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Séminaire SSM-NTS#5
L’approche Fusion Primers
mise en place au SSM
1SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013
Régis Debruyne
Postdoc ADNa et NTS
SSM, UMS 2700
Plan
• 2 types de banques
• Histoire des Fusion Primers
• Pour faire du ciblé TAS
• Pas tous les amplicons
• Approche SSM
2SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013
Ajout d’adaptateurs
aux terminaisons moléculaires
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 3
A
A
Par ligation Par PCR
Avantages :
ADN cible non connu
Inconvénients :
Coût élevé du multiplexage
individuel
Séquençage à la volée sans
ciblage préalable
Avantages :
Ciblage des données produites
Coût maitrisé
Inconvénients :
Temps de préparation
ADN cible connu
Genèse du multiplexage individuel
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 4
Meyer M, Stenzel U, Myles S, Prüfer K, Hofreiter M (2007) Targeted high-throughput sequencing of tagged nucleic acid samples.
Nucleic Acids Res 35: e97 doi:10.1093/nar/gkm566.
Double ligation (1-barcode, 2-adaptateur)
Genèse du multiplexage individuel
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 5
PCR taggée
puis ligation
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 5
Binladen J, Gilbert MTP, Bollback JP, Panitz F, et al. (2007) The Use of Coded PCR Primers Enables High-Throughput Sequencing of Multiple
Homolog Amplification Products by 454 Parallel Sequencing. PLoS ONE 2(2): e197. doi:10.1371/journal.pone.0000197
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0000197
Genèse du multiplexage individuel
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 6
Approche Fusion Primers stricto sensu
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 6
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 7
Bybee S M et al. Genome Biol Evol 2011;3:1312-1323
Le TAS (Targeted Amplicon Sequencing):
une approche Fusion Primers optimisée
Multi-locus
Multi-individus
Protocole
bon marché
à 2 étapes
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SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 8
Le TAS (Targeted Amplicon Sequencing):
une approche Fusion Primers optimisée
Bybee S M et al. Genome Biol Evol 2011;3:1312-1323
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 9
Le TAS adapté au PGM du SSM
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 10
Le TAS adapté au PGM du SSM
Approche Fusion Primers non dédiée
à toutes les banques d’amplicons
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 11SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 11
Pour les amplicons longs (>800 pb), et pour
les projets d’amplicons aboutissant à une
grosse couverture génomique (>10kb), La
solution de création de banque par ligation
demeure actuellement la seule approche
expérimentalement raisonnable et
économiquement viable.
1
10
100
1000
1E+2 1E+3 1E+4 1E+5 1E+6 1E+7 1E+8 1E+9
Génome
métagénome
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RadSeqAmplicons
courts
Amplicons
longs
Nombre
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en pb
Exemple 1: projet amplicon – 3kb – 50 spécimens
• amplicons courts (<400pb)
approche par FP
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approche par pool/fragmentation/ligation
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1
12SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013
Analyse comparative de la qualité des
séquences en FP et via Sanger
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 13SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 13
Séquençage Sanger
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QV <20
QV >30
Le TAS du SSM en pratique pour les
utilisateurs
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 14SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 14
PCR1 avec amorces rallongées en 5’
pour tous les individus et amplicons différents
Commande des amorces rallongées en 5’ par PreF
et PreF pour tous les amplicons nécessaires
Possible nécessité de ré-optimiser les
conditions de PCR (Ta, additifs…)
Limiter les cycles
Dilution des PCR1 favorables
Amplification par PCR2 en parallèle de tous les
individus
Pool des PCR par tag avant ou après
PCR2 en fonction des différences de
taille et de Tm des amplicons
Quantification et pool équimolaire des PCR2
individuelles favorables
Ni dimers ni produit aspécifique
La qualité du pool joue sur la
distribution des reads par
tag/amplicon
Le coût (prospectif)
SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 15
Projet 1
50 éch.
10 ampl. courts
3 kb
Coût (€)
[couv.
100X]
Amorces Pre-F
et Pre-R pour 10
amplicons
(PCR1)
140
Contribution
adaptateurs
(PCR2)
50?
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  • 1. Séminaire SSM-NTS#5 L’approche Fusion Primers mise en place au SSM 1SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 Régis Debruyne Postdoc ADNa et NTS SSM, UMS 2700
  • 2. Plan • 2 types de banques • Histoire des Fusion Primers • Pour faire du ciblé TAS • Pas tous les amplicons • Approche SSM 2SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013
  • 3. Ajout d’adaptateurs aux terminaisons moléculaires SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 3 A A Par ligation Par PCR Avantages : ADN cible non connu Inconvénients : Coût élevé du multiplexage individuel Séquençage à la volée sans ciblage préalable Avantages : Ciblage des données produites Coût maitrisé Inconvénients : Temps de préparation ADN cible connu
  • 4. Genèse du multiplexage individuel SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 4 Meyer M, Stenzel U, Myles S, Prüfer K, Hofreiter M (2007) Targeted high-throughput sequencing of tagged nucleic acid samples. Nucleic Acids Res 35: e97 doi:10.1093/nar/gkm566. Double ligation (1-barcode, 2-adaptateur)
  • 5. Genèse du multiplexage individuel SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 5 PCR taggée puis ligation SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 5 Binladen J, Gilbert MTP, Bollback JP, Panitz F, et al. (2007) The Use of Coded PCR Primers Enables High-Throughput Sequencing of Multiple Homolog Amplification Products by 454 Parallel Sequencing. PLoS ONE 2(2): e197. doi:10.1371/journal.pone.0000197 http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0000197
  • 6. Genèse du multiplexage individuel SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 6 Approche Fusion Primers stricto sensu SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 6
  • 7. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 7 Bybee S M et al. Genome Biol Evol 2011;3:1312-1323 Le TAS (Targeted Amplicon Sequencing): une approche Fusion Primers optimisée Multi-locus Multi-individus Protocole bon marché à 2 étapes de PCR
  • 8. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 8 Le TAS (Targeted Amplicon Sequencing): une approche Fusion Primers optimisée Bybee S M et al. Genome Biol Evol 2011;3:1312-1323
  • 9. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 9 Le TAS adapté au PGM du SSM
  • 10. SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 10 Le TAS adapté au PGM du SSM
  • 11. Approche Fusion Primers non dédiée à toutes les banques d’amplicons SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 11SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 11 Pour les amplicons longs (>800 pb), et pour les projets d’amplicons aboutissant à une grosse couverture génomique (>10kb), La solution de création de banque par ligation demeure actuellement la seule approche expérimentalement raisonnable et économiquement viable.
  • 12. 1 10 100 1000 1E+2 1E+3 1E+4 1E+5 1E+6 1E+7 1E+8 1E+9 Génome métagénome Capture par hybridation RadSeqAmplicons courts Amplicons longs Nombre d’individus Total des séquences en pb Exemple 1: projet amplicon – 3kb – 50 spécimens • amplicons courts (<400pb) approche par FP • amplicons >400pb ; Namplicons <5 approche par pool/fragmentation/ligation 1 1 12SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013
  • 13. Analyse comparative de la qualité des séquences en FP et via Sanger SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 13SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 13 Séquençage Sanger Amplicon 700 pb Séquençage PGM QV <20 QV >30
  • 14. Le TAS du SSM en pratique pour les utilisateurs SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 14SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 14 PCR1 avec amorces rallongées en 5’ pour tous les individus et amplicons différents Commande des amorces rallongées en 5’ par PreF et PreF pour tous les amplicons nécessaires Possible nécessité de ré-optimiser les conditions de PCR (Ta, additifs…) Limiter les cycles Dilution des PCR1 favorables Amplification par PCR2 en parallèle de tous les individus Pool des PCR par tag avant ou après PCR2 en fonction des différences de taille et de Tm des amplicons Quantification et pool équimolaire des PCR2 individuelles favorables Ni dimers ni produit aspécifique La qualité du pool joue sur la distribution des reads par tag/amplicon
  • 15. Le coût (prospectif) SSM-NTS#5 v1.0 31/05/2013 15 Projet 1 50 éch. 10 ampl. courts 3 kb Coût (€) [couv. 100X] Amorces Pre-F et Pre-R pour 10 amplicons (PCR1) 140 Contribution adaptateurs (PCR2) 50? emPCR 117 Séquençage (400pb) 235 1 puce 314 77 TOTAL 620 Total / éch. 12,5