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La microscopie
P. falciparum P. vivax
P. ovale P. malariae
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GénotypagedePlasmodiumsp
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PCR d’identification d’espèce
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m F V M O
#14
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P. falciparum (F, 205 bp),
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FALCIPARUM
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MALARIAE
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reaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med
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Références
Site Internet :
• Wikipedia [accédé le 24/03/08] ; article sur la Réaction en chaîne par
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Article :
• Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain
reaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop
Med Hyg 90, 519-21 (1996).
• Incardona S et al. Large-scale malaria survey in Cambodia: Novel insights on
species distribution and risk factors. Malaria Journal 2007, 6:37 (27 March
2007).
• Andreas Crameri et al. A rapid microarray-based method for monitoring of all
currently known single nucleotide polymorphisms associated with parasite
resistance to antimalaria drugs. J. Clin. Microbiol. 10.1128/JCM.01178-07.
• Smythe JA et al. Structural diversity in the Plasmodium falciparum merozoite
surface antigen 2. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Mar 1;88(5):1751-5.
• Snewin VA et al. Polymorphism of the alleles of the merozoite surface antigens
MSA1 and MSA2 in Plasmodium falciparum wild isolates from Colombia. Mol
Biochem Parasitol. 1991 Dec;49(2):265-75.
• Felger I et al, Genotypes of merozoite surface protein 2 of Plasmodium
falciparum in Tanzania.Trans R Soc Trop Med Hyg. 1999 Feb;93 Suppl 1:3-9.
• Frédéric Ariey et al. Invasion of Africa by a single pfcrt allele of South East
Asian type. Malaria Journal 2006, 5:34.
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Applications dans l'évaluation de l'impact des interventions dans lutte contre le paludisme

  • 1. Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar Génotypage de Plasmodium sp : Applications dans l’évaluation de l’impact des interventions dans la lutte contre le paludisme Sabiti IDRISSA et Nicolas STEENKESTE EVALUATION par les FACILITATEURS
  • 2. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/082 Plan • Les Techniques de Biologie Moléculaire : • Le Diagnostic d’Espèce • La Résistance aux Antipaludiques • Le Polymorphisme • Analyse Dynamique
  • 3. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/083 L’ADN En 1953, J. Watson et F. Crick découvre la structure de l’ADN : Acide DésoxyriboNucléique Localisation de l’ADN : Eucaryote : Chromosome mitochondrie …
  • 4. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/084 PCR : Polymerase Chain Reaction Mise au point en 1985 par Karry Mullis. But : Amplifier une partie spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter.
  • 5. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/085 Polymerase Chain Reaction D’après Wikipedia [accédé le 24/03/08] ; article Réaction en chaîne par polymérase Augmentation exponentielle du nombre de copie 94° 72° Extraction de l’ADN
  • 6. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/086 Post PCR • Gel d’agarose ( positif / négatif ) • Séquençage Grâce à la méthode de Sanger, on peut avoir la séquence d’un produit PCR. • RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Utilisation des enzymes de restriction (ex: AluI = 5'-A G^C T-3' ) pour mettre en évidence un polymorphisme. • Puce à ADN Permet de mettre en évidence notamment des mutations ponctuelles.
  • 7. Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar Le Diagnostic d’espèce Plasmodiale
  • 8. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/088 La microscopie P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae Photographie prise par le laboratoire d’Epidemiologie Moleculaire de l’IPC sensibilité = ~10-50 parasites/ul ADVANTAGES : • Faible coût, • Adapté au terrain, • Donne des informations sur la parasitémie. INCONVENIENTS : • Besoin d’une formation spécifique et d’une grande expérience, • Identification entre les espèces difficiles, • Pas adapté à une analyse d’un grand nombre d’échantillon
  • 9. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/089 PCR d’identification d’espèce PRINCIPE : EXEMPLE : m F V M O #14 205bp 787bp 144bp #14 = infection avec P. falciparum (F, 205 bp), P. vivax (V, 117 bp), P. ovale (O, 787 bp). VARIABLE AREA FALCIPARUM VIVAX MALARIAE OVALE PCR primaire 4 nested PCR PLASMODIUM SSU rRNA gene CONSERVED AREACONSERVED AREA 117bp Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain reaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med Hyg 90, 519-21 (1996). Incardona, S. et al. Large-scale malaria survey in Cambodia: Novel insights on species distribution and risk factors. Malaria Journal 2007, 6:37 (27 March 2007).
  • 10. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/0810 La sensibilité de la PCR Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain reaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med Hyg 90, 519-21 (1996). • 8 échantillons qui étaient négatifs en microscopie sont détectés positifs par PCR. • Inversement, 3 échantillons n’ont pas été détectés par la PCR. • 1 échantillon est passé d’un diagnostic Pf à Pf+Pv. • 90 échantillons sur les 120 analysés sont négatifs en PCR et microscopie.
  • 11. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/0811 Avantages de la PCR • Très grande sensibilité; Mise en évidence : des asymptomatiques ( faible parasitémie ) des infections mixtes • Impact pour la lutte : Avoir une idée plus juste de la prévalence Connaître les espèces (infection mixte comprise) Par exemple : Alerte pour la mise en place d’un traitement spécifique à P. vivax Traiter un grand nombre d’échantillon
  • 12. Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar LA RESISTANCE : L'analyse des mutations ponctuelles (SNP) liées à la résistance chez Plasmodium falciparum
  • 13. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/0813 La Résistance 6 gènes d’intérêts ont été associés aux résistances : – Pfdhfr à la Pyriméthamine, cycloguanil – Pfdhps aux sulfadoxines – Pfcrt à la chloroquine – Pfmdr1 à la chloroquine (par nombre de copie : méfloquine) – Pfcytb à l’Atovaquone – Pfatpase6 candidat associé aux résistances aux dérivés de l’artémisinine Au total, 34 SNP liés à la Résistance Andreas Crameri et al. A rapid microarray-based method for monitoring of all currently known single nucleotide polymorphisms associated with parasite resistance to antimalaria drugs. J. Clin. Microbiol. 10.1128/JCM.01178-07
  • 14. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/0814 Analyse de la résistance par SNP • Etude In vitro, In vivo Les échantillons doivent être traités immédiatement Nécessité d’un fort investissement : • en temps • en personnel • Etude Moléculaire Recueil plus souple (lors d’une enquête de prévalence ou démographique…) Analyse extemporanément Analyse possible pour un grand nombre d’échantillon
  • 15. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/0815 La Résistance – Pfdhfr à la Pyriméthamine, cycloguanil – Pfdhps aux sulfadoxines – Pfcrt à la chloroquine – Pfmdr1 à la chloroquine (par nombre de copie : méfloquine) – Pfcytb à l’Atovaquone – Pfatpase6 candidat associé aux résistances aux dérivés de l’artémisinine – Et… Possibilité de faire du Monitoring de l’évolution de drogue suite à l’introduction. On a besoin d’une définition stricte de la résistance.
  • 16. Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar LE POLYMORPHISME : msp1, msp2, glurp Microsatellites
  • 17. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/0817 Polymorphisme des Antigènes Exemple de msp2 Gène de la « Merozoïte Surface Protein 2 » 2 familles alléliques : 3D7 = bloc 3 variable en taille (6 à 30 bp), en séquence et en nombre de copie FC27 = 2 séquences répétées : l’une d’1 à 4 copie d’un motif de 32-mer qui est suivi d’une région conservée d’un fragment de 7-mer ; l’autre de 0 à 5 copies d’un motif de 12-mer. Domaines avec variations de séquence et de longueur Bloc 1 Conservé Bloc 5 Conservé Répétition en tandem Smythe et al., 1990, 1991 ; Snewin et al., 1991 ; Felger et al., 1997 et 1999
  • 18. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/0818 Parasitémie Recrudescence ou ré-infection Après le 15eme jour temps Recrudescence ou Ré-infection A B
  • 19. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/0819 Recrudescence : msp1 msp2 glurp A B A B A B Ré-infection : msp1 msp2 glurp A B A B A B Recrudescence ou Ré-infection
  • 20. Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar Analyse Dynamique : Exemple de Pfcrt
  • 22. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/0822 Pfcrt dans le Monde P. falciparum Pfcrt Séquençage pour identifier les mutations ponctuelles Sauvage Mutant Un allèle de Pfcrt est arrivé en Afrique. Il faut suivre l’évolution des gènes de résistance pour éviter leurs propagations.
  • 23. GénotypagedePlasmodiumsp Le 28/03/0823 Références Site Internet : • Wikipedia [accédé le 24/03/08] ; article sur la Réaction en chaîne par polymérase Article : • Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain reaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med Hyg 90, 519-21 (1996). • Incardona S et al. Large-scale malaria survey in Cambodia: Novel insights on species distribution and risk factors. Malaria Journal 2007, 6:37 (27 March 2007). • Andreas Crameri et al. A rapid microarray-based method for monitoring of all currently known single nucleotide polymorphisms associated with parasite resistance to antimalaria drugs. J. Clin. Microbiol. 10.1128/JCM.01178-07. • Smythe JA et al. Structural diversity in the Plasmodium falciparum merozoite surface antigen 2. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Mar 1;88(5):1751-5. • Snewin VA et al. Polymorphism of the alleles of the merozoite surface antigens MSA1 and MSA2 in Plasmodium falciparum wild isolates from Colombia. Mol Biochem Parasitol. 1991 Dec;49(2):265-75. • Felger I et al, Genotypes of merozoite surface protein 2 of Plasmodium falciparum in Tanzania.Trans R Soc Trop Med Hyg. 1999 Feb;93 Suppl 1:3-9. • Frédéric Ariey et al. Invasion of Africa by a single pfcrt allele of South East Asian type. Malaria Journal 2006, 5:34.
  • 24. Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar Ministère de la Santé, du Planning Familial et de la Protection Sociale Madagascar Et si vous utilisiez la biologie moléculaire dans votre PNLP ? Merci de votre attention