Diagnostic biologique du paludisme

Diagnostic biologique du paludisme
par
Marie-Ange Rason, MD
7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”
25 Mars 2009 – Institut Pasteur de Madagascar

Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Cycle biologique de Plasmodium sp

• Diagnostic microscopique (frottis mince et goutte épaisse)
• Bandelette réactive
• Biologie moléculaire (en milieu de recherche principalement)
• Quantitative Buffy Coat malaria-test ou QBC test
Principaux moyens de diagnostic
biologique du paludisme

Diagnostic Biologique du
Paludisme par Microscopie

Diagnostic microscopique : technique de
référence
• frottis mince et goutte épaisse
• diagnostic d’urgence
• objectivant un parasite (forme asexuée / forme sexuée)
– identifier l’espèce plasmodiale
– évaluer la parasitémie

Diagnostic Biologique du paludisme
Les étapes
1- Prélèvement du malade
2- Préparation et coloration des frottis sanguins
3- Examen microscopique des frottis sanguins à la recherche
des plasmodies
– négatif : confirmation
– Positif : suivre l’étapes suivantes
4- Identification d’espèces de Plasmodium
5- Estimation de la densité parasitaire

Confection de la goutte épaisse
Piqûre au bout du doigt (avec une lancette stérile, à usage unique)
Confection d’une goutte épaisse

Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter Confection de l’étalement sanguin :
frottis mince
Piqûre au bout du doigt (avec une lancette stérile, à usage unique)
Confection d’un frottis mince
OUI
NON
1
2
3

Méthodes de coloration
 Coloration de May Grunwald-Giemsa
 Coloration de Giemsa
 Coloration rapide ou panoptique
(kit commercial type Kit Ral® ou Dade®)

Plasmodium sp infectant l’homme
P. falciparum
P. malariae P. ovale
P. vivax

Plasmodium knowlesi
(www.cdc.gov/eid) False-colour electron micrograph of a rhesus red blood
cell infected with a mature segmented schizont-stage P.
knowlesi malaria parasite, which is about to release its
invasive merozoite stages.
A thin blood smear stained with Giesma from a
fatal human case of P. knowlesi malaria

Identification des espèces plasmodiales
sur un frottis mince
 Aspect de l’hématie parasitée
(taille de l’hématie parasitée)
 Aspect du parasite
(noyau et cytoplasme)
 Aspect du cytoplasme de l’hématie parasitée
(tâches, granulations)

Identification des espèces plasmodiales
sur un frottis mince

Examen de
frottis mince
Examen de
goutte épaisse
Plasmodium falciparum

Plasmodium vivax
Examen de
frottis mince
Examen de
goutte épaisse

Plasmodium ovale
Examen de
frottis mince
Examen de
goutte épaisse

Plasmodium malariae
Examen de
frottis mince
Examen de
goutte épaisse

Calcul de la densité parasitaire
Sur la goutte épaisse
 8000 globules blancs (leucocytes) par µl de sang
 Compter les parasites (forme asexuée) pour 500 leucocytes
Nb parasites relevés X 8000
Nb de leucocytes comptés
Nb parasites/µl de sang =

Calcul de la densité parasitaire
Sur le frottis mince:
 Compter le nombre d’hématies parasitées dans 100 champs
de bonne qualité sans chevauchement des hématies, sans
espace libre entre les hématies, au niveau de la queue du
frottis
 Estimer le % d’hématies parasitées
 Ramener la densité par µl de sang si nécessaire (Supposer
avoir 5 000 000 d’hématies par µl de sang)

Autres méthodes de diagnostic
Biologique du Paludisme

Détection des antigènes de plasmodies par immuno-
chromatographique
 migration d’un prélèvement de sang sur une membrane
 Antigènes capturés par des anticorps monoclonaux fixés
sur la membrane
 révélation par de nouveaux anticorps monoclonaux
couplés à un particule colorée révélatrice.
Bandelette réactive

Test de Diagnostic Rapide: illustration
(http://www.diamedchina.com)

Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Amplification d’un segment de l’ADN par la réaction
enzymatique répétée (PCR endpoint ou PCR en temps réel)
Avec besoin en :
• Équipement (thermocycleur …)
• Personnel formé
• …

Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR Classique
- Préparation du mix
- Amplification du mix
- Migration sur gel agarose
- Prise en photos du gel
- Interprétation des résultats
suivant la taille des bandes
attendues
PCR en temps réel
(RT-PCR)
- Sonde fluorescente
- Quantification et caractérisation
de l’amplicon formé à chaque
cycle
- Préparation du mix
- Amplification
- Interprétation des résultats
suivant la température de fusion
(http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm)
Mangold K. et all,2005. Real time PCR for Detection and Identification of
Plasmodium spp. J. Clin. Microbiol, 5: 2435-2440.

Illustration : résultat de diagnostic
d’espèce par PCR classique
M 1 2 3 4 5
100pb
200pb
Légendes: M: marqueur moléculaire, 1: témoin négatif ; 2 et 4: P. falciparum
(176 pb); 3 et 5: P. vivax (120 pb); 5: P. malariae (145 pb); pour P.ovale(780
pb) non figuré.

Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter Illustration d’un diagnostic d’espèce par
RT-PCR
Courbed’amplification Températuredefusion(°C) Contrôlespositifs
Présente 74,8+/-0,1 P.falciparum
Présente 73,2+/-0,2 Pmalariae
Présente 76,5+/-0,1 P.ovale
Présente 77,7+/-0,2 P.vivax

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