  en  charge  des  malades.   Cette  thèse  s’inscrit  dans  ce  contexte  et  se  compose  de  trois  projets  qui  visent  à  poursuivre  l’identification   des  altérations  moléculaires  caractérisant  le  ccRCC  et  à  établir  de  nouveaux  marqueurs  de  diagnostic.   Le   premier   projet   cherche   à   identifier   de   nouveaux   évènements   génétiques   impliqués   dans   la   tumorigénèse.   Bien   que   les   mutations   de   l’ADN   codant   aient   été   largement   étudiées   sur   différentes   cohortes   de   centaines   d’échantillons   de   ccRCC,   les   mutations   affectant   l’ADN   non-­‐codant   n’ont   jusqu’à   présent  pas  été  explorées  [3-­‐5].  Or,  la  plupart  des  mutations  somatiques  des  cancers  se  trouvent  dans  ces   régions  et  peuvent  affecter  de  nombreux  éléments  régulateurs  de  la  transcription  [6].  Le  premier  projet  de   cette  thèse  a  donc  pour  but  d’identifier  des  mutations  non-­‐codantes  localisées  sur  les  éléments  régulateurs   actifs  du  ccRCC.   Le  deuxième  projet  propose  d’analyser  les  altérations  moléculaires  d’une  voie  de  signalisation  qui  est  la   cible  de  traitements  en  cours  de  tests  cliniques  dans  le  ccRCC  :  la  voie  FGF/FGFR  [7].  Bien  qu’elle  soit  l’objet   de  thérapies  ciblées,  très  peu  d’études  ont  analysé  les  dérégulations  de  cette  voie  dans  le  ccRCC  et  aucune   ne  l’a  faite  sur  l’ensemble  des  gènes  de  cette  famille.  Le  deuxième  projet  de  cette  thèse  consiste  donc  en   l’étude  systématique  des  altérations  moléculaires  affectant  les  membres  composant  la  famille  FGF/FGFR  et   les  régulateurs  négatifs  de  la  voie  qu’ils  activent,  sur  des  centaines  d’échantillons  de  ccRCC.   Enfin,  le  troisième  projet  consiste  à  la  mise  au  point  d’un  test  de  diagnostic  non-­‐invasif  qui  permettrait  de   dépister  le  ccRCC  à  des  stades  plus  précoces.  L’ADN  circulant,  présent  dans  le  plasma  sanguin,  peut  être   utilisé  comme  biomarqueur  des  tumeurs  car  il  comporte  les  modifications  génétiques  et  épigénétiques  des   cellules  tumorales  dont  il  est  issu  [8].  Le  troisième  projet  de  cette  thèse  consiste  ainsi  au  développement  
  20. 20.    -­‐  18  -­‐   d’un  test  de  diagnostic  basé  sur  la  détection  sensible  de  biomarqueurs  de  méthylation  de  l’ADN  circulant  de   patients  atteints  de  ccRCC.       Avant  de  décrire  les  résultats  de  ces  trois  projets,  le  premier  chapitre  est  consacré  à  la  mise  en  contexte  de   cette  thèse.    
  21. 21.    -­‐  19 - Chapitre  I  :  Mise  en  contexte  des  projets   1.  Organisation  de  la  chromatine  et  régulation  de  la  transcription  .............................................  20   1.1.  De  l’ADN  à  la  chromatine  .....................................................................................................................  20   1.2.  L’ADN  non-­‐codant  ................................................................................................................................  24   1.3.  Les  mécanismes  épigénétiques,  régulateurs  de  la  transcription  .........................................................  27   1.4.  Cartographie  des  éléments  régulateurs  du  génome  ...........................................................................  36   2.  Les  cancers  :  caractéristiques  biologiques,  génétique,  épigénétique  ......................................  40   2.1.  Caractéristiques  fondamentales  des  cancers  ......................................................................................  40   2.2.  Génétique  des  cancers  .........................................................................................................................  45   2.3.  Epigénétique  des  cancers  ....................................................................................................................  51   2.4.  Interactions  entre  modifications  génétiques  et  épigénétiques  ...........................................................  54   2.5.  Les  consortia  de  génétique  et  épigénétique  des  cancers  ....................................................................  55   2.6.  L’ADN  circulant  comme  biomarqueur  génétique  ou  épigénétique  de  cancer  .....................................  56   3.  L’adénocarcinome  du  rein  à  cellules  claires  ............................................................................  60   3.1.  Epidémiologie  et  classification  .............................................................................................................  60   3.2.  Diagnostic  ............................................................................................................................................  62   3.3.  Modifications  génétiques  et  épigénétiques  du  cancer  du  rein  ............................................................  63   3.4.  Le  consortium  Cagekid  .........................................................................................................................  66   3.5.  Traitements  actuels  .............................................................................................................................  66   3.6.  La  voie  FGF/FGFR  .................................................................................................................................  68   4.  Sujet  de  thèse  ........................................................................................................................  71      
  22. 22. Chapitre  I  :  Mise  en  contexte  des  projets    -­‐  20  -­‐     1. Organisation  de  la  chromatine  et  régulation  de  la   transcription   L’étude  de  la  structure  chromatinienne  et  son  implication  dans  la  régulation  de  l’expression  des  gènes  est   un  domaine  de  recherche  en  plein  essor.  L’objectif  de  cette  partie  est  de  poser  les  bases  nécessaires  à  la   compréhension  de  ces  mécanismes  épigénétiques.     1.1. De  l’ADN  à  la  chromatine   1.1.1. L’ADN,  molécule  clé  du  vivant   Les  cellules  somatiques  eucaryotes  contiennent  approximativement  six  milliards  de  paires  de  bases  d’ADN,   ce  qui  correspond  à  une  longueur  théorique  de  deux  mètres  d’ADN.  L’intégrité  de  ce  matériel  est  contenu   dans  le  noyau,  dont  le  diamètre  est  d’environ  dix  à  vingt  microns,  ce  qui  implique  une  compaction  extrême   de   l’ADN   [9].   Pour   celà,   l’ADN   s’associe   à   des   protéines,   les   histones,   qui   sont   en   charge   d’organiser   le   contenu  nucléaire  en  une  structure  dense,  appelée  chromatine  [10].     1.1.2. L’organisation  de  la  chromatine   L’organisation  de  la  chromatine  comporte  différents  niveaux  [11]  (Figure  1).     Au   niveau   de   l’organisation   primaire   de   la   chromatine,   l’ADN   est   compacté   en   nucléosomes,   unités   fondamentales  de  la  chromatine,  comprenant  chacun  147  paires  de  bases  d’ADN  enroulées  autour  d’un   octamère  d’histones  et  un  ADN  de  liaison  au  nucléosome  suivant  [12].  L’octamère  d’histones  est  composé   de   deux   copies   des   histones   H2A,   H2B,   H3   et   H4.   Ces   histones   sont   de   petites   protéines   extrêmement   conservées   au   cours   de   l’évolution   comportant   un   domaine   central   et   des   extrémités   qui   sortent   du   nucléosome   et   qui   sont   le   siège   de   diverses   modifications   post-­‐traductionnelles   (décrites   en   §1.3.2).   La   structure  primaire  en  «  collier  de  perles  »  constituée  de  l’enchaînement  des  nucléosomes  a  un  diamètre  de   11  nm  et  constitue  le  premier  niveau  de  compactage  de  la  chromatine  [11].   En  plus  de  l’enroulement  de  la  molécule  d’ADN  autour  de  l’octamère  d’histones,  la  compaction  peut  être   rendue  encore  plus  forte  par  la  liaison  de  l’histone  H1  au  nucléosome  et  à  l’ADN  de  liaison.  Cette  structure   de  30  nm  de  diamètre  forme  la  fibre  de  chromatine  [13].   Le  repliement  de  la  fibre  de  chromatine  à  un  niveau  de  compaction  supérieur  forme  une  fibre  de  300  nm   de   diamètre   comprenant   des   boucles   de   chromatine.   Enfin,   les   niveaux   supérieurs   d’organisation   de   la   chromatine  conduisent  à  la  formation  de  chromosomes  (Figure  1).    
  23. 23.   Organisation  de  la  chromatine  et  régulation  de  la  transcription     -­‐  21  -­‐       Figure  1  :  De  l’ADN  aux  chromosomes.     La   double   hélice   d’ADN   s’enroule   autour   d’histones,   pour   former   des   nucléosomes.   La   succession   de   nucléosomes  forme  une  structure  en  «  collier  de  perles  »  de  11  nm  de  diamètre.  A  un  niveau  supérieur,  la   compaction   est   rendue   plus   forte   pour   former   la   fibre   de   chromatine   de   30   nm   de   diamètre.   Enfin,   des   repliements  successifs  forment  des  chromosomes.  Figure  adaptée  de  [11].   1.1.3. Euchromatine  et  hétérochromatine   A  la  fin  de  la  mitose,  la  chromatine  jusqu’à  alors  condensée  sous  forme  de  chromosomes  bien  visibles  se   décondense  partiellement.  La  chromatine  décondensée  est  alors  appelée  euchromatine  et  comprend  des   domaines  de  chromatine  active.  Elle  est  riche  en  gènes  et  a  une  structure  ouverte  qui  la  rend  relativement   accessible  aux  enzymes  nécessaires  à  la  transcription,  telles  que  l’ARN  polymérase  II.  Au  contraire,  une  part   de  cette  chromatine  reste  fortement  condensée  ;  elle  est  appelée  l’hétérochromatine.  Elle  est  pauvre  en   gènes  et  peu  accessible  à  la  transcription  [14]  (Figure  2).     Figure  2  :  Euchromatine  et  hétérochromatine.   L’euchromatine   est   la   configuration   ouverte   de   la   chromatine,   accessible   à   la   machinerie   transcriptionnelle   dont   l’ARN   polymérase   II.   Au   contraire,   l’hétérochromatine   est   une   forme   condensée   de   la   chromatine,   associée  à  un  état  répressif  de  la  transcription.   L’hétérochromatine  constitutive  est  définie  comme  la  chromatine  qui  reste  condensée  dans  tous  les  types   cellulaires.   Elle   se   trouve   généralement   au   niveau   des   centromères   et   télomères   des   chromosomes.   Au   contraire,   l’hétérochromatine   facultative   est   définie   comme   de   l’euchromatine   qui   est   mise   en   silence   dans  certains  types  cellulaires  ou  à  certains  stades  du  développement  [14].     feature NATURE | VOL421 | 23 JANUARY2003 | www.nature.com/nature 449 may facilitate gene activation, by promoting specific structural interactions between distal sequences, or repression, by occluding bindingsitesfor transcriptionalactivators. We suggest that the function of archaeal histones reflects their ancestral function, and therefore that chromatin evolved originally asan important mechanism for regulatinggeneexpression. Itsusein packaging DNA was an ancillary benefit that was recruited for the more complex nucleosome structure that subsequently evolved in the ancestors of modern eukaryotes, which had expanded genome sizes. Although their compactness might seem to suggest inertness, chromatin structures are in fact a centre for a range of biochemical activities that are vital to the control of gene expression, as well as DNAreplication and repair. Packaging DNAinto chromatin The fundamental subunit of chromatin is the nucleosome, which consistsofapproximately165basepairs(bp) ofDNAwrapped in two superhelical turns around an octamer of core histones (two each of histones H2A, H2B, H3 and H4). This results in a five- to tenfold compaction of DNA6 . The DNA wound around the surface of the histone octamer (Fig. 1) is partiallyaccessible to regulatoryproteins, but could become more available if the nucleosome could be moved out of the way, or if the DNApartlyunwound from the octamer. The histone ‘tails’ (the amino-terminal ends of the histone protein chains) are also accessible, and enzymescan chemicallymodifythese tails to promote nucleosome movement and unwinding, with profound localeffectson thechromatin complex. Each nucleosome is connected to its neighbours by a short segment of linker DNA (~10–80 bp in length) and this polynucleo- somestringisfolded into a compact fibrewith a diameter of~30nm, producing a net compaction of roughly 50-fold. The 30-nm fibre is stabilized by the binding of a fifth histone, H1, to each nucleosome and to its adjacent linker. There is still considerable debate about the finer points of nucleosome packing within the chromatin fibre, and even less is known about the way in which these fibres are further packed within thenucleusto form thehighest-order structures. Chromatin regulates gene expression Regulatory signals entering the nucleus encounter chromatin, not DNA, and the rate-limiting biochemical response that leads to activation of gene expression in most cases involves alterations in chromatin structure. Howaresuch alterationsachieved? The most compact form of chromatin is inaccessible and therefore provides a poor template for biochemical reactions such as transcription, in which the DNAduplex must serve as a template for RNA polymerase. Nucleosomes associated with active genes were shown to be more accessible to enzymes that attack DNAthan those associated with inactive genes7 , which is consistent with the idea that activation of gene expression should involve selective disruption of thefolded structure. Cluesastohowchromatin isunpackedcamefrom thediscoverythat componentsofchromatin are subject to a wide range ofmodifications that are correlated with gene activity. Such modifications probably occur at everylevel of organization, but most attention has focused on thenucleosomeitself.Therearethreegeneralwaysin which chromatin structurecan bealtered.First,nucleosomeremodellingcan beinduced by complexes designed specifically for the task8 ; this typically requires that energybeexpended byhydrolysisofATP.Second,covalent modifi- cation of histones can occur within the nucleosome9 . Third, histone variantsmayreplaceoneor moreofthecorehistones10–12 . Some modifications affect nucleosome structure or lability directly, whereas others introduce chemical groups that are recog- nized byadditionalregulatoryor structuralproteins. Stillothersmay be involved in disruption of higher-order structure. In some cases, the packaging of particular genes in chromatin is required for their expression13 . Thus, chromatin can beinvolved in both activation and repression ofgeneexpression. Chromatin remodelling Transcription factorsregulateexpression bybindingto specificDNA control sequences in the neighbourhood of a gene. Although some DNA sequences are accessible either as an outward-facing segment on the nucleosome surface, or in linkersbetween nucleosomes, most 30-nm chromatin fibre of packed nucleosomes Section of chromosome in an extended form Condensed section of chromosome Entire mitotic chromosome Centromere Short region of DNA double helix 2 nm 11 nm 700 nm 1,400 nm 30 nm 300 nm "Beads on a string" form of chromatin a b Figure1PackagingDNA. a, Theorganizationof DNAwithinthechromatinstructure. Thelowest level of organizationisthenucleosome, inwhichtwosuperhelical turnsof DNA(atotal of 165basepairs)arewoundaroundtheoutsideof ahistoneoctamer. Nucleosomesareconnectedtooneanother byshort stretchesof linker DNA. At the next level of organizationthestringof nucleosomesisfoldedintoafibreabout 30nm indiameter, andthesefibresarethenfurther foldedintohigher-order structures. At levelsof structurebeyondthenucleosomethedetailsof foldingarestill uncertain. (Redrawnfromref. 41, withpermission). b, Thestructureof thenucleosomecore particlewasuncoveredbyX-raydiffraction, toaresolutionof 2.8Å(ref. 42). It shows theDNAdoublehelixwoundaroundthecentral histoneoctamer. Hydrogenbonds andelectrostaticinteractionswiththehistonesholdtheDNAinplace. © 2003 Nature Publishing Group Double(hélice( d’ADN( Structure(en( «(collier(de( perles(»( Fibre(de( chroma5ne( ( Boucles(de( chroma5ne( Sec5on(de( chroma5ne( condensée( Chromosome( centromère( ARN( pol(II( euchroma5ne( hétérochroma5ne(
  24. 24. Chapitre  I  :  Mise  en  contexte  des  projets    -­‐  22  -­‐   1.1.4. Organisation  des  chromosomes  dans  le  noyau   Les  chromosomes  sont  contenus  dans  un  noyau.  Ce  dernier  n’est  pas  seulement  un  organite  permettant  de   séparer  le  génome  du  cytoplasme,  il  joue  également  un  rôle  important  dans  l’organisation  de  la  chromatine   et  la  régulation  de  l’expression.   Le  noyau  est  délimité  par  une  double  membrane  nucléaire.  Accolée  à  sa  face  interne,  se  trouve  la  lamina,   ensemble  de  filaments  intermédiaires,  de  lamines  et  d’autres  protéines,  essentiel  dans  l’organisation  de  la   chromatine  [15].  Elle  est  impliquée  dans  la  régulation  de  l’expression  des  gènes  en  interagissant  avec  de   nombreux  régulateurs  transcriptionnels  et  participe  à  l’organisation  de  l’hétérochromatine.  Les  domaines   associés  à  la  lamina  sont  donc  des  domaines  où  la  chromatine  se  trouve  sous  forme  d’hétérochromatine,   tels  que  les  centromères,  télomères  ou  les  gènes  dont  la  transcription  est  réprimée  [15].  Ces  domaines  se   retrouvent  donc  préférentiellement  en  périphérie  du  noyau  [15]  (Figure  3).       Figure  3  :  Organisation  de  la  chromatine  dans  le  noyau.   Au   niveau   de   la   lamina,   se   trouvent   des   domaines   d’hétérochromatine.   L’euchromatine   se   trouve   préférentiellement  vers  le  centre  du  noyau.   Hormis  la  localisation  périphérique  de  l’hétérochromatine,  l’arrangement  chromosomique  dans  le  noyau   est  également  organisé  de  manière  non  aléatoire.  A  l’interphase,  les  chromosomes  occupent  des  régions   discrètes  dans  le  noyau,  appelées  territoires  chromosomiques  chacun  contenant  un  seul  chromosome  [16].     L’agencement  des  territoires  chromosomiques  les  uns  par  rapport  aux  autres  n’est  pas  aléatoire.  Les  petits   chromosomes  sont  préférentiellement  situés  vers  l’intérieur  du  noyau  et  les  chromosomes  plus  grands  vers   la   périphérie   [17].   Le   contenu   nucléaire   est   également   important   puisqu’à   taille   égale,   un   chromosome   pauvre  en  gènes  (comme  le  chromosome  18)  est  situé  plus  en  périphérie  qu’un  autre  plus  riche  en  gènes   (comme  le  chromosome  19)  [18]  (Figure  4).  Cette  constatation  est  tout  de  même  nuancée  par  le  fait  que   l’agencement  des  territoires  chromatiniens  peut  varier  d’un  type  cellulaire  à  l’autre  [19].     Hétérochroma5ne(( lamina( chroma5ne( noyau( hétérochroma5ne( euchroma5ne(
  25. 25.   Organisation  de  la  chromatine  et  régulation  de  la  transcription     -­‐  23  -­‐       Figure  4  :  Territoires  chromosomiques  et  agencement  radial  dans  le  noyau.     Les  chromosomes  sont  arrangés  en  territoires  chromosomiques  au  sein  du  noyau  ;  chaque  territoire  contenant   un  chromosome.  L’agencement  radial  au  sein  du  noyau  est  dépendant  de  la  taille  et  de  la  richesse  en  gènes  des   chromosomes.   Au  sein  d’un  territoire  chromosomique,  la  localisation  des  gènes  semble  également  être  liée  à  l’expression,   les  gènes  transcriptionnellement  actifs  étant  préférentiellement  localisés  en  périphérie  du  territoire  [20].   L’hypothèse   actuelle   serait   que   cette   organisation   favoriserait   les   interactions   inter-­‐chromosomiques.   Deux  modèles  sont  actuellement  proposés  pour  décrire  ces  interactions  (Figure  6).     Le   modèle   CT-­‐IC   (chromosome   territory-­‐interchromatin   compartment)   décrit   deux   compartiments   principaux  :   les   territoires   chromosomiques   (CTs)   et   le   compartiment   interchromatinien   (IC).   Dans   ce   modèle,  les  territoires  chromosomiques  sont  séparés  par  le  compartiment  interchromatinien  qui  forme  des   canaux  riches  en  complexes  nécessaires  à  la  transcription  des  gènes  mais  également  à  la  réplication  [21].   Des  boucles  de  chromatine  contenant  des  gènes  actifs  s’étendent  à  l’extérieur  des  territoires  dans  l’espace   inter-­‐chromatinien  et  offrent  la  possibilité  d’interactions  inter-­‐chromosomiques  [22].   Le  modèle  ICN  (Inter-­‐Chromatin  Network)  propose  des  zones  de  recouvrement  dans  lequels  les  fibres  de   chromatine  de  territoires  voisins  sont  étroitement  associées.  Dans  ce  modèle,    les  protéines  nécessaires  à   la  transcription  et  à  la  réplication  diffusent  librement  entre  les  boucles  de  chromatine.       Figure  5  :  Les  modèles  d’interactions  entre  territoires  chromosomiques.   Deux  modèles  ont  été  proposés  pour  décrire  les  interactions  entre  territoires  chromosomiques  voisins  (CT).  A.   Le  modèle  CT-­‐IC  propose  une  séparation  des  territoires  par  un  espace  inter-­‐chromatinien  (IC),  où  se  trouvent   les   complexes   nécessaires   à   la   transcription   (TF).   B.   Le   modèle   ICN   propose   un   recouvrement   partiel   des   territoires   chromatiniens   et   une   absence   d’espace   inter-­‐chromatinien.   Figure   issue   du   site   http://www.mechanobio.info/.     Richesse(en(gènes(Taille(des(chromosomes(
  26. 26. Chapitre  I  :  Mise  en  contexte  des  projets    -­‐  24  -­‐   Dans   cette   partie,   l’organisation   de   la   chromatine   a   été   décrite   et   mise   en   lien   avec   l’activité   transcriptionnelle  de  gènes.  La  partie  suivante  se  recentre  sur  la  molécule  d’ADN  et  plus  particulièrement   sur  les  éléments  non-­‐codants  qui  entrent  en  jeu  dans  la  régulation  de  la  transcription.     1.2. L’ADN  non-­‐codant   1.2.1. L’ADN  codant,  par  opposition  à  l’ADN  non-­‐codant   L’ADN  est  composé  de  régions  codantes  et  de  régions  non-­‐codantes.     Les  régions  codantes  de  l’ADN  sont  définies  comme  les  régions  du  génome  qui  codent  pour  des  protéines.   Elles  consistent  en  des  séquences  de  nucléotides  qui  correspondent  à  des  séquences  d’acides  aminés  de   protéines.  Ces  portions  codantes,  constituées  d’exons,  sont  interrompues  par  des  sections  non  codantes,   les  introns,  l’ensemble  formant  un  gène.   Le  génome  humain  comporte  près  de  21  000  gènes  différents  codant  pour  des  protéines  [6].  Ces  régions   codantes  représentent  seulement  1,5  à  2,5  %  du  génome  [23,  24]  et  sont  fortement  conservées  entre  les   espèces  [25].  Le  reste  du  génome  est  appelé  ADN  non-­‐codant.     1.2.2. L’ADN  non-­‐codant,  ADN  poubelle  ?   L’ADN   non-­‐codant   représente   environ   98   %   du   génome   humain   [24]   et   a   longtemps   été   appelé   «  ADN   poubelle  »  car  il  était  considéré  comme  non-­‐fonctionnel  [26,  27].  C’est  une  des  raisons  pour  laquelle  les   études  de  génomique  étaient  alors  centrées  sur  l’analyse  des  régions  codantes.     Cependant,  l’existence  de  séquences  conservées  dans  les  régions  non-­‐codantes  implique  qu’elles  aient  été   sous  pression  de  sélection,  ce  qui  est  généralement  signe  de  fonctionnalité  [28-­‐30].     Parmi   les   fonctionnalités   décrites   de   l’ADN   non-­‐codant,   on   retrouve   des   éléments   impliqués   dans   la   reconnaissance  de  la  machinerie  transcriptionnelle  et  des  facteurs  de  transcription  tels  que  les  promoteurs,   les  enhancers,  les  silencers  et  les  insulators.  L’ADN  non-­‐codant  contient  également  des  séquences  qui  sont   transcrites  en  molécules  d’ARN  non-­‐codantes  mais  fonctionnelles  telles  que  les  ARNs  de  transfert,  ARNs   ribosomaux,   micro-­‐ARNs   et   longs   ARNs   non-­‐codants.   Enfin,   d’autres   éléments   fonctionnels   composent   l’ADN   non-­‐codant   tels   que   les   séquences   répétées   jouant   un   rôle   structural   à   l’échelle   chromosomique   (télomères,  centromères),  les  introns  et  les  origines  de  réplication  [23]  (Figure  6).     Dans  le  cadre  de  ce  travail,  le  sujet  d’intérêt  se  portera  principalement  sur  les  promoteurs  et  les  enhancers.     1.2.3. Les  promoteurs   Un  promoteur  est  une  séquence  d’ADN  située  en  amont  de  la  séquence  codante  du  gène.  Il  contribue  à   l’initiation  et  à  la  régulation  de  la  transcription  en  interagissant  avec  de  multiples  partenaires  dont  l’ARN   polymérase  II.    

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