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République Algérienne Démocratique et Populaire
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERGHE
SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE HASSIBA BEN BOUALI CHLEF
Biotechnologie Microbienne L3
Module :Biologie Moléculaire
Présenté par:
-BOUREZAK RABIAA-NAWEL
-HADJ BEN ELEZAAR ASMA
Dirigé par:
-Mm . NAHAL
2015/2016
Introduction
Historique
Définition des puces à ADN
Les différents types de puces à ADN
Principe
Notre plan de présentation
Les étapes de construction
Fonctionnement des puces a ADN
Domaines d’utilisation
Les avantages et les inconvénient
Conclusion
Notre plan de présentation
Le concept de puce à ADN repose sur une technologie
multidisciplinaire intégrant la biologie, la nanotechnologie, la
chimie des acides nucléiques, l’analyse d’images et la bio-
informatique. Grace à cet outil, il est possible de mesurer le
niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes
simultanément et les applications sont en plein essor dans un
grand nombre de domaines comme la pharmacologie, la
médecine ou l’environnement.
INTRODUCTION
Historique
leur concept date de 1987 « suite logique aux
anciennes méthodes de northern blotting.
La technologie des puces à ADN est basée sur le principe
d’hybridation développé par southern (1974).
Les premières puces à ADN sont apparues en 1993.
Schena et al 1995
Définition des puces à ADN
Une biopuce, puce à ADN, est un ensemble de molécules
d'ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface
qui peut être du verre, du silicium ou du plastique.
puces à
gènes
micromatrice
d'ADN
puce à
ADN
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Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau
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 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
Les différents types de puces
à ADN
Source : The Samuel Roberts
Noble Foundation, Inc
Fabrication
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Microarrays
Macroarrays
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Microarrays
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une nuit à 60 degrés. A
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Microarrays
Macroarrays
Puces à
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 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
La lecture
1-La puce est
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3-Superposition des images vertes et rouges :
le vert , c’est seulement l'ADN de la
première condition qui est fixé ; le rouge
c’est seulement l'ADN de la seconde
condition qui est fixé)
*Schena M. et al, TIBTECH. 1998, July; vol 16: pages 301-306
Microarrays: biotechnology’s discovery platform for
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Domaine d’utilisation
Microarrays
Macroarrays
Puces à
oligonucléotides
 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
Analyse des
données
*On calcule le ratio des intensités=
fluorescence rouge / fluorescence verte.
Si ce ratio > 1 (la couleur est
rouge), le gène est plus exprimé, si ce
ratio < 1 (la couleur est verte), le gène
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fluorescent fixée est proportionnelle à la
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Microarrays
Macroarrays
Puces à
oligonucléotides
 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
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Microarrays
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oligonucléotides
 http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
Regroupement des
profils d’expression
2- On représente ensuite les ratios grâce
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réprimés) au rouge(gènes induits).
1-Dans cette étape ,on essaye de
regrouper des gènes ayant le même
profil d'expression sur plusieurs
expériences ayant un rapport biologiques
On réalise une synthèse chimique
d’oligonucléotides représentative des
génes de l’organisme étudié,
directement sur une lame de verre, par
un procédé photolithographique .
1- Les lames sont activées (traitées par des espaceurs) de manière à
fixer des nucléotides.
2- Les extrémités libres des espaceurs sont protégées par des groupements
photholabiles pour empêcher la fixation des nucléotides au hasard.
3-Nous utilisons ensuite un jeu de masque photolithografique (protection
contre les rayons « UV »).Comme ,dans le cas de notre ADN, l’adénine doit
apparaître à la 4eme et la 6eme place sur la lame , le masque doit protéger
toutes les places à l’exception de la 4ème et la 6ème .
4-On procède à l’Insolation par des rayons « UV » qui vont détruire les
groupememts photolabiles de la 4ème et la 6ème place.
5- Puis la lame est trempée dans une solution contenant un nucléotide protégé
portant la base « A »Adénine. Ce nucléotide va se fixer à la 4ème et à la 6ème
place.
3-Réseaux d’oligonucléotides :
synthèse d’oligonucléotides in
situ (sur une surfase)
Généralement, quand la limite
d’un ratio est > 2 ou <0,5 » on
considère qu’un gène est
respectivement sur exprimé ou
sous- exprimé, dans une des
cibles par rapport à l’autre.
Source : Le principe des puces à ADN (Cours ENS)
Figure 03:(Intensité dans le rougeCY5) =
f(intensités dans le vertCY3).
Domaine d’utilisation
parallèlement à l’analyse des profils d’expression, les puces à
ADN offrent la possibilité de réaliser des études très diverses.
- La cancérologie :l’approche de puce à ADN a permis d’améliorer
la classification des tumeurs.
-Le criblage médicamenteux : les puces à ADN permettent de
découvrir de nouveaux médicaments plus rapidement et d’en
réduire le coût grâce a leur vitesse d’analyser des milliers de
molécules.
-L’environnement: L’applications des puces à ADN, notamment
pour la détection rapide et à bas coût de substances organiques,
principalement des agents pathogènes dilués dans
l’environnement.
-Les applications dans le domaine de la guerre
bactériologique ou chimique: En déterminant par avance les
modifications du fonctionnement génétique des cellules
immunitaires occasionnées par des agents toxiques.
Domaine d’utilisation
Avantages Inconvénients
Étude simultanée des profils
d’expression de plusieurs millier
de gènes.
Les données sont
cumulables.
Les groupes de gènes
affichent des comportements
identiques dans une situation
biologique donnée.
La technique est assez
lourde à mettre en place.
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est d’un coût relativement
élevé.
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résultats obtenu très
rapidement nécessite un
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statistique non négligeable.
conclusion
-Les biopuces se présentent comme une réelle révolution
autant au point de vue technologique qu’applicatif. En
effet, les procédés de fabrication et d’exploitation
nécessitent la participation de sciences à vocations
différentes qui deviennent ici complémentaires : d’un
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Les puces à adn

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  • 2. Introduction Historique Définition des puces à ADN Les différents types de puces à ADN Principe Notre plan de présentation
  • 3. Les étapes de construction Fonctionnement des puces a ADN Domaines d’utilisation Les avantages et les inconvénient Conclusion Notre plan de présentation
  • 4. Le concept de puce à ADN repose sur une technologie multidisciplinaire intégrant la biologie, la nanotechnologie, la chimie des acides nucléiques, l’analyse d’images et la bio- informatique. Grace à cet outil, il est possible de mesurer le niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes simultanément et les applications sont en plein essor dans un grand nombre de domaines comme la pharmacologie, la médecine ou l’environnement. INTRODUCTION
  • 5. Historique leur concept date de 1987 « suite logique aux anciennes méthodes de northern blotting. La technologie des puces à ADN est basée sur le principe d’hybridation développé par southern (1974). Les premières puces à ADN sont apparues en 1993. Schena et al 1995
  • 6. Définition des puces à ADN Une biopuce, puce à ADN, est un ensemble de molécules d'ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface qui peut être du verre, du silicium ou du plastique. puces à gènes micromatrice d'ADN puce à ADN Une biopuce biochip Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à un échantillon de référence.
  • 7. Microarray: lame en verre -plus miniaturisé -utilise les produit PCR -200-400 microns -cibles marquées par fluorescence Macroarray: -utilise des clones d’ ADNc . -disposés sur une membrane de nylon. -associés avec des cibles Radioactives. Oligonucléotides: Affimetrix -synthèse chimique d’oligonucléotides In-situ -sur surface solide - un procédé de photolithographie  http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf Les différents types de puces à ADN
  • 8. Source : The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc
  • 9. Fabrication de la puce . Préparation de la cible Hybridation Lecture Analyse des données Regroupement des profils d’expression Les étapes de construction
  • 10. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides  http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf La Fabrication Les fragments d'ADNc amplifiés par la technique de PCR sont déposés sur une lame de verre par adressage mécanique. L’accrochage de la molécule d’ADNc se fait grâce à (la poly-lysine). L’ADN est lié de manière covalente au support par une exposition aux UV. Un Support idéal, c’est lui qui permet : L’immobilisation efficace des sondes sur la surface. L’hybridation robuste de la sonde avec la cible.
  • 11. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides  http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf Préparation de la cible -Les ARNm sont extraits des deux cultures dont on veut comparer leurs expressions. -Les ARNm sont ensuite transformés en ADNc monocaténaires par transcription inverse RT-PCR. -L’ADN de la première culture est marqué avec un fluorochrome vert, et l'ADN de la seconde culture est marqué en rouge. -Mélange des deux ADNc (vert et rouge) : c’est la cible.
  • 12. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides  http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf L’Hybridation 1-Le mélange est placé sur la matrice d'ADNc monocaténaire (la sonde). 2-La puce est alors incubée une nuit à 60 degrés. A cette température, un brin d'ADN qui rencontre son complémentaire s'apparie pour donner de l'ADN double brin. 65c° PENDANT UNE NUIT
  • 13. MODE DE FIXATION des sondes: séchage 12H /fixation des ADN par cuisson à 80c° / lavage
  • 14. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides  http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf La lecture 1-La puce est placée sous un scanner éléctronique. 2-Des résultats obtenus par des logiciels informatiques 3-Superposition des images vertes et rouges : le vert , c’est seulement l'ADN de la première condition qui est fixé ; le rouge c’est seulement l'ADN de la seconde condition qui est fixé) *Schena M. et al, TIBTECH. 1998, July; vol 16: pages 301-306 Microarrays: biotechnology’s discovery platform for functional genomics
  • 16.
  • 17. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides  http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf Analyse des données *On calcule le ratio des intensités= fluorescence rouge / fluorescence verte. Si ce ratio > 1 (la couleur est rouge), le gène est plus exprimé, si ce ratio < 1 (la couleur est verte), le gène est moins exprimé. *On suppose alors que la quantité d'ADN fluorescent fixée est proportionnelle à la quantité d’ARNm correspondante dans la cellule de départ *On mesure la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome (vert et rouge) pour chacun des spots
  • 18. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides  http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf ARNm présent seulement dans les cellules normales ARNm présent seulement dans les cellules cancéreuses ARNm présent en quantité égale dans les cellules normales et dans les cellules cancéreuses
  • 19. Microarrays Macroarrays Puces à oligonucléotides  http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf Regroupement des profils d’expression 2- On représente ensuite les ratios grâce à une échelle de couleur du vert (gènes réprimés) au rouge(gènes induits). 1-Dans cette étape ,on essaye de regrouper des gènes ayant le même profil d'expression sur plusieurs expériences ayant un rapport biologiques
  • 20. On réalise une synthèse chimique d’oligonucléotides représentative des génes de l’organisme étudié, directement sur une lame de verre, par un procédé photolithographique . 1- Les lames sont activées (traitées par des espaceurs) de manière à fixer des nucléotides. 2- Les extrémités libres des espaceurs sont protégées par des groupements photholabiles pour empêcher la fixation des nucléotides au hasard. 3-Nous utilisons ensuite un jeu de masque photolithografique (protection contre les rayons « UV »).Comme ,dans le cas de notre ADN, l’adénine doit apparaître à la 4eme et la 6eme place sur la lame , le masque doit protéger toutes les places à l’exception de la 4ème et la 6ème . 4-On procède à l’Insolation par des rayons « UV » qui vont détruire les groupememts photolabiles de la 4ème et la 6ème place. 5- Puis la lame est trempée dans une solution contenant un nucléotide protégé portant la base « A »Adénine. Ce nucléotide va se fixer à la 4ème et à la 6ème place. 3-Réseaux d’oligonucléotides : synthèse d’oligonucléotides in situ (sur une surfase)
  • 21. Généralement, quand la limite d’un ratio est > 2 ou <0,5 » on considère qu’un gène est respectivement sur exprimé ou sous- exprimé, dans une des cibles par rapport à l’autre. Source : Le principe des puces à ADN (Cours ENS) Figure 03:(Intensité dans le rougeCY5) = f(intensités dans le vertCY3).
  • 22. Domaine d’utilisation parallèlement à l’analyse des profils d’expression, les puces à ADN offrent la possibilité de réaliser des études très diverses. - La cancérologie :l’approche de puce à ADN a permis d’améliorer la classification des tumeurs. -Le criblage médicamenteux : les puces à ADN permettent de découvrir de nouveaux médicaments plus rapidement et d’en réduire le coût grâce a leur vitesse d’analyser des milliers de molécules. -L’environnement: L’applications des puces à ADN, notamment pour la détection rapide et à bas coût de substances organiques, principalement des agents pathogènes dilués dans l’environnement. -Les applications dans le domaine de la guerre bactériologique ou chimique: En déterminant par avance les modifications du fonctionnement génétique des cellules immunitaires occasionnées par des agents toxiques.
  • 23. Domaine d’utilisation Avantages Inconvénients Étude simultanée des profils d’expression de plusieurs millier de gènes. Les données sont cumulables. Les groupes de gènes affichent des comportements identiques dans une situation biologique donnée. La technique est assez lourde à mettre en place. L’équipement de départ est d’un coût relativement élevé. Le grand nombre de résultats obtenu très rapidement nécessite un traitement informatique et statistique non négligeable.
  • 24. conclusion -Les biopuces se présentent comme une réelle révolution autant au point de vue technologique qu’applicatif. En effet, les procédés de fabrication et d’exploitation nécessitent la participation de sciences à vocations différentes qui deviennent ici complémentaires : d’un côté des technologies relevant des télécommunications telles que l’électronique, l’optique et l’informatique, et d’autre la biologie.