Le document présente l'approche des fusion primers dans le cadre du séquençage amplicon ciblé pour une analyse génomique optimisée. Il aborde les avantages et inconvénients des différentes méthodologies de multiplexage, y compris le coût et le temps de préparation. Des protocoles spécifiques pour la PCR et la ligation ainsi que des comparaisons de qualité entre séquençages sont également discutés.

1. Séminaire SSM-NTS#5
L’approche Fusion Primers
mise en place au SSM
1SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013
Régis Debruyne
Postdoc ADNa et NTS
SSM, UMS 2700

2. Plan
• 2 types de banques
• Histoire des Fusion Primers
• Pour faire du ciblé TAS
• Pas tous les amplicons
• Approche SSM
2SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013

3. Ajout d’adaptateurs
aux terminaisons moléculaires
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 3
A
A
Par ligation Par PCR
Avantages :
ADN cible non connu
Inconvénients :
Coût élevé du multiplexage
individuel
Séquençage à la volée sans
ciblage préalable
Avantages :
Ciblage des données produites
Coût maitrisé
Inconvénients :
Temps de préparation
ADN cible connu

4. Genèse du multiplexage individuel
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 4
Meyer M, Stenzel U, Myles S, Prüfer K, Hofreiter M (2007) Targeted high-throughput sequencing of tagged nucleic acid samples.
Nucleic Acids Res 35: e97 doi:10.1093/nar/gkm566.
Double ligation (1-barcode, 2-adaptateur)

5. Genèse du multiplexage individuel
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 5
PCR taggée
puis ligation
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 5
Binladen J, Gilbert MTP, Bollback JP, Panitz F, et al. (2007) The Use of Coded PCR Primers Enables High-Throughput Sequencing of Multiple
Homolog Amplification Products by 454 Parallel Sequencing. PLoS ONE 2(2): e197. doi:10.1371/journal.pone.0000197
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0000197

6. Genèse du multiplexage individuel
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 6
Approche Fusion Primers stricto sensu
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 6

7. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 7
Bybee S M et al. Genome Biol Evol 2011;3:1312-1323
Le TAS (Targeted Amplicon Sequencing):
une approche Fusion Primers optimisée
Multi-locus
Multi-individus
Protocole
bon marché
à 2 étapes
de PCR

8. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 8
Le TAS (Targeted Amplicon Sequencing):
une approche Fusion Primers optimisée
Bybee S M et al. Genome Biol Evol 2011;3:1312-1323

9. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 9
Le TAS adapté au PGM du SSM

10. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 10
Le TAS adapté au PGM du SSM

11. Approche Fusion Primers non dédiée
à toutes les banques d’amplicons
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 11SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 11
Pour les amplicons longs (>800 pb), et pour
les projets d’amplicons aboutissant à une
grosse couverture génomique (>10kb), La
solution de création de banque par ligation
demeure actuellement la seule approche
expérimentalement raisonnable et
économiquement viable.

12. 1
10
100
1000
1E+2 1E+3 1E+4 1E+5 1E+6 1E+7 1E+8 1E+9
Génome
métagénome
Capture par
hybridation
RadSeqAmplicons
courts
Amplicons
longs
Nombre
d’individus
Total des
séquences
en pb
Exemple 1: projet amplicon – 3kb – 50 spécimens
• amplicons courts (<400pb)
approche par FP
• amplicons >400pb ; Namplicons <5
approche par pool/fragmentation/ligation
1
1
12SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013

13. Analyse comparative de la qualité des
séquences en FP et via Sanger
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 13SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 13
Séquençage Sanger
Amplicon 700 pb
Séquençage PGM
QV <20
QV >30

14. Le TAS du SSM en pratique pour les
utilisateurs
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 14SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 14
PCR1 avec amorces rallongées en 5’
pour tous les individus et amplicons différents
Commande des amorces rallongées en 5’ par PreF
et PreF pour tous les amplicons nécessaires
Possible nécessité de ré-optimiser les
conditions de PCR (Ta, additifs…)
Limiter les cycles
Dilution des PCR1 favorables
Amplification par PCR2 en parallèle de tous les
individus
Pool des PCR par tag avant ou après
PCR2 en fonction des différences de
taille et de Tm des amplicons
Quantification et pool équimolaire des PCR2
individuelles favorables
Ni dimers ni produit aspécifique
La qualité du pool joue sur la
distribution des reads par
tag/amplicon

15. Le coût (prospectif)
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 15
Projet 1
50 éch.
10 ampl. courts
3 kb
Coût (€)
[couv.
100X]
Amorces Pre-F
et Pre-R pour 10
amplicons
(PCR1)
140
Contribution
adaptateurs
(PCR2)
50?
emPCR 117
Séquençage
(400pb)
235
1 puce 314 77
TOTAL 620
Total / éch. 12,5