Ce document traite des diagnostics prénataux et des techniques de laboratoire en génétique, notamment l'exploration des dyschromosomies, telles que les triploïdies et les trisomies. Il décrit les méthodes d'analyse chromosomique, y compris le caryotypage et les techniques de biologie moléculaire comme la FISH, ainsi que les prélèvements nécessaires comme l'amniocentèse et la biopsie de villosités choriales. Le document souligne également l'importance du conseil génétique en cas d'anomalies chromosomiques détectées.

1. DIAGNOSTIC ANTENATAL ET FOETAL LES TECHNIQUES DE LABORATOIRE EN GENETIQUE METHODES D’EXPLORATION Dyschromosomies dont la fréquence varie entre 10 à 20% avec essentiellement les triploïdes et les trisomies mais également les disomies et les mosaïques confinées au placenta.

2. l’organisation du génome humain Le génome = 3 milliard de pb Nombre de gènes : environ 30 000 1) Les Chromosomes : - 23 paires - 400-550 bandes chromosomiques 2) Une bande : 5 à 10 mégabases 130 gènes en moyenne (densité génique) distance moyenne entre 2 gènes : 20 000 à 30 000 pb 3) Un gène : - la taille : 10 000 pb en moyenne avec d’énormes variations 1) Les anomalies des chromosomes -> maladies chromosomiques - Anomalies de nombre : aneuploïdies - Anomalies de structure > 5-10 Mbases 2) Les anomalies de régions chromosomiques : -> plusieurs gènes concernés Syndromes microdélétionnels délétions < 5 mégabases duplications < 5 mégabases Les anomalies géniques : un seul gène défectueux - séquence d’ADN - méthylation de l’ADN

3. les stratégies d’analyse en génétique Analyse des trois niveaux d’organisation du génome 1 Analyse chromosomique =  la cytogénétique : Caryotype  la cytogénétique moléculaire : hybridation sur chromosomes par techniques de FISH  biologie moléculaire Analyse de régions chromosomiques  techniques de FISH  biologie moléculaire Analyse des gènes  biologie moléculaire

4. Les techniques de cytogénétique dans le DPN : le caryotype définition du caryotype rappels sur la mitose et les chromosomes réalisation d’un caryotype Différents prélèvements

5. 1.Définition du caryotype La technique qui consiste à colorer les chromosomes en métaphase puis à prendre une photo lorsqu'ils sont étalés pour les dénombrer , est appelée technique de caryotypage. On dit que l'on réalise un caryotype .

7. 2. Rappel sur les chromosomes Les différents stades de condensation de l’ADN (1) une molécule d'ADN double brin (2) et (3) chromatine ( ADN avec histones ) au cours de l'interphase (4) chromatine condensée au cours de la prophase (5) chromosome en métaphase. télomère télomère centromère

9. coloration directe par un colorant basique : le Giemsa coloration par le Giemsa après dénaturation par la trypsine à bandes GTG (Trypsine Giemsa) coloration par le Giemsa après dénaturation par la chaleur à bandes RHG (Reverse Heat Giemsa)

10. 2. Rappel sur la mitose : place de la mitose dans le cycle cellulaire

11. 3. Réalisation d’un caryotype : prélèvement et recueil des cellules amniotiques Centrifugeuse -> recueil des cellules

12. 3. Réalisation d’un caryotype : étape de culture cellulaire Hotte à flux laminaire milieu stérile nutritif Incubation à 37°C et 5% CO2 étuve

13. 3. Réalisation d’un caryotype : obtention de mitoses en métaphase 1 Arrêt des mitoses en métaphase par la colchicine :  chromosomes condensés au maximum  augmentation de mitoses 2 Choc hypotonique : entrée massive d’eau dans la cellule  éclatement des cellules  dispersion des chromosomes 3 Fixation des chromosomes par un fixateur 4 Etalement sur lame des chromosomes fixées thermotron : enceinte avec température et degré d’hygrométrie contrôlés pour un étalement optimal de la goutte

14. 2.Rappel sur la mitose : Les quatre phases de la mitose 1 4 2 3

15. Choc hypotonique : entrée massive d’eau dans la cellule éclatement des cellules dispersion des chromosomes

16. Fixation des chromosomes par un fixateur

17. 3. Réalisation d’un caryotype : Vérification de la richesse des mitoses mitose

18. 3. Réalisation d’un caryotype : dénaturation et coloration des chromosomes coloration directe par un colorant basique : le Giemsa coloration par le Giemsa après dénaturation par la trypsine  bandes GTG (Trypsine Giemsa) coloration par le Giemsa après dénaturation par la chaleur  bandes RHG (Reverse Heat Giemsa)

19. 3. Réalisation d’un caryotype : analyse des mitoses au microscope à contraste de phase

20. 3. Réalisation d’un caryotype : classement des chromosomes cellule diploïde : les chromosomes homologues par paire identique les chromosomes sexuels = gonosomes : XX ou XY les autosomes : 22 paires  par taille décroissante  fonction de la position du centromère le banding : 300 bandes 400 bandes 550 bandes >550 bandes

21. 3. Réalisation d’un caryotype : classement des chromosomes après giemsa grands à centromères presque médian grands à centromère distaux Chromosomes de taille moyenne grands acrocentriques petits à centromères médian petits acrocentriques Chomosomes sexuels

22. 3. Réalisation d’un caryotype : banding des chromosomes: 400-550 bandes

23. 4. Les différents prélèvements caryotype à partir de l’amniocentèse Quoi ? - Le liquide amniotique Quand ? Amniocentèse « classique » : à partir de 14 SA Amniocentèse tardive : 32 SA Combien ? - quantité prélevée : 1 ml par SA - 2 flacons Comment ? - ponction transabdominale - asepsie rigoureuse (bloc opératoire, tubes falcon stérile) Prélèvement fragile ? - transport à température ambiante Mise en culture - deux tubes prélevés  deux cultures durée de la culture : - multiplication spontanée des cellules -> autour de 10 j Le nombre de clones : - adhésion des cellules sur la paroi - 1 cellule => un clone cellulaire

24. 4. Les différents prélèvements caryotype à partir de l’amniocentèse Réalisation du caryotype : - sur les deux cultures - deux marquages : bandes RHG et bandes GTG Avantages : - belles mitoses  diagnostic des anomalies de structure chromosomique - pas de contamination par des cellules maternelles - cellules du LA = cellules du fœtus Inconvénients : - complications liées au prélèvement : 0,5 à 1% de perte foetale - délai de réponse : 10 jours

25. Dans le LA Après culture clones issus de cellules différentes Culture A Culture B Pseudo-mosaïcisme Mosaïcisme vrai Caryotype du liquide amniotique avec une mosaïque

26. 4. Les différents prélèvements Prélèvements prénataux  caryotype fœtal - les villosités choriales = fin du premier trimestre (10-13+6j SA) - le liquide amniotique = Amniocentèse : deuxième trimestre Amniocentèse « classique » : à partir de 14 SA Amniocentèse tardive - le sang fœtal = cordocentèse : troisième trimestre - biopsie de tendon foetal Autres prélèvements  caryotype constitutionnel - sang des parents

27. 4. Les différents prélèvements 4.1.caryotype à partir du sang du cordon Prélèvement au bloc opératoire sous contrôle échographique - tube hépariné - transport à température ambiante Mise en culture - sous hotte à flux laminaire - dans un flacon Falcon avec milieu de culture - 1 -2 ml de sang - addition de phytohémaglutinine  multiplication des lymphocytes T Culture à 37°C sous 5% de CO2 - 1 culture sur 3 jours Réalisation du caryotype

28. 5. les prélèvements prénataux : caryotype à partir des villosités choriales 1 Prélèvement - sous contrôle échographique - avec une canule d’aspiration - par voie vaginale ou par voie abdominale 2 Transport immédiat dans tube stérile au laboratoire 3 deux techniques au laboratoire - caryotype après culture - caryotype direct si poids >5 mg 1 mésoblaste extra-embryonnaire 2 cytotrophoblaste 3 syncytiotrophoblaste

29. 4. Caryotype direct à partir des villosités choriales Mitoses spontanées des cytotrophoblastes  caryotype direct Technique : - sur la VC : colchicine , choc hypotonique , fixation des VC - une étape supplémentaire : la dilacération de la VC dans du liquide d’éjection  isolement des cellules du cytotrophoblaste - étalement avec un étaleur de mitoses - marquage - analyse et classement des chromosomes Avantages du direct : - résultat le jour même - pas de contamination par des mitoses maternelles Inconvénient : - qualité moyenne des mitoses

30. 4. Caryotype après culture des villosités choriales 1 Les cellules mises en culture = le tissu extra-embryonnaire, syncitiotrophoblaste et cytotrophoblaste  lavage pour enlever les caillots sanguins  nécessité de trier les VC avant la mise en culture pour éviter une contamination maternelle 2 Mise en culture des cellules  dissociation des VC par trypsine 3 La culture : comme le LA - une seule culture 4 Le caryotype :

31. Origine des VC Cytotrophoblaste = direct Tissu extra-embryonnaire = culture caryotype de 2 tissus d’origine différente

32. Problème des mosaiques sur VC  mosaïque retrouvée aussi chez le fœtus  mosaïque confinée au placenta = non retrouvée dans le LA ou le sang foetal : 1 à 2% des VC

33. 5. Anomalies du caryotype = anomalie des chromosomes Anomalies de nombre = aneuploidie > 46 chromosomes  triploïdie : 69 chromosomes  trisomie : 3 chromosomes homologues  marqueur surnuméraire : petit « chromosome » surajouté < 46 chromosomes  monosomie : absence d’un chromosome Anomalie de structure = 46 chromosomes Structure modifiée : Échange de matériel entre 2 chromosomes Délétion Duplication…..

34. 5.1. Anomalies de nombre du caryotype : triploidie 69,XXXou XXY ou XYY 69,XXX ou XYY 69,XXX ou XXY

35. 5.2. Anomalies de nombre du caryotype : trisomie

36. 5.3. Anomalies de nombre du caryotype : marqueur surnuméraire : 47, XY,+mar Caryotype masculin un marqueur chromosomique en mosaique (11/16) sur les cellules étudiées

37. 5.4 . Anomalies de structure du caryotype Les anomalies de structure équilibrées les plus fréquentes : les translocations Translocation réciproque Translocation Robertsonienne

38. 5.5 . Anomalies de structure du caryotype 45,XX,t(13;14)(q10;q10)

39. 5.6 . Anomalies de structure du caryotype Des anomalies de structure équilibrées moins fréquentes : les inversions et les insertions Inversion paracentrique insertion Inversion péricentrique

40. 5.7. Anomalies du caryotype : Les anomalies de structure déséquilibrées délétion duplication chromosome en anneau isochromosome

41. 5.6 . Anomalies de structure du caryotype RCIU post natal + CIA : 46,XX,del(13)(q21.1)

42. 5.8 . Anomalies de structure du caryotype 46,XX,r(14)(p11.2q32)

43. 6. Conseil génétique devant une anomalie du caryotype : Anomalie de structure équilibrée formation de gamètes déséquilibrés FCS, MFIU nouveau-né avec malformation, dysmorphie, retard mental Méiose Population à risque : parent porteur d ’une anomalie chromosomique équilibrée

44. trisomie 13 45,XX,t(13;14) méïose trisomie 14 fécondation Gamete normal Der(13;14) Disomie 14 Disomie 13

45. Les techniques de cytogénétique moléculaire dans le DPN 1 Analyse chromosomique =  la cytogénétique : Caryotype standard  la cytogénétique moléculaire : hybridation sur chromosomes par techniques de FISH  biologie moléculaire Analyse de régions chromosomiques  techniques de FISH  biologie moléculaire Analyse des gènes  biologie moléculaire

46. Les techniques de cytogénétique moléculaire dans le DPN 1 le principe de la FISH 2 application : aneuvysion 3 application : microdélétions invisibles sur un caryotype 4 Application : identification des marqueurs Limite de la technique

47. 1. le principe de la FISH : Deux propriétés de la molécule d’ADN 1) La complémentarité de l’ADN double hélice constituée de bases complémentaires liée entre elles par des liaisons hydrogène A = T G C 2 ) La dénaturation de l’ADN - Thermique : rupture des liaisons hydrogène  ADN simple brin Réversibilité : rétablissement des liaisons hydrogène  ADN double brin

48. 1. le principe de la FISH = Fluorescence In Situ Hybridation 1 ) L’ADN cible : ADN sur lequel est faite l’hybridation - In situ : les chromosomes 2) Une sonde : ADN ou ARN marqué - fixation de fluorochromes sur la sonde  sonde fluorescente 3) Hybridation de l’ADN cible avec une sonde = Etablissement de LH entre la sonde fluorescente et l’ADN cible  ADN cible fluorescent

49. 1. principe de la FISH : Les principales étapes d’une FISH 1 Etape de codénaturation - sur plaque chauffante - dénaturation des chromosomes - dénaturation de la sonde 2 Etape d’hybridation à 37°C pendant une nuit - fixation de la sonde sur les chromosomes - renaturation progressive des chromosomes et de la sonde 3 Lavages - élimination de l’excès de sonde non fixée sur les chromosomes  Augmentation de la spécificité 4 Contre-coloration des chromosomes avec le DAPI - agent intercalant entre les bases de l’ADN - fluorescent

50. 1. le principe de la FISH : lecture lecture avec un microscope à épifluorescence

51. 2. Applications de la FISH : différentes sondes 1) Peinture chromosomique  un chromosome ou un bras chromosomique 2) Sondes spécifiques d’une région chromosomique - sondes locus spécifiques  régions impliquées dans un syndrome (plusieurs gènes) -> aneuvysion : chromosomes 13 et 21 - sondes centromériques (CEP) -> aneuvysion : chromosomes X,Y et 18 -> les centromères de tous les chromosomes - sondes télomériques (tel) -> télomère du bras court -> télomère du bras long

52. 2.1. Applications de la FISH aneuvysion à partir du liquide amniotique 1 Intérêts : - examen direct sur les noyaux des amniocytes : 24 heures - sensible : décompte faits sur 100 noyaux 2 Principe de l’aneuvysion* : hybridation sur les noyaux Diagnostic fiable et rapide des principales aneuploidies

53. 2.1. indication de la FISH aneuvysion à partir du liquide amniotique Indications - signes d’appel échographiques - nuque épaisse sur échographie du 1° trimestre 18

54. 2.2. application de la FISH : diagnostic d’un syndrome microdélétionnel Signe d’appel échographique : cardiopathie caryotype normal Recherche d’un syndrome de DiGeorge Présence d’une microdélétion en 22q11

55. 2.3. application de la FISH Identification d’un petit marqueur surnuméraire

56. 2.3. application de la FISH : Identification d’un petit marqueur surnuméraire par FISH centromérique

57. 4. application de la FISH Identification d’un petit chromosome 15 surnuméraire

58. 2.3. application de la FISH Identification d’un petit chromosome 15 surnuméraire FISH spécifique de la région Willy-Prader-Angelman

59. 2.3. application de la FISH : identification d’un isodicentrique du chromosome 15 CEP 15 CEP 15 SNRPN, D15S10 SNRPN, D15S10 47,XX,+idic(15;15)(q13;q13).ish15q11-q13 (SNRPN++,D15S10++)

60. 2.4. application de la FISH délétion

61. 2.4. application de la FISH délétion délétion du gène du rétinoblastome RB1

62. 2.4. application de la FISH délétion interstitielle une délétion interstitielle du chromosome 13

63. Techniques de biologie moléculaire dans le DPN 1 Analyse chromosomique =  la cytogénétique : Caryotype standard  la cytogénétique moléculaire : hybridation sur chromosomes par techniques de FISH  biologie moléculaire Analyse de régions chromosomiques  techniques de FISH   biologie moléculaire Analyse de l’ADN -> biologie moléculaire

64. Techniques de biologie moléculaire dans le DPN Anomalies multiples Visibles sur le caryotype invisibles sur le caryotype mais recherche ciblée invisibles sur le caryotype et inconnues : pêche à la ligne !!! Techniques multiples : Synthèse d’ADN : amplification d’un segment d’ADN (PCR), marquage Hybridation : amorces, sondes ADN …. Electrophorèse : migration sur gel, sur capillaire Début commun : une extraction d’ADN à partir d’un prélèvement Les prélèvements : fœtal : VC, LA, sang du cordon parentaux : sang sur tube EDTA

65. ( 1) Les techniques de base de la biologie moléculaire la PCR : amplification exponentielle Anomalie ciblée pour le choix des amorces

66. (1) Les techniques de base de la biologie moléculaire électrophorèse sur gel après PCR Séparation selon la taille visualisation des bandes avec le bromure d'éthidium sous UV but : séparer l’ADN chargé négativement au travers d'un gel sous l'effet d'un champ électrique

67. (1) Les techniques de base de la biologie moléculaire électrophorèse sur capillaire après PCR Le nombre de paires de bases (pb)

68. ( 2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / screening des exons PCR Multiplex Myopathie de Duchenne

69. (2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct /recherche d’une petite délétion Détection de la mutation deltaF508 du gène CFTR Hétérozygote pour deltaF508 Homozygote pour deltaF508 Homozygote normal au locus F508 (En bleu le marqueur de poids interne) PCR fluorescente Migration sur un séquenceur automatique

70. (2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / recherche d’une mutation ponctuelle Enzyme de restriction 1.Hétérozygote (noir) : site de restriction 2.Homozygote normal (noir) Amorce en bleue d’un témoin de digestion hétérozygote

71. ( 2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / séquençage : principe H OH H liaison diester H di dNTP incorporé dans l’ADN -> arrêt de la PCR

72. (2) Les applications de base de la biologie moléculaire diagnostic direct / séquençage Amplification par PCR dans un seul sens Mélange de d NTP et de di dNTP fluorescents incorporation de di dNTP -> Arrêt de la synthèse d’ADN Fragments fluorescents de taille différente sur l’électrophorèse -> séquence du fragment amplifié

73. ( 2) Les applications de base de la biologie moléculaire diagnostic direct / séquençage Mutation de la CF Mise en évidence directe de la mutation Mutation unique Mutation localisées Mutation familiale déjà identifiée

74. un microsatellite : répétition de nucléotides court (de 1 à 4 nucléotides) CACACACACA Un marqueur : variation du nombre de répétition varie selon les individus. Un marqueur non ambigu : les séquences de part et d’autre du marqueur uniques (2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : principe

75. (2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : principe

76. (1) Les techniques de base de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : principe Migration selon la taille des microsatellites amplifiés Migration sur gel Migration dans un capillaire

77. (2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : application au diagnostic indirect 1) Détermination du microsatellite lié à la maladie 2) Avantage : gène non connu échec du diagnostic direct 2 ) Inconvénients : diagnostic probabiliste Cas index familial Parents informatifs Fille atteinte d’une MAR

78. (2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : diagnostic de disomie uniparentale Une paire de chromosomes homologues héritée d’un seul parent Invisible sur le caryotype

79. (2) application de la biologie moléculaire : amplification de microsatellites : diagnostic de disomie uniparentale Identification de l’origine des chromosomes : les microsatellites Disomie uniparentale individu 4 Individu 5

80. FCS due à la trisomie 14 correction de la trisomie 14 après fécondation DUP14 mat 45,XX,t(13;14) 23,Y méïose fécondation Disomie 14 45,XY,t(13;14) 45,XY,t(13;14) Trisomie 14

81. (2) application de la biologie moléculaire : amplification de microsatellites : anomalies du nombre de chromosomes PCR fluorescente multiplexe quantitative sur des microsatellites sur les chromosomes 21

82. ( 2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / sexe foetal ADN foetal circulant dans le sang maternel Indications : - les maladies récessive liées à l’X (MRX) - hyperplasie congénitale des surrénales (HCS) Intérêts : - non invasif - précoce En pratique : - MRX : pos à 10 SA ->VC - HCS : corticothérapie si nég à 8 SA-> contrôle à 10 SA Technique : PCR quantitative en temps réel du gène SRY

83. ( 2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / sexe foetal La quantité de fluorescence : proportionnelle à la quantité d’ADN amplifiée

84. ( 3) Les puces à ADN principe ADN cible et ADN de référence Marquage direct des ADN par deux fluorochromes différents(cyanines) cohybridation compétitive Sur une lame de verre ADN cible ADN de référence

85. ( 3) Les puces à ADN principe Lecture des signaux d’hybridation par un scanner de fluorescence Analyse des signaux par logiciel - gain d’ADN : spot rouge - perte d’ADN : spot vert

86. Anomalies de nombre du caryotype : marqueur surnuméraire : 47, XY,+mar Caryotype masculin un marqueur chromosomique en mosaique (11/16) sur les cellules étudiées

87. ( 3) Les puces à ADN identification d’un marqueur

88. Un isochromosome 18 p une quadrisomie d'un bras court de chromosome 18.

89. ( 3) Les puces à ADN intérêts - pangénomique -anomalie non connue - Invisible au caryotype

90. Techniques de biologie moléculaire dans le DPN 1 Analyse chromosomique par biologie moléculaire disomies uniparentale par PCR de microsatellites aneuploidies par PCR de microsatellites 2 Analyse de régions chromosomiques Puce à ADN 3 Analyse de gènes Détermination du sexe fœtal ou du Rhésus Diagnostic direct des mutations par PCR …. Diagnostic indirect par PCR sur microsatellites