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puce à adn
- 1. Les puces àADN RÉALISÉ PAR: SOUILAH YACINE
- 2. plan I. Histoire depuces à ADN. II. Définition et principe III. Préparation de la cible IV. Préparation du support V. Révélation des résultats VI. Analyse des résultats VII. Application des puces à ADN
- 3. Southern blot,en 1975 a été décrit comme, la première technique de détection des ADN par hybridation sur un support solide, qui aboutiront à la conception des puces à ADN ou macroarrays. (ancêtre de puce à ADN. Northern blot: (1977 ) les ARNm sont d’abord immobilisés sur une membrane de nitrocellulose, et un oligonucléotide marqué (radioactivité ou fluorescence), spécifique du gène cible, est ensuite hybridé sur la membrane. Dans le cas des puces à ADN, il s’agit d’un Northern blot inversé. en 1990, des arrays d'ADNc ont été développés et appliqués à l'analyse d'expression en utilisant un marquage radioactif et des membranes à densité élevée, principalement pour le criblage efficace des banques En 1994, la société D'Affymetrix était formée, en démontrant la capacité d'utiliser cette technologie pour générer des réseaux d'ADN constitués de 256 de 8 nt différents. en 1995, la première description d’une “puce à ADN”, Des mesures d'expression différentielle de 45 gènes d'Arabidopsis thaliana ont été réalisées au moyen d'une hybridation simultanée en deux couleurs par fluorescence. (Schena et al. (1995) Science 270, 467 - 470).
- 4. Puce àADN
- 5. Définition Les fragmentsnucléiques déposés sur le support solide sont appelés « sondes » les acides nucléiques marqués présents dans l’échantillon sont les « cibles ». La technologie des puces à ADN, biopuces, DNA microarray ou “DNA-chips” repose sur une technologie multidisciplinaire intégrant la biologie, la biotechnologie, la chimie des acides nucléiques, l’analyse d’images et la bioinformatique. Une puce à ADN est constituée de fragments d’ADN immobilisés sur un support solide selon une disposition ordonnée. Le but de puce à ADN était de mesurer chez l’homme l’expression simultanée d’un grand nombre de gènes, voire de l’ensemble des gènes contenus dans le génome. Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à un échantillon de référence
- 6. Principe de lapuce à ADN Il s’agit d’analyser des profils d’expression génique et à les corréler à des processus biologiques afin de définir des signatures d’expression. La confection des puces à ADN a permis d’étendre ce principe à la détection simultanée de milliers de séquences en parallèle. Une puce comporte quelques centaines à plusieurs dizaines de milliers d’unités d’hybridation appelées « spots » (de l’anglais « spot » = tache), chacune étant constituée d’un dépôt (sondes) de fragments d’ADN ou d’oligonucléotides correspondant à des sondes de séquences données. L’hybridation de la puce avec un échantillon biologique, marqué par un radioélément ou par une molécule fluorescente, permet de détecter et de quantifier l’ensemble des cibles qu’il contient en une seule expérience
- 7. Types de Puceà ADN La miniaturisation, rendue possible par l’utilisation d’un support solide, de marqueurs fluorescents et par les progrès de la robotique, permet aujourd’hui de fabriquer des puces comportant une très haute densité de spots, susceptibles de recouvrir l’intégralité du génome d’un organisme sur une simple lame de microscope. On distingue plusieurs types de puces selon: la densité des spots, Le mode de fabrication, la nature des fragments fixés à la surface, les méthodes d’hybridation l’objectif du projet les macroarrays et microarrays avec un dépôt direct de molécules d’ADN sur leur support. les puces à oligonucléotides avec la synthèse in situ des sondes oligonucléotidiques sur une surface solide. les puces à ADN pour étudier l’expression des gènes. les puces à ADN pour étudier la structure des gènes.
- 8. Les macroarrays oufiltres à haute densité Les dépôts (sondes) sont des clones d’ADNc ou des produits de PCR fixés à haute densité sur une membrane de nylon (8 x 12 cm). Le marquage est le plus souvent radioactif et le criblage est réalisé en excès de cible, on obtient ainsi une mesure de l’abondance relative de chacun des ARNm présent dans l’échantillon de départ. On parle de macroarrays jusqu’à une densité d’environ 25 fragments d’ADN déposés par cm2.
- 9. Les microarrays Ilspermettent la miniaturisation des dépôts d’ADN, ce qui permet de fixer plusieurs milliers de sondes sur des surfaces égales ou inférieures à celle d’une lame de microscope standard. Elles sont déposées à une densité de 1 000 sondes/cm2 par un robot sur des lames de verre préalablement traitées chimiquement, soit jusqu’à 12 000 sondes/lame. Les sondes sont généralement des ADN double brin de longueur de 200 à 2 000bp amplifiés par la technique de PCR mais récemment, des oligonucléotides longs (50-70 mers) ont également été greffés sur la puce après leur synthèse. Les cibles utilisées sont réalisées par transcription inverse, à partir d’ARN total ou messager utilisant deux fluorochromes différents (Cy3 et Cy5), ce qui permet d’hybrider simultanément deux cibles sur une même sonde. Les signaux d’hybridation sont analysés grâce à un lecteur capable de discriminer les deux fluorochromes et de générer deux images dont le niveau de gris représente l’intensité de la fluorescence lue.
- 10. Les puces àoligonucléotides Elles dérivent à l’origine d’un projet de séquençage par hybridation. Les puces les plus couramment utilisées sont les puces de la société Affymetrix. Dans ce cas, les sondes sont des oligonucléotides synthétisés in situ par une technique de photolithographie. Dans ce procédé, une lumière dirigée sur des sites spécifiques de la puce active la réaction d’oligo- synthèse. On peut synthétiser jusqu’à 300 000 oligonucléotides représentant 30 000 gènes sur une puce d’une surface d’environ 1cm2. Une puce à ADN destinée à des études d’expression contient pour chaque gène un ensemble d’oligonucléotides mimant la séquence du gène, souvent choisis dans sa région 3’, réduisant ainsi les risques d’hybridations croisées avec des séquences homologues de ce gène. Des oligonucléotides, dont la séquence varie pour une seule base, sont également ajoutés, ce qui permet de confirmer que le signal obtenu pour chacun des gènes est bien spécifique. On hybride une seule sonde par puce et l’intensité de fluorescence mesurée par un scanner permet une mesure de l’abondance relative de chacun des ARNm présent dans l’échantillon biologique étudié.
- 11. Les puces àADN pour étudier l’expression des gènes Ces puces à ADN, dites «puces transcriptome», permettent d’analyser et de quantifier l’expression des gènes sous forme d’ARNm qui, après traduction, vont permettre la production des protéines indispensables au fonctionnement de la cellule normale ou tumorale. Les puces à ADN pour l’étude du transcriptome sont recouvertes de sondes, constituées de fragments d’ADN de séquence connue, qui vont s’hybrider de façon spécifique avec les ARN messagers de la tumeur ou du tissu normal, pris comme témoin.
- 12. Les puces àADN pour étudier la structure des gènes Ces puces à ADN, dites puces CGH, pour Comparative Genomic Hybridization, permettent d’identifier les altérations de structure (en terme de délétion ou amplification) du génome des cellules tumorales par rapport au génome des cellules normales. Les puces CGH sont recouvertes de fragments d’ADN de séquence connue qui vont s’hybrider de façon spécifique avec les ADN de cellules normales ou les ADN de cellules tumorales. Ces deux ADN sont marqués par des fluorescences différentes. Par comparaison entre ces fluorescences on met en évidence des amplifications ou des délétions de gènes.
- 13. La fabrication despuces à ADN Il existe plusieurs procédés de fabrication. Un procédé de fabrication se distingue de par le substrat utilisé et la nature des étapes mises en œuvre. Cependant le principe de base de la conception des biopuces reste le même. En général, toutes les méthodes de fabrication sont composées de trois phases qui s’effectuent successivement : 1. la fabrication de la puce, 2. la fabrication de la sonde 3. l’hybridation.
- 14. 1. La fabricationde la puce Les brins synthétiques utilisés, ceux dont on connaît la séquence, s'appellent des sondes. Les puces à ADN présentent, par rapport aux méthodes classiques d'hybridation un avantage majeur : grâce aux techniques de miniaturisation elles permettent l'hybridation simultanée d'un nombre de sondes considérables sur une surface totale utile inférieure à 1 cm2.
- 15. 1. La fabricationde la puce Les supports sur lesquels sont fixées les sondes se présentent sous la forme de surfaces planes ou poreuses (percées de puits) composés de matériaux tels que : le verre, matériau peu onéreux, inerte et mécaniquement stable. la petite plaque de verre, substrat de la puce, est recouverte d'une grille de Téflon (qui détermine des zones hydrophiles et hydrophobes). les polymères comme le polypyrrole. le silicium, couramment utilisé pour la fabrication des puces électroniques à cause de ses propriétés semi-conductrices. les métaux, notamment l'or et le platine. Quel que soit le support choisi, il est traité pour former un réseau dense et régulier de microsurfaces et sur chacune de celles-ci est greffée une sonde d'ADN synthétique.
- 16. 2. La fixationdes sondes Il existe deux méthodes : le transfert de brins d'ADN (« off chip synthetis ») ou sa synthèse in situ (« Light directed in situ synthesis »).
- 17. a) Transfert debrins d’ADN La synthèse préalable à la fixation des sondes permet de fixer des sondes relativement longues, atteignant 40 à 60 bases. Le transfert de ces sondes sur la puce peut se faire au moyen de micropipettes, de micropointes ou par des dispositifs de type jet d'encre. Un autre système, c’est l'adressage électrochimique : la puce est composée d'un support en silicium recouvert, à chaque plot d'une mini-électrode en or. Chaque sonde rejoint un plot particulier lorsque les mini-électrodes sont mises sous tension sélective. Les méthodes d'adressage des sondes sont fondamentales : leur performance, leur capacité à être automatisées et leur coût de fonctionnement pèseront lourd dans le développement de la technologie des puces à ADN.
- 18. b. La synthèsein situ Dans ce cas, la construction des sondes se fait par dépôt de couches successives des quatre bases de l'ADN sur un support en verre. C'est un masque, dont la configuration varie à chaque dépôt d'une couche, qui permet aux bases de s'empiler correctement. Avec ce procédé, les sondes comportent au maximum 30 bases. Là encore, des sociétés ont mis au point un système qui permet de déposer sur la grille de téflon de la biopuce, les quatre bases désirées, grâce à des injecteurs piézo-électriques, selon une technologie qui s'apparente à une synthèse d'ADN classique.
- 19. 3. L'hybridation Lerôle de chaque sonde est de reconnaître, dans un mélange appliqué à la surface de la biopuce, une séquence d'ADN. Généralement cette séquence est amplifiée par PCR puis marquée par fluorescence, préparée en solution et mise en contact avec la biopuce. La phase d'hybridation est réalisée dans une sorte d'incubateur (station fluidique) et suivie d'un lavage destiné à débarrasser la puce des cibles nucléiques non hybridées.
- 20. L’exploitation des donnéesfabriquées 1. La lecture Chaque spot est excité par un laser et on récupère la fluorescence émise via un photomultiplicateur (PMT) couplé à un microscope confocal. On obtient alors deux images dont le niveau de gris représente l'intensité de la fluorescence lue. Si on remplace les niveaux de gris par des niveau de vert pour la première image et des niveaux de rouge pour la seconde, on obtient en les superposant une image en fausses couleurs composée de spots allant du vert (seulement de l'ADN de la première condition fixé) au rouge (seulement de l'ADN de la seconde condition fixé) en passant par le jaune (de l'ADN des deux conditions fixé en quantités égales).
- 21. 2. L’analyse desdonnées On a maintenant deux images de la puce à partir desquelles il faut réussir à calculer le nombre de molécules d'ADN au départ. Pour cela, on mesure la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome vert et la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome rouge. Puis on normalise ces quantités en fonction de divers paramètres (quantité de levure de départ dans chaque condition, puissance d'émission de chaque fluorochrome, ...). On suppose alors que la quantité d'ADN fluorescent fixée est proportionnelle à la quantité d'ARNm correspondant dans la cellule de départ et on calcule le ratio fluorescence rouge / fluorescence verte. Si ce ratio est supérieur à 1 (rouge sur l'image en fausses couleurs), le gène est surexprimé dans la seconde culture, si ce ratio est inférieur à 1 (vert sur l'image en fausses couleurs), le gène est sousexprimé dans la seconde culture. On peut visualiser ces différences d'expression grâce à un logiciel développé dans le laboratoire appelé Arrayplot. Il permet d'obtenir à partir de la liste des intensités de chaque point le nuage de points intensité dans le rouge = f (intensité dans le vert) ou une représentation en camembert où le diamètre du camembert est proportionnel à l'intensité des spots.
- 22. Domaine d’application dePuce à ADN La puce à ADN a été utilisées avec succès dans plusieurs processus biologiques variés: en cancérologie, recherche pharmaceutique, génomique, diagnostic, contrôle agroalimentaire et industriel, bioterrorisme, microbiologie etc.
- 23. 1. La cancérologie L’approche de puce à ADN a permis : d’améliorer la classification des tumeurs d’étudier les voies d’oncogenèse d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques de prédire la survie des patients. Le nouveau défi qui est lancé aux biologistes est maintenant le transfert de ces résultats de recherche en oncologie biomédicale afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer.
- 24. 2. La génomique Dans un premier temps la génomique structurale vise à déterminer la séquence du génome humain puis, dans un deuxième temps, la génomique fonctionnelle donne une connaissance plus approfondie de la fonction des séquences d’ADN. Les chercheurs, ne disposant pas d’outils suffisamment puissants, espèrent beaucoup en la puce à ADN, car elle constitue un suivi des ARNm (analyse fonctionnelle), re-séquençage (analyse du polymorphisme), permettant d’étudier à grande échelle des séquences déjà connues. Les espoirs de cette technique sont très importants, la masse des données est très grande, aidée aussi de l’exploitation informatique.
- 25. 3. Le criblagemédicamenteux Il est courant pour un laboratoire de recherche d’analyser 10 000 molécules par jour. L’application des puces à ADN pour ces analyses est un outil précieux pour la vitesse d’exécution des analyses, ce qui permet de découvrir de nouveaux médicaments plus rapidement et d’en réduire le coût.
- 26. 4. La pharmaco-génomique Ce secteur étudie essentiellement l’expression des gènes et sa relation à l’efficacité d’un nouveau traitement. Le médecin traitant dispose d’une large gamme de médicaments pour traiter une pathologie, traitement qui s’avère parfois différent pour chaque patient. Il est donc important qu’il connaisse le traitement le plus efficace pour ses patients. La pharmaco-génomique devrait pouvoir donner cette information à l’avance à partir d’un test génomique du patient. Les laboratoires du secteur pharmaceutique pourraient mettre au point de nouveaux médicaments génétiquement optimisés. Connaissant les cartes personnalisées du patient, ils peuvent analyser d’une part l’expression différentielle entre des cellules saines et malades afin de déceler des gènes cibles, et d’autre part analyser les effets des molécules à visée thérapeutique sur ces gènes. Ce travail ne peut se faire que par l’intermédiaire de la puce à ADN.
- 27. 5. Le diagnosticclinique La puce à ADN a encore un grand rôle à jouer dans une autre application des polymorphismes et de la détection banalisée de ceux-ci. Cela pourrait prévenir les prédispositions qu’a un patient à diverses maladies génétiques. La commercialisation de ces systèmes de petite taille, voire même portables pourrait être utilisée en hôpital et même par les médecins traitants. On attend que des labo-puces puissent faire en un temps réel et continu l’analyse de certains signes vitaux afin d’en prescrire immédiatement le traitement adéquat (par exemple le taux de glucose sanguin pour les diabétiques)
- 28. 6. L’identification etl’expertise médico-légale Le but est l’identification humaine dans le cadre d’enquêtes policières ou judiciaires. Les analyses sur le terrain étant très souvent complexes ainsi que la confidentialité et le respect de la procédure judiciaire assez lourdes, il sera souhaitable d’avoir sur les lieux d’enquête des systèmes portables d’analyse de l’ADN. L’analyse immédiate sur le terrain permettrait d’affiner la recherche d’échantillons. La puce à ADN a là encore un avenir très prometteur.
- 29. 7. L’environnement Lessecteurs de la défense et de l’environnement espèrent aussi aux diverses applications des puces à ADN, notamment pour la détection rapide et à bas coût de substances organiques, principalement des agents pathogènes dilués dans l’environnement.
- 30. 8. Les applicationsdans le domaine de la guerre bactériologique ou chimique En déterminant par avance les modifications du fonctionnement génétique des cellules immunitaires occasionnées par des agents toxiques, on peut identifier rapidement les produits chimiques (mercure, dioxine...) ou bactériologiques (bacille du charbon ou de la diphtérie...) disséminés par un éventuel agresseur.
- 31. 9. L’identification d’espècesanimales dans l’alimentation humaine et animale. Aujourd’hui, la qualité et la sécurité alimentaire sont garanties grâce à l’identification des espèces animales dans l’alimentation humaine ou animale. Les industriels de l’industrie agroalimentaire peuvent apporter la preuve aux consommateurs ou aux instances réglementaires de ce qu’ils ont dans leur assiette ! Les techniques actuelles permettent de répondre à cette question : « Cette espèce est-elle dans mon produit ? »
- 32. Les puces àADN comme outils de détection Ils sont utilisées pour détecter un produit de PCR et remplacent ainsi la migration sur gel en validant la spécificité de l’amplification par sa complémentarité avec la sonde. Des puces permettant d’identifier les bactéries présentes dans un échantillon sur la base de l’analyse des séquences d’ARN ribosomique 16S sont en développement dans plusieurs institutions. L’ADN total est extrait à partir d’un échantillon et l’ensemble des ADN codant pour les ARN 16S sont amplifiés, en utilisant des amorces universelles, et hybridés sur des puces portant des sondes spécifiques de l’ARN 16S des espèces recherchées. Cet outil est développé pour la surveillance du bioterrorisme avec un ensemble de sondes spécifiques des agents pathogènes potentiellement utilisés. 1. Après extraction de l’ADN, les régions codant pour l’ARN ribosomique16S sont amplifiées pour toutes les bactéries de l’échantillon en utilisant des amorces universelles correspondant à des régions conservées dans toutes les espèces. 2. La puce porte des oligonucléotides de séquence spécifique de chaque espèce. 3. Après hybridation, la quantification du signal permet de détecter la présence de bactéries des différentes espèces représentées sur la puce et d’évaluer leurs quantités relatives.
- 33. Les puces aADN pour le re-sequencage La connaissance de la séquence complète d’un génome est le niveau ultime de typage, mais, dans le contexte actuel, le séquençage de chaque isolat n’est pas envisageable. Des puces oligonucléotides sont donc développées pour obtenir des informations partielles sur les génomes. Il serait possible d’avoir une vision Globale du génome et de pointer sur des mutations particulières, comme celles entraînant la résistance à un antibiotique Puce Affymetrix de re-séquençage portent plusieurs centaines de milliers d’oligonucléotides synthétisés in situ par une technique de photolithographie. Pour chaque base, quatre oligonucléotides sont synthétisés d’après une séquence de référence avec à la position centrale l’une des quatre bases, A, C, G ou T. La comparaison des signaux de fluorescence pour ces quatre oligonucléotides permet de déterminer la séquence à cette position Séquençage haut débit peut se faire aussi bien sur l’ADN génomique qu’après rétro-transcription de l’ARN (RNA-Seq) et mesure aussi la quantité d’acide nucléique de départ
- 34. Les puces aADN pour la caracterisation genomique Les puces à ADN sont aussi utilisées pour caractériser la partie variable du génome d’un clone. Ces puces « biodiversité » portent des sondes correspondant à des gènes qui ne sont pas présents dans tous les isolats d’une espèce Elles sont établies à partir de la comparaison des séquences de plusieurs génomes. Par une seule expérience d’hybridation, ces puces permettent d’établir une véritable empreinte digitale correspondant aux gènes présents ou absents dans un clone. les puces à ADN apportent une information fonctionnelle sur la nature des gènes qui différencient deux isolats Ces résultats peuvent être comparés aux données phénotypiques sur les souches, notamment en relation avec leur virulence. Détection de régions chromosomiques spécifiques d’un isolat. 1. L’ADN de la souche à analyser et un ADN de référence sont marqués par des fluorophores ayant des propriétés spectrales différentes. 1. La puce à ADN est hybridée avec un mélange des deux ADN marqués. 1. Après analyse aux deux longueurs d’onde d’émission de fluorescence, les sondes absentes de la souche analysée n’émettront que pour la longueur d’onde du fluorophore de l’ADN de référence.
- 35. RECHERCHE DE POLYMORPHISMES La recherche de polymorphisme (SNP) peut également se faire par la technologie des puces à ADN, en utilisant pour les dépôts des oligonucléotides porteurs ou non du polymorphisme recherché. Pour cela, les puces électroniques à ADN sont un outil de choix (15). Cette puce, développée par la société Nanogen, est constituée d’une cartouche contenant 99 sites de dépôt associés chacun à une microélectrode susceptible de créer un champ électrique. L’activation de ce champ électrique sur un site depôt permet de fixer spécifiquement les oligonucléotides normaux et mutés, puis, lors de l’expérience, de sélectionner les ADN que l’on souhaite hybrider avec un dépôt donné. Toutes les combinaisons possibles entre sondes et cibles peuvent ainsi être obtenues. Le coût moyen d’un SNP par cette technologie est de l’ordre de 2 euros.
- 36. Les biopucessont donc un outil très intéressant dans de nombreux domaines, leur intérêt résidant principalement dans le nombre de données qu’elles peuvent traiter en simultané, fournissant ainsi beaucoup de résultats pour un temps d’analyse considérablement réduit, et un coût également moindre
- 37. Revers de Puceà ADN On se rend bien compte des avantages de cette technique. Mais cette technique peut également être utilisée au détriment des hommes. Les assurances discutent déjà, comment on peut exclure des clients de leurs assurances qui ont des maladies génétiquement irréparables. L'homme devient donc entièrement visible à toutes ces organisations - et ceci à presque tous les égards. En plus, à part ces doutes il y a encore un autre problème: Il manque (même dans les sociétés riches) de moyens financiers pour que la majorité des populations puissent jouir des effets positifs de cette technique.