Cours de chromatographie

1. 1. Histoire
La première chromatographie a été réalisée en 1906 par le botaniste russe Mikhaïl
Tswett et consistait à séparer les pigments (en grec :"chromato") d'une feuille d'épinard.
Tswett avait observé la séparation des colorants végétaux, dont les chlorophylles,
lorsqu'il filtrait leur solution dans l'éther de pétrole, sur une colonne de carbonate de
calcium. Dans ces conditions, en effet, des zones colorées vertes et jaunes se forment.
Cette technique fut quasi-abandonnée jusqu'en 1930, où Edgar Lederer a purifié par la
méthode de Tswett la lutéine du jaune d’œuf.
En1938, Izmailov et Scraiber ont introduit la chromatographie sur couche mince (CCM
ou TLC), et Taylor et Urey ont introduit la chromatographie par échange d’ions.
Vers 1940, Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la chromatographie,
ils donnent le concept de chromatographie gaz-liquide et chromatographie de partage
liquide- liquide. Ils obtiennent le prix Nobel en 1952.

2. En 1952, mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).
En 1955 : première chromatographe gaz-liquide sur le marché (chromatographie en
phase gazeuse : CPG ou GC).
En1965, Halasz et Horvath ont mis au point la Chromatographie Liquide Haute
Performance (CLHP ou HPLC).
En 1979, première séparation chirale par HPLC.

3. 2. Principe
La chromatographie est une méthode de séparation non destructrice d’un mélange
liquide ou gazeux en ses différents constituants. C’est également une méthode
analytique qui a pour but d’identifier et de quantifier les composés d’un mélange
homogène.
Il s'agit de la réalisation d'un tri entre les différentes espèces moléculaires d'un
mélange.
On va ainsi forcer toutes les molécules à effectuer un parcours commun parsemé
d'obstacles : certaines espèces le franchiront aisément d'autres auront plus de
difficultés. Pour entraîner les molécules il faut les véhiculer dans un fluide : la
phase mobile qui peut être soit un liquide soit un gaz.
L'obstacle à franchir, qui ne doit pas être entraîné par la phase mobile, doit être fixe
et produire des effets reproductibles : il constitue la phase stationnaire. Cette phase
stationnaire, le plus souvent emprisonnée dans une colonne, peut être un solide ou un
liquide immobilisé sur un solide.

4. 3. Classification.
Les méthodes chromatographiques regroupent des techniques très variées qui
peuvent être classées selon trois modalités différentes :
• Classification selon la nature physique des phases.
• Classification selon le phénomène mis en œuvre.
• Classification selon le procédé opératoire.

5. 3.1. Classification selon la nature physique des phases
Dans ce classement :
la phase mobile est un fluide qui peut être soit liquide soit gazeux ;
la phase stationnaire peut‐être soit un
solide finement pulvérisé,soit un liquide immobilisé sur une
phase fixe.
La combinaison de ces différentes possibilités permet donc de distinguer
quatre types de chromatographie :
La chromatographie liquide‐liquide (CLL).
La chromatographie liquide‐solide (CLS).
La chromatographie gaz‐liquide (CGL).
La chromatographie gaz‐solide (CGS).
La chromatographie supercritique (CSF).
.

6. 3.2. Classification selon le phénomène mis en œuvre
Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction
avec les molécules à séparer. On distingue ainsi:
La chromatographie d’adsorption : le paramètre physico‐chimique
concerné est le coefficient d’adsorption. Par extension, on pourrait y rattacher la
chromatographie d'affinité, qui correspond à un cas où les propriétés d'adsorption
de la phase stationnaire sont spécifiques vis-à-vis d'un (ou une famille) de
composé(s).
La chromatographie de partage : la séparation repose sur le
coefficient de partage du soluté entre les deux phases.
La chromatographie par échange d’ions : la séparation repose sur les
coefficients de distribution ionique.
La chromatographie d’exclusion (chromatographie de
perméation ou de filtration sur gel) : le coefficient de distribution prend le nom de
coefficient de diffusion.

7. 3.3. Classification selon le procédé opératoire
Selon l’immobilisation de la phase stationnaire on distingue :
La chromatographie sur colonne : la phase stationnaire est
contenue dans une colonne cylindrique en verre ou en métal.
La chromatographie sur papier : une surface de cellulose
considérée comme support maintient par imbibition une phase stationnaire
liquide.
La chromatographie sur couche mince (CCM) : la phase
stationnaire est dans ce cas retenue sur une surface plane (verre, matière
plastique ou feuille d’aluminium) qui est recouverte d’un mince couche de 0,2
à 0,3 mm d’épaisseur de gel de silice, de cellulose, d’alumine ou même de
grains de résines échangeuses d’ions.

8. 4. Chromatographie d’adsorption
Cette chromatographie liquide-solide est basée sur la répartition des solutés entre
la phase stationnaire fixe (l'adsorbant) et la phase liquide mobile (l’éluant).
Chacun des solutés est soumis à une force de rétention (par adsorption) et une
force d'entraînement par la phase mobile. L'équilibre qui en résulte aboutit à une
migration différentielle des solutés de l'échantillon à analyser, ce qui permet leur
séparation.

9. 4.1. L'adsorption
C’est la fixation des molécules dissoutes par la phase stationnaire. Cette fixation est
due à l'établissement de liaisons secondaires de surface entre l'adsorbant et la
molécule adsorbée: liaison dipôle-ion, ou dipôle-dipôle ou liaison de Van der Waals.
4.2. Les adsorbants
Ce sont des solides très divisés (l'adsorption étant un phénomène de surface, il faut
que l'adsorbant présente la plus grande surface utile possible). La qualité d'un
adsorbant dépend de sa pureté, de sa surface, de son homogénéité, de sa teneur en
eau.
Il est caractérisé par les critères suivants :
• La capacité d'adsorption : on distingue les adsorbants faibles (à faible
capacité d'adsorption), comme le talc ou le carbonate de sodium et les adsorbants
forts (à forte capacité d'adsorption) comme le gel de silice ou l'alumine.

10. • La polarité : certains adsorbants présentent une forte polarité, comme le gel de
silice ou l'alumine, tandis que d'autres, au contraire, ont une faible polarité comme le charbon
actif.
• La granulométrie : un adsorbant présentant une granulométrie faible assure une
meilleure séparation mais par contre, celle-ci se fait beaucoup plus lentement.
Le gel de silice est l’adsorbant le plus utilisé et le plus rentable à essayer en premier lieu
pour séparer des composés neutres contenant un ou deux groupes fonctionnels. Par
contre, pour séparer des bases, il est préférable d’utiliser de l’alumine plus basique que
la silice. Ces deux adsorbants se trouvent dans le commerce additionnés d’une
substance qui permet une visualisation des dépôts sous UV.

11. 4.3. Les solvants ou éluant
Pour un système chromatographique donné, le pouvoir éluant dépend de la polarité
du solvant. Plus un éluant est polaire, plus il entraînera facilement une substance
polaire. En revanche, un solvant apolaire possèdera un mauvais pouvoir éluant vis à
vis des substances polaires mais entraînera facilement un constituant apolaire. On
utilise soit un solvant pur soit un mélange de plusieurs solvants de façon à " ajuster"
son pouvoir éluant au système chromatographique étudié.

12. 4.4. L’interaction substance-adsorbant et substance-éluant
Les interactions substance-adsorbant correspondent essentiellement à
l'établissement de liaisons du type dipôle-dipôle, dipôle-ion ou de liaisons de
Van der Waals. En général, plus un adsorbant est polaire, plus il fixe les
substances polaires.
Les interactions substance-éluant sont de deux types :
• Dissolution de la substance par l'éluant : les substances ont
tendance à se dissoudre dans l'éluant et à migrer avec lui. C'est ce phénomène
qui est prépondérant dans le cas de solvants peu polaires (hydrocarbures, éther,
composés carbonylés).
• Déplacement des molécules adsorbées par l'éluant : les molécules
d'éluant recherchent les mêmes sites d'adsorption que les molécules de la
substance adsorbée et "déplacent " ces dernières. C'est ce phénomène qui est
prépondérant dans le cas de solvants polaires et protogènes (alcools, eau,
acides).

13. La chromatographie d'adsorption est appliquée selon différentes techniques :
• sur couche mince : le gel adsorbant (cellulose, silice) est coulé sur une
plaque (verre, aluminium, plastique), mélangé à un liant (platre) ;
• sur papier : en chromatographie ascendante ou radiale ; dans cette
technique le papier constitue la phase fixe ;
• sur colonne : ouverte à pression ambiante, en flash chromatographie, à
moyenne pression, en HPLC.

14. 4.1. Chromatographie sur couche mince
4.1.1. Définitions et appareillage
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur
des phénomènes d'adsorption : la phase mobile est un solvant ou un
mélange de solvants, qui progresse le long d'une phase stationnaire fixée
sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique
ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase
stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur
nature et de celle du solvant.

15. Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche mince sont:
• la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme
variable, fermé par un couvercle étanche ;
• la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou
d'un autre adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le
sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris) l'amidon ou un polymère organique ;
• l'échantillon : environ un microlitre (µl) de solution diluée (2 - 5%) du
mélange à analyser,
déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l'éluant ;
• l'éluant : un solvant pur ou un mélange qui migre lentement le long de la
plaque en entraînant les composants de l'échantillon

16. 4.1.2. Principe de la technique
Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve,
l'éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En
outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière
le front du solvant. Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques
retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité
dans la phase mobile. Les composés se déplacent donc alternativement de la
phase stationnaire à la phase mobile, l'action de rétention de la phase
stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d'adsorption.
Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible
polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.

17. 4.1.3. Adsorbants et plaques chromatographiques
Par ordre d'importance décroissante, les adsorbants employés en CCM
sont : le gel de silice, l'alumine, le kieselguhr et la cellulose. Les plaques
vous seront fournies prêtes à l'emploi
4.1.4. Choix de l'éluant
L'éluant est formé d'un solvant unique ou d'un mélange de solvants. Un
éluant qui entraîne tous les composants de l'échantillon est trop polaire;
celui qui empêche leur migration ne l'est pas suffisamment.

18. 4.1.5. Dépôt de l'échantillon
L'échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatil, qui n'est pas
forcément le même que l'éluant : on emploie fréquemment le trichlorométhane
(chloroforme), la propanone ou le dichlorométhane. La solution est déposée en un
point de la plaque situé à environ 1 cm de la partie inférieure.
Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible;
idéalement, il ne devrait pas dépasser 3 mm. Ce sont généralement les dépôts les
moins étalés qui permettent les meilleures séparations.
Pour augmenter la quantité déposée, il est toujours préférable d'effectuer plusieurs
dépôts au même point, en séchant rapidement entre chaque application plutôt que de
déposer en une seule fois un grand volume d'échantillon qui produirait une tache plus
large.

19. L'échantillon est déposé à l'aide d'une micropipette ou d'un tube capillaire en
appuyant légèrement et brièvement l'extrémité de la pipette sur la couche d'adsorbant
en prenant soin de ne pas le détériorer. On peut aussi utiliser l'extrémité, un peu
émoussée, d'un cure-dent.
On vérifie l’identité des composants présumés d’un échantillon, en procédant à un
dépôt séparé d’une solution de chacun d’eux puis à celui de leur mélange. Ces
solutions témoins permettent de comparer la migration de chaque composé avec celle
de l’échantillon à analyser

20. Développement de la plaque
Le développement consiste à faire migrer le solvant sur la plaque. Dans les
analyses usuelles de laboratoire, le principal type de développement est la
chromatographie ascendante : la plaque est placée en position verticale dans
une cuve et le solvant qui en recouvre le fond monte par capillarité.
Le niveau de liquide est ajusté à environ 0,5 cm du fond de la cuve; on place
souvent du papier filtre contre les parois de la cuve pour saturer plus
rapidement la cuve en vapeurs d'éluant et éviter les effets de bords. Pendant le
développement du chromatogramme, la cuve doit demeurer fermée et ne pas
être déplacée.
Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1 cm de l'extrémité
supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant est
marqué par un trait fin, puis la plaque est séchée à l'air libre ou à l'aide d'un
séchoir.

21. 4.1.7. Révélation
L'identification des substances isolées se fait selon différentes méthodes
• Directement si les substances sont colorées.
• A l'aide de révélateurs si elles sont incolores afin de les transformer en
taches colorées; les produits sont souvent décelés par leurs réactions
fonctionnelles classiques : les acides aminés par la ninhydrine qui donne avec la
plupart une couleur bleu-violet, les acides organiques par des indicateurs colorés,
les sucre par le réactif de Molisch qui utilise le pouvoir réducteur des sucres.
Quelques réactifs comme l'iode ou le permanganate donnent des colorations non
spécifiques avec la plupart des composés organiques.

22. • Toutes les substances ayant une absorption dans la région au-dessus de 230
nm sont étudiées sur des supports additionnés de corps fluorescents par irradiation de
lumière UV à ondes courtes (λmax< 254 nm). L'emploi de couches non additionnées de
produits fluorescents permet aussi la mise en évidence de beaucoup de substances dans
l'UV à ondes courtes (λmax <254 nm) ou à ondes longues (λmax > 366 nm) par suite de
la fluorescence propre des composés.
Dans tous les cas, il faut noter les positions des taches colorées juste à la fin de la
chromatographie en les cerclant car certains produits disparaissent avec le temps.

23. 4.1.8. Calcul de Rf (retarding factor ou rapport frontal)
Le Rf est caractéristique d’un produit dans un éluant donné et pour une phase
stationnaire donnée (figure 2).
Figure 2. Calcul du rapport frontal

24. 4.1.9. Applications de la CCM
Lorsque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et
rapide de la pureté d'un composé organique. Si l'analyse, réalisée avec divers
solvants et différents adsorbants, révèle la présence d'une seule substance, on peut
alors considérer que cet échantillon est probablement pur.
De plus, étant donné que la CCM indique le nombre de composants d'un mélange,
on peut l'employer pour suivre la progression d'une réaction.
La CCM est également la technique habituellement employée pour rechercher le
meilleur solvant, avant d'entreprendre une séparation par chromatographie sur
colonne.

25. 4.2. Chromatographie sur colonne
Alors que les autres méthodes chromatographiques sont habituellement
employées pour l'analyse et la séparation de très faibles quantités de
produits, la chromatographie sur colonne peut être une méthode
préparatoire ; elle permet en effet la séparation des constituants d'un
mélange et leur isolement, à partir d'échantillons dont la masse peut
atteindre plusieurs grammes.

26. Elle présente cependant plusieurs inconvénients:
• de grandes quantités de solvant sont nécessaires à l'élution ;la durée de
l'élution est généralement très grande ;la détection des composés exige une
attention constante.
Elle est adaptée à la purification de faibles quantités de produit, lorsque les
conditions sont au point. Cependant, la méthode étant très empirique, sa mise au
point nécessite souvent de nombreux essais

27. 4.2.1. Description et principe
C'est une technique basée sur des phénomènes d'adsorption. La phase solide, le
plus souvent l'alumine ou la silice, remplit une colonne de longueur et de
section variables;
l'échantillon, en solution concentrée, est déposé en haut de la colonne et la
séparation des composants résulte de l'écoulement continu d'un éluant,
traversant la colonne par gravité ou sous l'effet d'une faible pression
Les molécules sont entraînées vers le bas à des vitesses variables selon leur
affinité pour l'adsorbant et leur solubilité dans l'éluant.
Le chromatogramme se développe en formant une succession de zones
cylindriques qui se séparent en migrant vers le bas. A mesure que chaque zone
s'écoule de la colonne, on la recueille.

28. 4.2.2. Facteurs dont dépend la séparation
Quatre facteurs interviennent: l'adsorbant, l'éluant, la dimension de la colonne et la
vitesse d'élution.
4.2.2.1. Adsorbant
Le plus utilisé est l'alumine; cependant, on la limitera aux composés organiques
stables car, sous sa forme basique, elle peut provoquer la déshydratation des esters
par exemple.
La quantité d'adsorbant dépend de la difficulté de la séparation et de la masse
d'échantillon. On peut considérer que pour chaque gramme d'échantillon, il faut 30
à 50 g d'adsorbant si la polarité des composants à séparer est très différente et
jusqu'à 200 g si la séparation est difficile.

29. 4.2.2.2. Eluant
L'éluant est en général un mélange de deux solvants. Au début de l'élution,
on commence par le solvant le moins polaire qui entraîne les substances les
moins retenues par l'adsorbant (les moins polaires). Ensuite on fait varier la
composition de l'éluant en additionnant graduellement le solvant le plus
polaire. Ainsi les composés les plus polaires, retenus sur l'adsorbant, ne
migreront que graduellement vers le bas de la colonne.

30. 4.2.2.3. Dimension de la colonne
Les colonnes spécialement conçues pour cet usage ont à leur base une plaque de
verre fritté ou de porcelaine qui permet l'écoulement libre de l'éluant tout en
empêchant le passage de l'adsorbant.
La quantité d'adsorbant est telle qu'il occupe une hauteur égale à environ 10 fois
le diamètre de la colonne. Il faut également prévoir un espace de 10 cm environ
au-dessus de l'adsorbant pour placer le solvant.

31. 4.2.2.4. Vitesse d'élution
Elle doit être la plus constante possible. Il faut qu'elle soit
suffisamment lente pour que le soluté soit au plus près de l'équilibre
entre les phases liquide et adsorbée.
Elle ne doit pas être trop lente car sinon les substances diffusent dans
le solvant et on obtient des bandes de plus en plus larges et une
séparation médiocre.

32. 4.2.4. Dépôt des produits à analyser
Ils doivent former une zone cylindrique étroite dans le haut de la colonne.
.
On ajuste d'abord le niveau de solvant pour qu'il soit juste au-dessus de celui de
l'adsorbant. A l'aide d'une pipette, on coule l'échantillon au sommet de la colonne
de façon uniforme sur toute la surface de la colonne sans la déformer.
l'échantillon est ainsi adsorbé uniformément au sommet de la colonne. On peut
placer un verre fritté ou une rondelle de papier filtre au-dessus de l'adsorbant
pour prévenir une remise en suspension de l'adsorbant.

33. 4.2.5. Elution
On peut alimenter la colonne en continu à l'aide d'une ampoule de coulée ou
bien ajouter manuellement l'éluant. Dans tous les cas, la surface de
l'adsorbant ne doit jamais être au contact de l'air
Pour la plupart des opérations, une vitesse de 5 à 50 gouttes à la minute
convient

34. 5. Chromatographie de partage
Il s’agit d’une chromatographie liquide- liquide. Elle est fondée sur la
différence de solubilité des substances à séparer dans deux fluides non
miscibles. Elle est mise en pratique en chromatographie sur papier. Un des
fluides est un liquide retenu sur un support inerte et constitue la phase
stationnaire. L'autre, liquide ou gaz en déplacement, constitue la phase mobile.
Le facteur principal qui intervient est le coefficient de partage entre chaque
phase. On peut séparer des solutés dont les coefficients de partage entre les
deux phases sont différents. Les plus solubles dans la phase mobile se
déplacent plus facilement que ceux qui le sont moins.

35. 5.2.2. Phase stationnaire
Elle doit tapisser de façon aussi uniforme que possible les parois
des pores du support. Cette phase doit être très peu miscible avec la
phase mobile et sa viscosité doit être la plus faible possible pour que
les phénomènes de transfert de masse et de diffusion soient facilités
.

36. L'imprégnation peut être réalisée de plusieurs façons :
Par évaporation du solvant : la phase stationnaire est dissoute
dans un solvant approprié puis mélangée avec le support. Le solvant est
ensuite éliminé par évaporation.
par filtration du solvant : dans ce cas le solvant de la phase
stationnaire est éliminé par filtration.
par percolation : la phase stationnaire est "dissoute" dans un
solvant volatil, puis on la fait percoler à travers la colonne ; on chasse le
liquide interstitiel puis on évapore le solvant par un courant gazeux .

37. 5.2. La phase mobile
Le choix de la phase mobile est empirique ; on se laisse guider par la
notion de polarité.
Si le support polaire et la phase mobile moins polaire que la phase
stationnaire : chromatographie de partage en phase normale. Plus un composé
sera polaire, plus il sera retenu, plus, il sortira tard.
Si le support apolaire et la phase mobile plus polaire que la phase stationnaire
: chromatographie de partage en phse inverse.
Plus un composé sera apolaire, plus il sera retenu, plus, il sortira tard.

38. 7. Chromatographie d'exclusion
7.1. Principe
La chromatographie d'exclusion, ou gel filtration ou gel perméation est
fondée sur la "rétention" des molécules de soluté en fonction de leur
taille en raison de leur pénétration dans les pores, remplis de solvant,
d'une phase stationnaire appropriée. Si on suppose que les molécules de
soluté ne présentent aucune affinité pour les parois de la phase stationnaire
particulaire, les grosses molécules ne pourront pas pénétrer dans les pores ;
elles migreront plus rapidement que les petites molécules qui peuvent,
quant à elles, pénétrer dans un plus grand nombre de pores.

39. 7.2. phase stationnaire
La phase stationnaire est généralement un polymère poreux (dextrane, polyacrylamide,
agarose) dont les pores ont des dimensions choisies en rapport avec la taille des
espèces à séparer. On réalise une sorte de tamis à l'échelle moléculaire, dit à
perméation sélective (figure 7) .
Si le gel est hydrophile on parle de filtration de gel et s’il est à caractère hydrophobe on
parle de perméation de gel.
Figure 7. Tamisage moléculaire.

40. 7.3. Phase mobile
Il s’agit d’un solvant qui induit le gonflement de la phase stationnaire et dissout
l’échantillon. On utilise l’eau pour les gels hydrophiles et les solvants
organiques (chloroforme, DMF…) si le gel est hydrophobe.
7.4. Applications
7.4.1. La séparation de groupes de molécules de masses molaires très
différentes
Dessalage : les protéines et les polypeptides peuvent être dessalés ou
séparés de substances de faibles masses molaires avant concentration.
Extraction du phénol dans la préparation d'acides nucléiques.
Interruption de réactions entre macromolécules et réactifs de faible
masse molaire.
extraction de produits, cofacteurs ou inhibiteurs d'enzymes