Development of an engineered bioluminescent reporter phage for the sensitive detection of viable Salmonella typhimurium
Because foodborne illnesses continuously threaten public health, rapid
and sensitive detection of pathogens in food has become an important issue. As an
alternative to time-consuming and laborious conventional detection methods, a
technique using recombinant reporter phages has been developed. Here, we developed
an advanced bioluminescent reporter phage SPC32H-CDABE by inserting a bacterial
luxCDABE operon into the Salmonella temperate phage SPC32H genome. Whole
SPC32H genome sequencing enabled the selection of nonessential genes, which can
be replaced with approximately 6-kb luxCDABE operon, which provides both
luciferase (LuxAB) and its substrate, fatty aldehyde, as generated by fatty acid
reductase (LuxCDE). Thus, the SPC32H-CDABE detection assay is simpler and more
efficient compared to the luxAB-based assay because the substrate addition step is
excluded. At least 20 CFU/mL of pure S. Typhimurium culture was detectable using
SPC32H-CDABE within 2 h, and the signals increased proportionally to the number
of cells contaminated in lettuce, sliced pork, and milk. These results thereby demonstrate that this phage successfully detects live
Salmonella without appreciable interference from food components. Furthermore, the presented data suggest that SPC32HCDABE
represents a promising easy-to-use diagnostic tool for the detection of Salmonella contamination in food.
Seongmi Kim,# Minsik Kim,# and Sangryeol Ryu*
Department of Food and Animal Biotechnology, Department of Agricultural Biotechnology, Research Institute for Agriculture and
Life Sciences, and Center for Food and Bioconvergence, Seoul National University, Seoul 151-921, South Korea
pubmed link :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24806327
french traduction and power point presentation by Liliane M. Lebanese university - Section 1 - Hadath
Biology department
Prévalence des infections à Plasmodium : apport des nouvelles méthodes de détection du parasite - Présentation de la 8e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - ANDRIANARANJAKA Voahangy Hanitriniaina - Madagascar - fararanontsoa@gmail.com
Résistance de Plasmodium vivax à la chloroquine - Présentation de la 4e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Grah Worro Elisabeth BEUGRE - Médecin/Chercheur - Institut Pasteur de Côte d'Ivoire - beugregrah@yahoo.fr
Détection des allèles polymorphiques ou allèles antigènes variants par PCR - Présentation de la 2e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - OULD BRAHIM Hamoud, INSTITUT PASTEUR de DAKAR - Unité d’épidémiologie, BP :220, Dakar - SENEGAL - Etudiant en Thèse - hamoudey@yahoo.com
Projet génome de Plasmodium: Approches utilisées et résultats attendus - Présentation de la 6e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - KARENZO Jeanne et LABOUDI Majda
Entomologie moléculaire et étude de la structuration génétique des populations d'anophèles - Présentation de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Hadiza Soumaila AMADOU - Entomologiste - Ministère de la Santé / PNLP - Niamey, Niger - soumailahadiza@yahoo.fr
Entomologie moléculaire et étude de la structuration génétique des anophèles - Présentation de la 2e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - RANDRIANASOLO Laurence - INSTITUT PASTEUR de MADAGASCAR BP 1274 Antananarivo, Madagascar - laurandrianas@yahoo.fr
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TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE EN PARASITOLOGIE ET MYCOLOGIE
EXTRACTION D'AN
TECHNIQUE PCR
SEQUENCAGE D'AN
GENOTYPAGE
APPORT DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE EN PARASITOLOGIE ET MYCOLOGIE MEDICALE
La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitro - Présentation de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Hamma Ibrahim MAIGA - Chercheur - Université Faculté de Médecine,Malaria Research center - Bamako, Mali - hmaiga@MRTCBKO.org
Applications dans l'évaluation de l'impact des interventions dans lutte contre le paludisme - Présentation de la 6e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - IDRISSA Sabit et STEENKESTE Nicolas
Les opinions exprimées dans ces exposés sont celles des auteurs et ne représentent pas nécessairement les points de vue du gouvernement du Canada. Les exposés sont diffusés dans leur format original, tel que nous les avons reçus des présentateurs.
Les exposés présentés lors de la Conférence en vue d’élaborer un cadre fédéral relatif à la maladie de Lyme sont la propriété de l’auteur, à moins d’indication contraire. Si vous faites référence au travail de l’auteur, vous devez nommer l’auteur et le titre de son exposé, ainsi que le lieu et la date de l’exposé.
Pour obtenir de plus amples renseignements, veuillez communiquer avec le secrétariat de la Conférence sur la maladie de Lyme à l’adresse maladie_lyme_disease@phac-aspc.gc.ca
Médicaments antipaludiques quinoléiques et les marqueurs génétiques de résistance - Présentation de la 7e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Ravelojaona Alain Mamy - Madagascar - am.ravelojaona@yahoo.fr
Mécanismes de Résistance de Plasmodium aux Quinoléiques - Présentation de la 8e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - IYALOO Diana Pillay - Maurice - idiana222@yahoo.com
TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE EN PARASITOLOGIE ET MYCOLOGIE
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SEQUENCAGE D'AN
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Médicaments antipaludiques quinoléiques et les marqueurs génétiques de résistance - Présentation de la 7e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Ravelojaona Alain Mamy - Madagascar - am.ravelojaona@yahoo.fr
Mécanismes de Résistance de Plasmodium aux Quinoléiques - Présentation de la 8e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - IYALOO Diana Pillay - Maurice - idiana222@yahoo.com
Explication du fonctionnement d'un NIDS (Network Intrusion Detection System)
Un système de détection d’intrusion est un mécanisme destiné à repérer des activités anormales ou suspectes sur la cible analysée (un réseau ou un hôte). Il permet ainsi d’avoir une connaissance sur les tentatives réussies comme échouées des intrusions.
Eric JAMIN est le manager de l'Unité "Authenticité", chez Eurofins Analytics France. Il nous parle des nouvelles approches analytiques pour la détection des fraudes, et présente l'exemple du projet d'Eurofins "Agrifood GPS".
SENSIVIC : La détection automatique d'anormalités sonoresPascale Demartini
Les détecteurs de nouvelle génération SENSIVIC ont été conçus pour devenir les oreilles des caméras de vidéoprotection. Dotés d'un mécanisme d'auto-apprentissage original, ils s'adaptent automatiquement à l'ambiance sonore des lieux où ils sont installés, pour ne signaler que les événements sonores inhabituels.
Aufgrund der einzigartigen Kontext-Technologie ist MIOsoft in der Lage, Mobilanschlussanbieter bei SIM-Karten Mißbräuchen zeitnah mit der Bewertung und den darauf folgenden Aktionen zu unterstützen. So können sowohl Anbieter als auch Kunden vor hohen Kosten bewahrt werden unter Berücksichtigung der Nutzungsgewohnheiten des Anwenders. Es können beliebig viele Datenquellen real-time an die Plattform von MIOsoft angebunden und verarbeitet werden. Mit speziellen Regeln, die individuell konfiguriert werden können, ist es möglich, Aktionen festzulegen, falls es zu einer starken Abweichung des Nutzungsverhaltens kommt. Um auch noch im BIG DATA Bereich zeitnah agieren zu können, wendet MIOsoft seinen patentierten Context-Activity-Cycle an, der die Kontexte unter Beobachtung stellt, bei denen Auffälligkeiten automatisiert entdeckt wurden.
La 6ème édition du Meetup de la Voiture Connectée à Paris s'est tenue le 16 Février 2017, au Square Paris, le nouveau lab digital de Renault.
https://www.meetup.com/fr-FR/MeetupVoitureConnectee/
1) Liberty Rider : Première application de détection de chute en France, Liberty Rider a été conçue pour détecter les accidents à moto afin de prévenir les services de secours le plus rapidement et le plus efficacement possible.
2) Jamaica-Car par AICAS GmbH: un framework applicatif pour l'automobile connectée, ou comment implémenter un appstore sur un système d'info-divertissement automobile sans modifier le matériel existant.
3) De plus, Vincent Viollain de Viva Technology nous a présenté ses challenges de startups en lien avec les véhicules connectés et autonomes.
Les Meetups Voiture Connectée et Autonome vous sont proposés par Laurent Dunys, https://www.linkedin.com/in/laurentdunys, depuis 2016.
Rejoignez notre groupe en ligne: https://www.meetup.com/fr-FR/MeetupVoitureConnecteeAutonome
Le déficit en C1q , Si le système du complément NE s’active PAS, Si le système du complément s’active TROP,Le déficit en premieres fractions activatrices (qui précedent la molécule C3), La prise en charge des déficits en protéines activatrices du complément , L’exploration du système du complément au laboratoire , angio-œdème récurrent en l'absence de réactions allergiques, Cas clinique
La PCR est une technique qui a révolutionné la biologie moléculaire et qui a pris rapidement sa place dans les laboratoires. Son énorme succès apparait par le nombre d’articles publiés sur le site PubMed : 438134 articles depuis sa découverte (pubMed, mars 2018) ce qui donne une idée assez claire de l’importance de celle-ci dans le monde scientifique
the key molecular (complement components, antibodies) and cellular (neutrophils and plasma cells) components of the immune response necessary to prevent tissue invasion by the sub-gingival plaque bacteria. The destructive, chronic inflammation that manifests clinically as peridontontis is caused by an excessive and inappropriate immune response to pathogenic plaque bacteria, coupled with a failure of the normal processes that limit inflammation and drive tissue repair.
PCR : Polymerase chain reaction : classique et en temps réelNadia Terranti
la PCR comme outil en biologie moléculaire .
PCR : Déroulement, optimisation, limites , inconvénients et variantes.
PCR en temps réel et chimies de détéction
PCR quantitative
Temporal Temperature Gradient Gel électrophorèses (TTGE) Ali Elkomy
On utilise Temporal Temperature Gradient Gel électrophorèses (TTGE) pour identifier les différentes espèces de bactéries présentes dans de nombreux produits laitiers, y compris les membres des genres Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, Streptococcus et Staphylococcus.
Similaire à phage for detection of viable Salmonella typhimurium (20)
Temporal Temperature Gradient Gel électrophorèses (TTGE)
phage for detection of viable Salmonella typhimurium
1.
2. Introduction
Avec l’augmentation de la pollution
environnementale le risque de contaminations
alimentaires préoccupe de plus en plus la
communauté vue les maladies sévères qu’elle
pourrait engendrer.
D’où l’importance de développer des méthodes
pour une détection rapide de toute sorte de
contamination.
3. À savoir:
I. Salmonella enterica serovar Typhimurium :
Bactérie gram (-)
responsable des symptômes qui vont de la diarrhée légère à la gastro-entérite
aiguë chez l’homme et cause la fièvre typhoïde chez les animaux.
93.8 millions des cas de gastro-entérite dans le monde sont causées par une
infection de Salmonella avec 155,000 mort chaque année dont 80.3 millions sont
victime d’aliments contaminé par la bactérie en question.
5. Méthode basée sur l’utilisation d’un
bactériophage rapporteur :
Principe : insertion d’un gène rapporteur dans le génome du bactériophage
spécifique à la bactérie qu’on veut détecté.
Avantages :
1. Spécifique à la bactérie cible
2. Capacité de distinguer entre bactérie vivante et morte
3. Production de masse facile
4. Moins couteux
5. Longue durée de vie
6. Détection rapide
7. Enzyme qui ce trouve dans les cellules des
organismes bioluminescents et qui catalyse
l’oxydation de la luciférine ( FMNH2 + Aldéhyde
aliphatique) en oxyluciférine avec émission de
photons .
Capacité de clonage
limitée => on
élimine les gènes
non essentiels et on
les remplaces avec
l’opéron bactérien
Opéron bactérien de 6 Kb
Substrat de
luciférase
8. Les gènes Lux
Gènes responsables des réactions qui entrainent l’émission de lumière
Ils sont utilisé dans la construction de bio rapporteurs
Émettent une lumière bleu-vert a 490 nm
Il existe 5 gènes lux : A, B, C, D et E
Les différentes combinaisons entre ces gènes génère différents bio rapporteurs.
LuxAB
• Luciférase
• Addition de
substrats
exogènes
• Erreurs
LuxCDE
• Complexe
d’acide gras
réductases.
• Substrat de
luciférase
LuxCDABE
• Pas besoin
de substrats
exogènes
• Facile
• rapide
9.
10. Milieux et conditions de cultures :
37 ̊C – Aérobie
Milieu LB ( bouillon – agar 1.5 % )
Ampicilline (Ap) : 50 μg/ml
Kanamycine (Km) : 50 μg/ml
Chloramphénicol (Cm) : 25 μg/ml
L(+)- arabinose 100 Mm
Mitomycine C ( MMC ) : 1.0 μg/ml
Saccharose (20 %)
N-décanal (1 % ) = n- décylaldéhyde
(substrat exogène pour LuxAB)
11. Souche bactérienne, bactériophage et
plasmides :
Souche : SR5100 ΔLT2gtrABC1 (32H); SR5003 lysogenized by SPC32H
( LT2 souche sauvage de salmonella hôte pour le phage SPC32H )
E. coli S17-1 λpir
SPC32H : phage qui infecte Salmonella Typhimurium
Plasmides :
Red Helper pKD46
pKD13
pCP20
pCE70
PBBR lux
plasmide suicidaire PDS132
12.
13. 1 – One-step inactivation method of
chromosomal gene
Méthode de Datsenko et wanner.
Principe :
Remplacer par recombinaison homologue, une
séquence chromosomique par un gène de résistance
à l’aide d’amorces portant des extensions
homologues au gènes cibles.
14.
15.
16. 2- Induction :
Pousser la bactérie lysogène à libérer une grande
quantité de phages ( + que la quantité qu’elle
libère normalement )
La portion de bactéries qui subissent un cycle
lytique devient considérable.
Agent inducteur : Mitomycine C.
17. 3- Luminométrie:
Appareil :
Luminomètre
Fonction :
Mesurer une intensité lumineuse
( bioluminescence et ATP métrie )
Il comprend :
1. Un Détecteur de lumière qui compte les photons
2. Un Système électronique converti et affiche la mesure
de photons en RLU ( relative luminescence units )
3. Un tube photomultiplicateur
4. Une chambre de mesure
5. Un injecteur de réactifs.
21. Choix et délétion des gènes non essentiels :
Les gènes impliquées dans la conversion lysogénique :
• Antigène-O Acétylase ( oac )
• Glucose translocase ( gtrA)
Le gène (Int) séquence codante pour l’intégrase .
( on a gardé une partie du cote 5’ terminal importante pour l’excision )
Le site situé directement après l’opéron CPS.
Conversion lysogénique :
le gène du phage s’intègre dans les chromosomes
de la bactérie et la mettent en état latent (
lytique lysogénique ) et la rendant plus
virulente ex. : modification de l’antigène O de
salmonella qui est reconnu par le Sys. immunitaire
Rôle dans l’ intégration du génome du
phage dans le chromosomes de l’ hôte
et son excision
Elimination par la méthode one-step en utilisant :
• le plasmide pKD13 portant le gène de résistance a la kanamycine
• le plasmide pCP20 portant le gène de FLP recombinase
( mais pas pour le site situé après l’opéron CPS )
22. Insertion du gène Lux :
I- Choix du site cible :
• Directement après le Promoteur de CPS
Pourquoi ?
• Région transcrite de manière efficace
Preuve ?
• On a inséré dans cette région le gène lacz sans promoteur apporté par le
plasmide pCE70 et sous traitement par MMC on a induit un cycle lytique.
Après test de la β-Galactosidase on a prouvé que ce promoteur (Pcps) est
largement transcrit par suite cette région serait la plus convenable.
23. Insertion du gène Lux :
II- Préparation à l’insertion:
a. Le plasmide pBBRlux porte les gènes Lux ( AB ou CDABE)
b. Amplification du gène par PCR ( fragment de pBRlux avec le gène dans son centre)
c. Clonage du fragment amplifié dans le plasmide suicidaire pDS132
d. Lysogénisation d’ E. coli S17-1 λpir par le phage SPC32 H
( contenant le gène de résistance a la kanamycine au niveau du site cible ( one-step method) )
e. Transformation D’Ecoli par pDS–luxAB ou pDS-LuxCDABE
f. Conjugaison entre E. Coli transformée et lysogénisée .
24. Insertion du gène Lux :
III- Intégration au site cible
SPC32H KmR
pDS-Lux
Première recombinaison
homologue
Par compétition du
saccharose
(présent à 20%)
Deuxième recombinaison
homologue
SPC32H:Lux
Insertion validée par séquençage
KmR et CmS
KmR et CmR
KmS et CmS
Gène sacB :
Gène de la Bacillus Subtilis
confère une sensibilité au
saccharose au bac gram(-)
C’est le gène suicidaire de
pDS132
25.
26. 1- Contrôle de l’affinité du phage rapporteur
But :
Savoir si la modification génétique de SPC32H a altérée son affinité et son
habilité de lyser la bactérie Salmonella Typhimurium.
Méthode :
Test de concurrence bactériennes mesurée par D.O.
Échantillons testés :
- Solution de phages : SPC32H-ABi + culture Salmonella
- Solution de phages : SPC32H-AB + culture Salmonella
- Solution de phages : SPC32H-CDABE + culture Salmonella
- Solution de phages : SPC32H + culture Salmonella
- Solution de contrôle négatif : Tampon SM + culture Salmonella
Tampon utilisé pour
dilution et stockage de
bactériophages
Souche
sauvage du
phage non
modifié
27. Résultats :
Cycle Lysogénique
présence de (Int )
L’ introduction du
gène lux AB n’a pas
altérée le pouvoir
infectieux de la
souche sauvage
SPC32H tolère
l’insertion de
fragment de 2kb
Début de la lyse
de par SPC32H-AB
Début de la
lyse par
SPC32H-CDABE
Cette Intervalle peut être due à :
1- Complication dans
l’assemblement du phage due à la
surexpression du gène luxCDABE à
partir du promoteur CPS.
2- Problèmes d’encapsidation du
phage causés par l’augmentation
de la taille du génome du phage
de 3kb > souche sauvage.
Après 3 h d’action le
taux de Salmonella
inhibée est devenu à
peut-près égale pour
les deux phages.
28. 2- Validation de la production de bioluminescence par
le phage génétiquement modifié
But :
Mettre en évidence la production de bioluminescence par les cellules infectées
par le phage modifié contenant les gènes lux .
Méthode :
Mesure luminométrique
29. Résultats :
SPC32H-ABi-2 et
SPC32H-ABi-1 procurent
le même niveau de
bioluminescence
l’absence d’ intégrase
n’aboutit pas directement
une activité lytique
Pourquoi SPC32H-ABi-2
n’entre pas en cycle
lytique (T=100)
comme SPC32H-AB ??
30. 3- Contrôle de détection spécifique de
Salmonella vivante
Test de l’affinité
But :
Mesurer la quantité de salmonella d’ après l’ intensité de l’ émission lumineuse
Procédure :
- Dilution en série de cultures de salmonella 10X
- Infection par SPC32H-CDABE ( 10^8 PFU/mL )
- Mesure de la bioluminescence émise pour 2 h d’infection
( pour capter le maximum de signal lumineux même pour les plus petites concentration de salmonella )
Test de spécificité
Dans les aliments et dans l’environnement Salmonella se trouve avec beaucoup d’autre
bactéries pour cela la méthode de détection utilisée ne doit pas être influencé par la
présence d’autres bactéries
On a mélangé la souche MG1655 d’ E. Coli avec le phage SPC32H-CDABE et on a mesuré la
bioluminescence.
On a mélangé la souche MG1655 avec Salmonella et le phage et on a mesuré la
bioluminescence
31. Résultats :
on a put
détecter 20
CFU/ml de
salmonella
Il y a corrélation entre la
valeur RLU et le nombre de
bactéries énuméré par
comptage directe
Test de l’affinitéTest de spécificité
Aucune émission
de
bioluminescence
Niveau de
bioluminescence
égal a celui qui est
émis en présence de
salmonella seul
32. 3- Contrôle de détection spécifique de
Salmonella vivante
Test de l’ habilitée de SPC32H-CDABE de détecter SEULMENT les Salmonella vivante:
Capacité de distinguer entre bactérie vivante et morte est une des objectifs de l’utilisation de la Méthode basée
sur l’utilisation d’un bactériophage rapporteur.
Procédure:
• Culture de Salmonella de 10^5 UFC/ml
• La moitié de cette quantité est traitée 30 min avec de l’ éthanol 70% (v/v)
• Récupération des bactéries et resuspension dans un bouillon LB
• Mélange des cellules morte avec les cellule vivante ensemble dans des ratios
différents ( 100 %, 10%, 1%, 0.1% et 0% de cellules vivante ).
• Infection de chaque Mélange avec SPC32H-CDABE ( 10^8 PFU/ml)
• Mesures luminométrique.
35. 1- Contaminations artificielles des
échantillons alimentaires
A- préparation de l’inoculum pour la contamination artificielle
i. culture de Salmonella dans 3 ml de bouillon LB à 37 ̊C pour obtenir une
valeur de D.O600 = 0.5 ~ 4 x 10^7 CFU/ml
ii. Dilutions en séries 10 X ( de 10 a 1 x10 ^6 CFU/ml ) dans bouillon LB
iii. Quantification de la concentration par étalement sur gélose LB ou XLD
B- Contamination des échantillons
Laitue
Iceberg
•3 échantillons de 10 g
•Quantification sur XLD
•1 ml de salmonella dans chaque
échantillon
•Séchage 2 h à température Ambiante
•Homogénéisation dans un Blender dans
90 ml de bouillon LB
•Dilutions en séries.
•Culture de 0.1 ml des échantillons sur
XLD pour mesurer la quantité de
Salmonella
•5 ml de chaque échantillon dans tube
stériles pour mesure luminométrique
Tranche de
porc
•3 échantillons de 10 g
•Trempés dans l’inoculum pour 30 min
•Homogénéisation
•Culture de 0.1 ml sur XLS
•5 ml de chacun sont transférés dans tube
de test stériles pour mesure
luminométrique
Lait
pasteurisé
•3 échantillons de 10 ml
•+ 1 ml de culture dans chacun.
•Stockage 2 h à 4 ̊C
•Homogénéisation
•Culture sur XLD
•Mesure luminométrique
Consommée
frais et sans
cuisson
Un des inconvénients des autres
phages portant les gènes lux
c’est l’inhibition du signal
lumineux dans les échantillons
turbide (trouble - laiteux) on
veut tester la capacité de notre
Phage rapporteur
36. L’ intensité du signal
est moins important
que celui des autres
échantillons mais
continue a démontré
une allure dose-
dépendante et
linéaire en
corrélation avec le
nombre de bactérie
Résultats