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Les puces à adn
- 1. République Algérienne Démocratiqueet Populaire MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERGHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE HASSIBA BEN BOUALI CHLEF Biotechnologie Microbienne L3 Module :Biologie Moléculaire Présenté par: -BOUREZAK RABIAA-NAWEL -HADJ BEN ELEZAAR ASMA Dirigé par: -Mm . NAHAL 2015/2016
- 2. Introduction Historique Définition des pucesà ADN Les différents types de puces à ADN Principe Notre plan de présentation
- 3. Les étapes deconstruction Fonctionnement des puces a ADN Domaines d’utilisation Les avantages et les inconvénient Conclusion Notre plan de présentation
- 4. Le concept depuce à ADN repose sur une technologie multidisciplinaire intégrant la biologie, la nanotechnologie, la chimie des acides nucléiques, l’analyse d’images et la bio- informatique. Grace à cet outil, il est possible de mesurer le niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes simultanément et les applications sont en plein essor dans un grand nombre de domaines comme la pharmacologie, la médecine ou l’environnement. INTRODUCTION
- 5. Historique leur concept datede 1987 « suite logique aux anciennes méthodes de northern blotting. La technologie des puces à ADN est basée sur le principe d’hybridation développé par southern (1974). Les premières puces à ADN sont apparues en 1993. Schena et al 1995
- 6. Définition des pucesà ADN Une biopuce, puce à ADN, est un ensemble de molécules d'ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface qui peut être du verre, du silicium ou du plastique. puces à gènes micromatrice d'ADN puce à ADN Une biopuce biochip Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à un échantillon de référence.
- 7. Microarray: lame en verre -plusminiaturisé -utilise les produit PCR -200-400 microns -cibles marquées par fluorescence Macroarray: -utilise des clones d’ ADNc . -disposés sur une membrane de nylon. -associés avec des cibles Radioactives. Oligonucléotides: Affimetrix -synthèse chimique d’oligonucléotides In-situ -sur surface solide - un procédé de photolithographie http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf Les différents types de puces à ADN
- 8. Source : TheSamuel Roberts Noble Foundation, Inc
- 9. Fabrication de la puce . Préparation dela cible Hybridation Lecture Analyse des données Regroupement des profils d’expression Les étapes de construction
- 10. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf LaFabrication Les fragments d'ADNc amplifiés par la technique de PCR sont déposés sur une lame de verre par adressage mécanique. L’accrochage de la molécule d’ADNc se fait grâce à (la poly-lysine). L’ADN est lié de manière covalente au support par une exposition aux UV. Un Support idéal, c’est lui qui permet : L’immobilisation efficace des sondes sur la surface. L’hybridation robuste de la sonde avec la cible.
- 11. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf Préparationde la cible -Les ARNm sont extraits des deux cultures dont on veut comparer leurs expressions. -Les ARNm sont ensuite transformés en ADNc monocaténaires par transcription inverse RT-PCR. -L’ADN de la première culture est marqué avec un fluorochrome vert, et l'ADN de la seconde culture est marqué en rouge. -Mélange des deux ADNc (vert et rouge) : c’est la cible.
- 12. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf L’Hybridation 1-Lemélange est placé sur la matrice d'ADNc monocaténaire (la sonde). 2-La puce est alors incubée une nuit à 60 degrés. A cette température, un brin d'ADN qui rencontre son complémentaire s'apparie pour donner de l'ADN double brin. 65c° PENDANT UNE NUIT
- 13. MODE DE FIXATIONdes sondes: séchage 12H /fixation des ADN par cuisson à 80c° / lavage
- 14. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf Lalecture 1-La puce est placée sous un scanner éléctronique. 2-Des résultats obtenus par des logiciels informatiques 3-Superposition des images vertes et rouges : le vert , c’est seulement l'ADN de la première condition qui est fixé ; le rouge c’est seulement l'ADN de la seconde condition qui est fixé) *Schena M. et al, TIBTECH. 1998, July; vol 16: pages 301-306 Microarrays: biotechnology’s discovery platform for functional genomics
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- 17. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf Analysedes données *On calcule le ratio des intensités= fluorescence rouge / fluorescence verte. Si ce ratio > 1 (la couleur est rouge), le gène est plus exprimé, si ce ratio < 1 (la couleur est verte), le gène est moins exprimé. *On suppose alors que la quantité d'ADN fluorescent fixée est proportionnelle à la quantité d’ARNm correspondante dans la cellule de départ *On mesure la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome (vert et rouge) pour chacun des spots
- 18. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf ARNmprésent seulement dans les cellules normales ARNm présent seulement dans les cellules cancéreuses ARNm présent en quantité égale dans les cellules normales et dans les cellules cancéreuses
- 19. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf Regroupementdes profils d’expression 2- On représente ensuite les ratios grâce à une échelle de couleur du vert (gènes réprimés) au rouge(gènes induits). 1-Dans cette étape ,on essaye de regrouper des gènes ayant le même profil d'expression sur plusieurs expériences ayant un rapport biologiques
- 20. On réalise unesynthèse chimique d’oligonucléotides représentative des génes de l’organisme étudié, directement sur une lame de verre, par un procédé photolithographique . 1- Les lames sont activées (traitées par des espaceurs) de manière à fixer des nucléotides. 2- Les extrémités libres des espaceurs sont protégées par des groupements photholabiles pour empêcher la fixation des nucléotides au hasard. 3-Nous utilisons ensuite un jeu de masque photolithografique (protection contre les rayons « UV »).Comme ,dans le cas de notre ADN, l’adénine doit apparaître à la 4eme et la 6eme place sur la lame , le masque doit protéger toutes les places à l’exception de la 4ème et la 6ème . 4-On procède à l’Insolation par des rayons « UV » qui vont détruire les groupememts photolabiles de la 4ème et la 6ème place. 5- Puis la lame est trempée dans une solution contenant un nucléotide protégé portant la base « A »Adénine. Ce nucléotide va se fixer à la 4ème et à la 6ème place. 3-Réseaux d’oligonucléotides : synthèse d’oligonucléotides in situ (sur une surfase)
- 21. Généralement, quand lalimite d’un ratio est > 2 ou <0,5 » on considère qu’un gène est respectivement sur exprimé ou sous- exprimé, dans une des cibles par rapport à l’autre. Source : Le principe des puces à ADN (Cours ENS) Figure 03:(Intensité dans le rougeCY5) = f(intensités dans le vertCY3).
- 22. Domaine d’utilisation parallèlement àl’analyse des profils d’expression, les puces à ADN offrent la possibilité de réaliser des études très diverses. - La cancérologie :l’approche de puce à ADN a permis d’améliorer la classification des tumeurs. -Le criblage médicamenteux : les puces à ADN permettent de découvrir de nouveaux médicaments plus rapidement et d’en réduire le coût grâce a leur vitesse d’analyser des milliers de molécules. -L’environnement: L’applications des puces à ADN, notamment pour la détection rapide et à bas coût de substances organiques, principalement des agents pathogènes dilués dans l’environnement. -Les applications dans le domaine de la guerre bactériologique ou chimique: En déterminant par avance les modifications du fonctionnement génétique des cellules immunitaires occasionnées par des agents toxiques.
- 23. Domaine d’utilisation Avantages Inconvénients Étudesimultanée des profils d’expression de plusieurs millier de gènes. Les données sont cumulables. Les groupes de gènes affichent des comportements identiques dans une situation biologique donnée. La technique est assez lourde à mettre en place. L’équipement de départ est d’un coût relativement élevé. Le grand nombre de résultats obtenu très rapidement nécessite un traitement informatique et statistique non négligeable.
- 24. conclusion -Les biopuces seprésentent comme une réelle révolution autant au point de vue technologique qu’applicatif. En effet, les procédés de fabrication et d’exploitation nécessitent la participation de sciences à vocations différentes qui deviennent ici complémentaires : d’un côté des technologies relevant des télécommunications telles que l’électronique, l’optique et l’informatique, et d’autre la biologie.