PRESENTATION : chirurgie de genome

1. 1
Réaliser par :
EL IDRISSI sofyan
KHOULOUD Mohamed
Encadré par :
Pr. BENNANI Mohcine
Université Abdelmalek Essaâdi
Faculté des Sciences et Techniques de Tanger
Département de Biologie

2. plan
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 Introduction
 Les outils d’édition génomique
 Méga nucléases (MNs)
 nucléases à doigts de zinc (ZFNs)
 nucléases effectrices de type activateur de
transcription (TALEN)
 Courtes répétitions palindromiques groupées et
régulièrement espacées (CRISPR)
 Conclusion

3. Introduction
 Génie génétique : vise à modifier le génome des
êtres vivants.
 Thérapie génique : consiste à faire pénétrer des
gènes dans les cellules ou les tissus d'un individu
pour traiter une maladie.
 L’approche classique de thérapie génique
« le caractère aléatoire de l’insertion »
3

4. Les inconvénients de l’insertion aléatoire du gène
4
 l'intégration au niveau d'une région hétérochromatine
 L'intégration du transgène peut également avoir des
conséquences néfastes sur le développement de l'organisme
hôte :
- Par un changement de besoin nutritionnel
- L'expression du transgène dans une zone non ciblée
- l'intégration s'est faite à l'intérieur d'un gène endogène

5.  en 1999 les premiers essais de thérapie génique, conduits
par l'équipe d'Alain Fisher à l'hopital Necker
 Dix enfants sont
traités, et guérissent.
Les cellules souches de
leurs globules blancs
avaient été prélevées
dans leur moelle
osseuse et traitées in
vitro par un rétrovirus
désactivé. Mais voici
qu'en octobre 2002,
deux d'entre eux,
deviennent
leucémiques.

6. Edition génomique
Techniques de génie génétique reposant sur l’utilisation des
éndonucléases de restriction dans le but de modifier le
génome.
6

7. Les outils de base de l'édition génomique
les modifications étaient en grande partie aléatoires. Quatre
familles de nucléases sont utilisées pour couper l’ADN au niveau
souhaité :
 Méga nucléases (MN)
 Nucléase à doigt de zinc (ZFN)
 Nucléases effectrices de type activateur de transcription
(TALEN)
 CRISPR/ Cas system
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8. enzymes de restriction
 Des ciseaux moléculaire découvertes chez les bactéries
 Reconnait une séquence d’ADN spécifique et palindromique
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9. Méga nucléases (MNs)
 Les MN sont généralement de petite taille la plus petite est
composée de 163 AA, la plus grande comprend 586 AA.
 naturellement et couramment produites par certaines espèces
microbiennes.
 la caractéristique de reconnaître des séquences d’ADN de
grande tailles (séquences de 12 à 40 paires de bases).
 Les MN agissent sous la forme de monomères ou
d’homodimères.
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10. Méga nucléases (MNs)
Elles sont réparties en quatre familles
caractérisées par la présence d’un motif d’acides
aminés :
 LAGLIDADG –le group majoritaire
 GIY YIG (motif Glycine-Isoleucine-Tyrosine
Tyrosine-Isoleucine-Glycine )
 H-N-H (motif Histidine-Asparagine-Histidine)
 boîte His-Cys (d'histidines et cystéines)
10

11. 11
La taille du site de reconnaissance des MN
varie de 12 à 40 nucléotides

12. 12
La Méga nucléase « I-SceI »
Mécanisme de clivage par I-SceI

13. les MN artificiels « MN à façon »
13
• L’entreprise Cellectis a été pionnière dans la production et
l’étude des MN à façon.
• Les MN à façon sont développées pour reconnaître des
séquences cibles dans le génome des mammifères, dans le
but de modifier des locus chromosomiques.

14. La modification de la spécificité de
méga nucléases existantes
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15. La possibilité d’associer ou de fusionner des
domaines protéiques issus d’enzymes différentes
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16. Inconvénients
 Ces méthodes restent peu utilisées. Une raison est que
les domaines responsables de la reconnaissance de
l’ADN et de la cassure double brin sont très liés, ce qui
rend difficile la modification de l’un sans affecter
l’autre.
 les modules commerciaux de MN sont tout à fait chers.
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17. nucléases à doigts de zinc
(ZFNs)
 ZNF sont des protéines hybrides produit à partir d’un géne
chimérique
 L’atome de zinc central stabilise le repliement de la protéine
en établissant quatre liaisons avec deux résidus cystéine et
deux résidus histidine
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18. 18
Fok I : c’est un endonuclease I produit par
la bactérie « Flavobacterium
okeanokoites »

19. nucléases à doigts de zinc
(ZFNs)
 Chaque ZF reconnaît un triplet de nucléotides
 Les ZF sont assemblables entre eux pour former des protéines avec
de nouvelles spécificité de reconnaissance.
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20. Création d’une ZFN
20

21. Inconvénients
 l’ingénierie des génomes par les ZFN est
difficilement applicable aux régions dépourvues ou
pauvres en tri nucléotides GNN, car ces séquences
sont préférentiellement ciblées par les doigts de zinc
de type C2H2. Cette contrainte limite l’utilisation
large des ZFN afin de modifier des génomes.
 les modules commerciaux de ZFN sont tout à fait
chers
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22. Nucléases effectrices de type activateur de
transcription (TALEN)
 Sont des protéines recombinant hybrides produit à
partir d’un gène chimérique
 Les TALE sont des protéines produites par des
bactéries « Xanthomonas » qui infectent les plantes
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23. Construction de TALEN
 Lors de la construction du gène chimérique, le domaine
central répété du gène TALE d’origine est délété des
séquences codant pour les domaines de translocation (TD) et
d’activation de transcription (TAD) et de certaines séquences
du domaine central.
 La séquence de localisation nucléaire (NLS) qui est située
vers l’extrémité C-terminale de TALE, est placée à
l’extrémité N-terminale des TALENs.
23

24. 24
Crisper-cas9

25. Présentation générale
25

26. 26

27. 27
En janvier 2014, la
revue Cell avait publié la
toute première
application de cette
technique chez
des singes.

28. 28

29. Définition : CRISPR-cas
29
CRISPR ("Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats") :
« Courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées »
Cas ("CRISPR-associated") : gènes codant les endonucléases associées
à CRISPR

30. l'immunité adaptative ;
(acquisition + interference)
30

31. Les étapes Acquisition de l'immunité :
31

32. Phase d'interférence :
32

33. 33
- courtes séquences répétées
("crRNA") ; point de fixation des
protéines Cas
l'ADN invasif
- pre-crRNA : long transcrit
primaire issu de la matrice
CRISPR.
- crRNAs : courtes séquences
d'ARN issues de la maturation
des séquences répétées du
pre-crRNA
- tracrRNA ("trans-acting
small RNA") : petit ARN qui
s'apparie avec chaque
répétition du pre-crRNA
pour former un ARN double
brin [tracrRNA:crRNA]
- RNase III

34. 34
Le complexe
[Cas9:crRNA:tracrRNA] catalyse le
clivage endo-nucléolytique de
l'ADN double brin (linéaire ou
circulaire) cible. Cas9 est inactive
en absence des deux ARN guides.

35. Les domaines de l’endonuclease Cas
9
35
-le domaine HNH de
Cas9 clive le
brin complémentaire de
l'ADN cible
-le domaine RuvC clive
le brin non
complémentaire de
l'ADN cible

36. 36

37. La réparation-recombinaison
37

38. La réparation-recombinaison
 Une fois la coupure de l’ADN
effectuée, les mécanismes naturels de
réparation de l’ADN et la
recombinaison homologue permettent
d’incorporer une séquence modifiée
ou un gène nouveau.
38

39. 39
- système de réparation La
Recombinaison Homologue (RH),
- système de réparation par jonction
d'extrémités non-homologues (NHEJ)

40. La réparation-recombinaison
40
La séquence non
mutée introduite en
même temps que Cas9
et que l’ARN guide
vient alors remplacer
celle d’origine en
corrigeant la mutation
présente dans l’ADN
de la cellule à l’aide de
son système de
réparation homologue
(HR).

41. 41

42. 42

43. 43

44. Applications ;
44
fait partie des techniques de
génomique fonctionnelle. Elle
consiste à créer des mutants de
gènes dont la séquence
nucléotidique est connue ( découvrir
la fonction inconnue d’un gène
connu) .
La Génétique Inverse :

45. Knock out ;
45

46. Knock in :
46

47. Succès ;
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ce 28 octobre 2016, il s’agissait de la première fois que
des cellules modifiées par la technique CRISPR avaient été
injectées à un être humain adulte.( Le test a été effectué à l’hôpital
de Chine occidentale)

48. Inconvénients de CRISPR/Cas
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 une forte incidence enregistrée de clivage
non spécifique d'ADN.
 une application thérapeutique avec le
CRISPR-Cas9 pose en premier lieu la question
de l’administration.
 comment le délivrer jusqu’au cerveau ?
 les problèmes éthiques et de sécurité
prédominent. Les risques que les CRISPR
manquent leur cible sont faibles
 Seulement les maladies mono géniques.
Une technique simple, rapide et bon marché
mais il a aussi des inconvénients :

49. Conclusion
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Les avantages et inconvénients respectifs
des diverses méthodes ne sont pas encore
clairs et pourraient encore évoluer au gré
des avancées scientifiques et techniques.

50. 50