vecteurs outil de génétique très importante

1.  Hamla Rahma
 Adjal Imen
 Toumi Raounek
 Dr. Fenghour
2023/2024

2. 1-Introduction
2-Diffénition
3-Choixdu vecteurde clonage
4-Lestypes
4.1-LesPlasmides
4.2-Lesbactériophages
4.3-Lescosmides
4.4-LesPhagémides
4.5-BACs
4.6-YACs
5-Propriétés
6-Nomenclaturedesenzymesderestriction
7-Lesenzymesde restruction
8-Conclution
9-Référencesbibliographique.

3. Le clonage moléculaire est souvent utilisé en génie génétique
pour copier et reproduire des molécules d'ADN modifiées.
Cette technique permet aux scientifiques de produire des
micro-organismes qui ont des caractéristiques souhaitées
pour des plusieurs applications . Et elle a besoin des vecteurs
qui est utilisé pour produire de multitude de copie du gène
d'intérêt, avec ses différents types . Dans notre recherche,
nous découvrirons ses types.

4. 2-diffénition :
Un vecteur de clonage est un petit élément génétique à
réplication autonome, utilisé pour produire de multitude de
copie du gène d’intérêt. Ces vecteurs de clonage sont
spécialement conçus pour permettre l’intégration de la portion
d’ADN exogène dans un site spécifique sans que cela affecte
sa propre réplication. Il existe plusieurs types de vecteurs
pouvant introduire des molécules d’ADN recombinées dans
des cellules hôtes.

5. Le choix d’un vecteur de clonage dépend de :
1. La taille et compatibilité des extrémités de l’ADN
étranger à insérer
2. L’application du clonage: cartographie et séquençage
de génome, expression de
protéine thérapeutique dans une bactérie, thérapie
génique.
3-Le choix d’un vecteur de
clonage :

6. 4-Les
types

7. -Sont des petits éléments
génétiques extra-
chromosomiques
doués de la réplication
autonome, ce sont
typiquement des molécules
d'ADN double brin, circulaires,
leur taille varie de 1 à 300 kb
(<5%
de la taille du chromosome
bactérien).
4.1. les Plasmides:
Les plasmides sont de bons
vecteurs de clonage chez les
bactéries parce qu’ils se
multiplient en nombre de
copies important et qu’ils sont
aisément purifiables. Les
marqueurs de sélection (Ex.
gènes de résistance aux
antibiotiques) permettent
l’identification des bactéries
recombinantes qu’ils
les portent

8. Figure 1: les plasmides au microscope et dans la cellule

9. Figure 2: plasmide comme un vecteur de clonage

10. Figure3:Les trois caractéristiques d'un vecteur de clonage idéal.

11. - ColE1
-RSF 2124
-pSC 101
pBR 312 à
pBR 322
La famille
pUC
Premier génération:
Naturels
troisième génération:
Artificiels
deuxième génération:
Semi-artificiels

12. Plasmide pBR322 :
-Le pBR322 appartient à une série de vecteurs de clonage de
deuxiéme génération (Semi-artificiels) , caractérisé par :
1- pBR322 est un petit plasmide constitué de 4361 pb, dont la séquence
nucléotidique est complètement connue.
2- Il est maintenu de façon stable dans son hôte à un niveau voisin de 20 à 30
copies par cellule.
3- Il est possible d’y insérer un fragment d’ADN de bonne
dimension sans toutefois dépasser la taille de 10 kpb sous peine de
l’instabilité plasmidique.
4-Il possède deux gènes de résistances aux antibiotiques : l’un pour
l’ampicilline (AmpR), l’autre pour la tétracycline (TecR), l’expression de
l’un de ces deux gènes facilite la sélection des clones recombinants.
5- Il possède également 20 sites uniques pour des enzymes de
restriction.

13. Figure 4:Structure de plasmide PBR322.

14. Figure 5:La carte génétique du plasmide pBR322.

15. De nouvelle génération de plasmides plus puissants
sans cesse croissantes ont été développés depuis pBR322
et ces dérivés. C’est le cas de la famille pUC appelés (les
vecteurs de clonage de troixiéme génération).
-Les vecteurs de troixiéme génération sont :
-des petits plasmides d’environ 2700pb.
-Le plasmide pUC18/19 contient
gène de résistance à l’ampicilline de pBR322
-En plus il possède une partie du gène lac Z dans lequel a
été introduit un site multiple de clonage contenant
toute une série de sites de coupure unique.
Le plasmide de la famille pUC:

16. Figure 6:Structure de plasmide PUC 18/19.

17. Figure 7:La carte génétique de certain vecteur de type pUC.

18. 4.2-Les bactériophage (phages):
• Les phages sont des virus qui infectent les bactéries.
• Deux phages sont très utilisés comme vecteurs: le phage lamba
et le phage M13.
• Le phage lambda est un virus bactériophage qui infecte
la bactérie Escherichia coli. Ce bactériophage est un virus à ADN
double brin.
• Le bactériophage M13 est un phage dont la forme libre est
constituée d’une
membrane entourant un ADN simple brin de 6,4 kb.

19. Figure 8: bactériophage.

20. Figure 9:structure de bactériophage.

21. PHAGES λ:
• Découvert par Lederberg en 1950.
• Deux parties sont individualisées dans le phage lamba:
1. La tête : Elle renferme l’ADN viral (ADN double brin de 48 kb).
2. La queue : Elle permet la fixation du virus sur la cellule hôte
bactérienne.
• A chaque extrémité 5’ de l’ADN se trouve une région monocaténaire de
12 nucléotidesl’une complémentaire à l’autre.
• Leurs association donne une structure circulaire à l’ADN dans la cellule
hôte.
• L’ADN intégré se recombine avec le chromosome bactérien.
• L'intégration peut ensuite entraîner soit une cycle
lysogénique soit une cycle lytique.

22. • Lorsque le cycle lysogénique se
produit, les gènes viraux responsables
dela réplication virale ne sont pas
exprimés. L’ADN viral est alors qualifié
de prophage. La bactérie continue de
se reproduire par scissiparité est dite
lysogène.
• Une réponse lysogénique n’a pas
toujours de conséquence sur la vie de
la cellule.
• Sous l’effet d’un stress, la réponse
lysogénique peut devenir lytique.
La cycle lytique
consiste en la
production d’un grand
nombre de phages, et
ensuite à
l’éclatement de la
bactérie infectée.

23. Figure 10: le cycle lysogénique.

24. Figure 11: le cycle lytique.

25. Phages M13:
-Comme le bactériophage λ, le M13 est un petit virus d’E.
coli (6.407 kb). L'ADN de ce phage est sous forme simple brin
circulaire. Mais lors de la réplication un ADN complémentaire est
synthétisé.
Le M13 a des dérivés contenant une partie du gène lacZ,
avec un polylinker de 13 sites uniques de restriction. Ce qui permet
d'insérer des fragments d'ADN dans ces sites, et la sélection des
colonies blanches sur des boites contenant l'analogue X-gal.
Ce vecteur et ces dérivés peuvent être utilisés :
-Pour le clonage des fragments d'ADN de taille jusqu'à six
fois plus grand que l'ADN viral.

27. Le cycle du phage M13:
Entrée de M13 via le
pilus F d’E.coli :
l’infection d’une bactérie
E. coli par M13 s’effectue
via le pilus sexuel code
par un plasmide F.
Multiplication de M13:
-phage M13 s’adsorbe a
l’extremite du pilus bactérien
-Pénètre via ce pilus dans la bactérie, le brin
(+) est complété par les enzymes bactériens
en une forme double brin dite « RF » (forme
réplicative).
-Après plusieurs cycles de replication RF, la
synthese d’ADN deviendra
asymétrique. Seul le brin (+) sera produit. Il
sera revêtu de protéines lors de
l’expulsion à travers la membrane bactérienne.

28. Figure 12:Cycle du phage M13

29. • Le cosmide est un vecteur artificiel hybride : phage lambda-plasmide.
• Il se comporte comme un plasmide avec des sites de restriction
permettant l’insertion
d’ADN étranger et un gène de résistance aux antibiotiques (ampicilline).
• De plus, un site cos d’un virus lambda a été inclus dans
leur ADN circulaire ce qui permettra au cosmide d’être
empaqueté dans la tête d’un virus lambda.
• Intègre environ 40 kb d’ADN étranger.
4.3-Les
cosmides:

30. Figure 13: Structure d’une cosmid avec un site cos.

31. Figure 14: Structure d’un cosmid avec 2 site cos.

32. 4.4- Les phagémides :
Sont des vecteurs génétiques hybrides qui combinent les caractéristiques des plasmides
et des bactériophages. Ils sont utilisés pour cloner des gènes dans des bactéries et
permettent également l'expression contrôlée de ces gènes.
-Il se caractérise par:
-Hybride bactériophage-plasmide :ce qui lui permet de s'intégrer dans l'ADN du
bactériophage et de s'exprimer à l'intérieur de la cellule hôte.
-Gène d'insertion : Ils possèdent un site pour l'insertion d'un fragment d'ADN étranger.
-Sites de clonage :pour faciliter l'insertion de l'ADN étranger.
-Séquences d'emballage :ce qui permet l'empaquetage de l'ADN du phagémide dans
des phages.

33. -Haute capacité de clonage par rapport aux
plasmides.
-cloner un gène directement sous le contrôle
d'un promoteur bactérien.
-utilisés pour exprimer des protéines
étrangères dans les bactéries hôtes.
-utilisés pour sélectionner les bactéries qui
contiennent l'insert d'ADN souhaité (tels que
des gènes de résistance aux antibiotiques.
Figure 15: Structure d’un phagmide.

34. Sont des vecteurs de clonage, utilisées pour insérer, copier et répliquer des
fragments d'ADN spécifiques, tels que des gènes ou des séquences génomiques. Les
BAC sont particulièrement utiles pour cloner de grandes portions de l'ADN, comme
des régions de chromosomes entiers.Il se caractérise par:
-vecteurs de grande taille, capables de transporter des fragments d'ADN de plusieurs
centaines de kilobases.
-Ils possèdent un site de clonage multiple où l'ADN d'intérêt peut être inséré.
-peuvent contenir des marqueurs permettant de distinguer les clones d'ADN insérés
des clones vides.
-capables de maintenir de grands fragments d'ADN, y compris des séquences
répétées ou des régions chromosomiques complexes.

35. Figure 16 : Structure d’un BAC.

36. 1-taille max de l'insert
=300kb.
2-ADN circulaire.
3-Marqueur de sélection.
4-Entrée par
électroporation.
5-Peu d'événement de
recombinaison avec l'ADN
de l'hôte

37. Sont des vecteurs de clonage utilisés pour cloner de très grands
fragments d'ADN, en particulier dans les levures.
-Il se caractérise par:
1-Capacité à cloner de grands fragments d'ADN.
2-le répliquer au sein des cellules hôtes (Origine de réplication),
comme Saccharomyces cerevisiae.
3-Séquences de télomères Pour protéger les extrémités de l’ADN
répliqué.
4-La flexibilité du clonage le rend puissant dans la cartographie
génétique et les structures génétiques complexes.

38. Figure 17: Structure et clonage de YAC.

39. 1-taille max de l'insert
=1000kb.
2-ADN linéaire.
3-Site de réplication
autonome.
4-Polylinker (MCS) entrée
par transformation.
5-très instable car forte
fréquence de recombinaison
homologue avec l'ADN

40. 1. Réplication autonome et indépendante de l’ADN de la cellule hôte.
2. Petite taille: pour permettre l’insertion de grand fragment d’ADN étranger
3. Présence de gènes de sélection: sélection des cellules hôtes qui ont intégré un
vecteur.
4. Présence de sites de restriction localisés dans les gènes de sélection: permet de
sélectionner les cellules hôtes qui ont intégré un vecteur recombinant.
5. Stabilité: maintient sans modification dans la cellule hôte, quel
que soit le nombre de division.

41. sont des enzymes utilisées dans le clonage
moléculaire pour couper des fragments d'ADN
spécifiques.
Les enzymes de restriction sont sélectionnées
en fonction de leur capacité à couper l'ADN à
des endroits spécifiques, ce qui permet aux
chercheurs de sélectionner les fragments
d'ADN qui les intéressent. Les fragments
d'ADN sont ensuite reproduits en utilisant des
techniques de biologie moléculaire, telles
que la polymérase en chaîne (PCR) ou la
recombinaison génétique.
6-Les enzymes de
restriction:

42. Les ADN ligases sont des enzymes qui jouent
un rôle essentiel en biologie moléculaire et en
génie génétique, comme l'un des outils
majeurs de production d'ADN recombinant.
L'ADN ligase permet en particulier de suturer
les fragments d'ADN produits par des
enzymes de restriction.
L'ADN ligase permet de former une liaison
entre le groupement 5'-phosphate d'un
segment d'ADN et le groupement 3'-OH du
segment précédent sur le même brin.
L’ADN
ligase:

43. Figure 18: les enzymes de restriction et ligation.

44. Figure 18: les enzymes de restriction et ligation.

45. Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien précise. Leur
nom comporte plusieurs lettres (3 ou 4).
- La première lettre de dénomination de l’enzyme est écrite enmajuscule, elle
correspond au genre de la bactérie d’où a été extraite l’enzyme.
-La seconde lettre et la troisième lettre (en minuscules) correspondent à
l’espèce de la bactérie d’où l’enzyme est extraite.
-On peut avoir une quatrième lettre écrite en majuscule và la souche
bactérienne.
-Enfin pour terminer, un chiffre romain indique l’ordre decaractérisation de ces
enzymes.
7-Nomenclature des enzymes
de restriction:

46. Exemples:
Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site
reconnu: G / AATTC
Sma I Extraite de Serratiamarcescens site reconnu:
CCC / GGG
Pst I Extraite de Providenciastuartii site reconnu:
CTGCA / G

47. Les vecteurs de clonage sont des
molécules transpotant des fragments
d'ADN répliquers portant des fragments
insérés en utilisant des techniques d'ADN
recombinant .D'ailleurs il existe plusieurs
types de vecteurs de clonage on genie
genetique comme les plasmides les
cosmides les bacteriophage, BAC , YAC . Il
permet de construit des banques d'ADN
génomique et la compréhension des
principes fondamentaux de la biologie
moléculaire
8-Conclution:

48. 9-Références
bibliographique:
• Smith, nathans , Letter:A suggestednomenclature for bacterialhost modification
and restrictionsystemsandtheirenzymes», J. Mol. Biol., vol. 81,no 3, décembre
1973, p. 419–23
• S. Shuman,« DNA Ligases:Progress and Prospects », J. Biol.Chem., vol. 284, 2009,
p. 17365-17369
• Cours CLONAGEET VECTEURS DE CLONAGEDr ABDIM,Géniegénétique,Licence 3
Biochimie.
• Vecteurs_banques_2006.pdf perso.univ-rennes1.fr
• Vecteurs de Clonage|PDF|fr.scribd.com.
• le clonage.pdf fsesnv.univ-biskra.dz