PCR / ADN / biologie moléculaire

1. Rédigé par: Sous la supervision:
*Azizi Asma m. bouteraa
*Chemoul Amina
*Ammari Feriel

2. PCR

3. • PCR : La «Polymerase Chain Reaction» (ou encore ACP pour
Amplification en Chaîne par Polymérase), est une technique
de réplication ciblée in vitro.
• Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et
peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN
spécifique et de longueur définie. L'ordre de grandeur à
retenir est celui du million des copies en quelques heures.
C'est, généralement suffisant pour une utilisation ultérieure

4. • Cette méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en
1985 par Kary Mullis, qui obtint pour ces travaux le prix Nobel
de Chimie en 1993. Ce procédé révolutionnaire couplé à
l’utilisation d’une ADN polymerase thermorésistante permet
d’obtenir, sans clonage, une amplification considérable d’un
fragment donné d’ADN.
• Comme tout développement technologique nouveau, la PCR
a d'abord été investiguée dans les domaines humains et
vétérinaires et aussi l'agricole .

6. • La PCR permet donc d’obtenir par
réplication in vitro de multiples copies d’un
fragment d’ADN à partir d’un extrait. L’ADN
matriciel peut tout autant être de l’ADN
génomique que de l’ADN complémentaire
obtenu par RT-PCR à partir d’un extrait
d’ARN messagers (ARN poly-A), ou encore
de l’ADN mitochondrial

7. *--> Une PCR classique se déroule dans un petit tube lui même
placé dans un appareil programmable appelé thermocycleur. Ce
dernier se contente de placer le tube aux températures voulues
pendant les durées programmées... et de recommencer en
effectuant des cycles. Un cycle reproduit trois températures
différentes pendant des durées différentes. La durée d'un cycle
est de l'ordre de la minute.

9. • Avant la réaction, tous les « acteurs » de la PCR sont introduits
dans le même tube. Il s'agit de l'ADN à amplifier, des
oligonucléotides (ou amorces), spécifiques du segment d'ADN
voulu, de l'ADN polymérase (ici la Taq polymérase) et enfin du
mélange des quatre désoxyribonucléotides constitutifs de
l'ADN. Tous sont ajoutés en large excès par rapport à l'ADN

11. • La dénaturation thermique de l'ADN:
• à 95°C (10-15mn), les liaisons d'hydrogènes sont rompues et
les 2 brins de l'ADN se séparent. L'ADN passe sous forme
simple brin dans le milieu.

12. • Hybridation des amorces:
• (2-60 seconde) le milieu réactionnel contient 2 amorces,
chacune complémentaire d'un des 2 brins. La température
permettant la fixation des amorces sur les monobrins d'ADN
est comprise entre 40°C et 65°C. Les amorces en larges excès,
s'hybrident dès lors qu'elles rencontrent les séquences
complémentaires.

13. • Elongation:
• La troisième période s’effectue à une température de 72°C,
dite température d’élongation. À 72°C, la Taq polymérase se lie
aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en
utilisant les désoxyribonucléosides triphosphates présents
dans le mélange réactionnel. Les régions de l’ADN matriciel en
aval des amorces sont ainsi sélectivement synthétisées .

15. • Les applications de la PCR sont multiples. C’est une
technique désormais incontournable en biologie cellulaire et
moléculaire.
• Elle permet notamment en quelques heures le « clonage
acellulaire » d’un fragment d’ADN grâce à un système
automatisé, alors qu’il faut plusieurs jours avec les techniques
standard de clonage moléculaire.
• D’autre part, la PCR est largement utilisée à des fins de
diagnostic pour détecter la présence d’une séquence d’ADN
spécifique de tel ou tel organisme dans un fluide biologique.

16. • Elle est aussi employée pour réaliser des empreintes
génétiques, qu’il s’agisse de l’identification génétique d’une
personne dans le cadre d’une enquête judiciaire, ou de
l’identification de variétés animales, végétales ou
microbiennes destinée à des tests de qualité alimentaire, de
diagnostic ou de sélection variétale
• La PCR est encore indispensable à la réalisation d’un
séquençage ou d’une mutagénèse dirigée.
• Enfin , il existe des variantes de la PCR : real-time PCR, PCR
compétitive, , RT-PCR ( reverse transcriptase )....

17. • PCR c'est une technique d'amplification
enzymatique (Taq polymérase) qui permet à partir
d'un fragment d'ADN, d'obtenir un grand nombre
(plusieurs millions) de copies identiques de ce
même fragment. Cette réaction est réalisée in vitro.
Elle est très précieuse pour les études d'ADN fossile
car on ne dispose que de très peu de matériel
génétique..