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atelier.paludisme@pasteur.mg                                              http://www.pasteur.mg/Atelier-Palu/




      LE DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
                           DU PALUDISME PAR
                                   MICROSCOPIE


                                6ème édition de l’Atelier Paludisme



                                            Session 2008
                                        17 Mars au 18 Avril 2008




                               Dr Marie Ange Rason - Dr Didier Ménard
                                    Unité de Recherche sur le Paludisme
                                      Institut Pasteur de Madagascar
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
                      DU PALUDISME

                     Il comprend plusieurs étapes


                                - ETAPE 1-
                        Prélèvement du malade


                                - ETAPE 2-
  Préparation et coloration de la goutte épaisse et du frottis mince


                                - ETAPE 3-
    Examen de la goutte épaisse à la recherche des parasites du
                                paludisme
  Si la recherche est négative : Conclure par « Examen négatif, Absence de
                               Plasmodium »
               Si la recherche est positive, passer à l’étape 4


                                - ETAPE 4-
  Identification des espèces de Plasmodium sur la goutte épaisse
                            et le frottis mince


                                - ETAPE 5-
Estimation de la densité parasitaire sur la goutte épaisse (si il y a peu
de parasites) ou sur le frottis mince (si il y a beaucoup de parasites)




                                      2
ETAPE 1
                       Prélèvement du malade

                                  Matériel nécessaire


       Lames de verre propres
       Lancette stérile
       Méthanol ou Ethanol
       Coton hydrophile
       Crayon gras ou stylo graveur


                                       Méthode


   Chez les enfants et adultes, la
    piqûre se fait au niveau du 3ème
    ou 4ème doigt de la main gauche,
    sur le côté qui est moins sensible
    que le bout du doigt


   Chez les nourrissons de moins de
    6 mois, la piqûre se fait au niveau
    du talon ou du gros orteil.




   Nettoyer l'endroit choisi d'abord
    avec un tampon de coton imbibé
    d'alcool, puis avec un tampon sec
    pour enlever toute trace d'alcool.




                                           3
   Piquer d'un coup sec et rapide.




   Essuyer la première goutte de
    sang avec un tampon de coton
    sec




   De la main droite : prendre une
    lame
    en la tenant par les bords.
    De la main gauche : presser le
    doigt piqué pour faire sortir une
    goutte de sang.


   Prendre    une    2ème    lame    et
    recueillir une seconde goutte de
    sang en la mettant délicatement
    en contact avec une extrémité de
    la lame




                                           4
ETAPE 2
Préparation et coloration de la goutte épaisse et
                             du frottis mince

                    Préparation de la goutte épaisse
   Faire un étalement épais, au centre de la lame.
   Étaler le sang avec le coin d'une lame propre jusqu'à épaississement uniforme.
   Les étalements trop minces ou trop épais ne se colorent pas bien.




   Au bout de la lame, inscrire au crayon gras le numéro du malade.
   Laisser sécher à l'air pendant au moins 10 minutes, par exemple sur un plan
    de travail ensoleillé, à condition de protéger l'étalement contre les mouches et
    la poussière.




                                          5
Préparation du frottis mince

   Tenir la lame d'une main. De l'autre, poser le bord de la lame rodée juste en
    avant de la goutte de sang.




   Faire glisser la lame rodée jusqu'à ce qu'elle touche la goutte de sang.




   Laisser le sang se répartir tout le long du bord de la lame rodée.




                                          6
   Pousser la lame rodée jusqu'au bout de la lame d'étalement, d'un mouvement
    doux et régulier (tout le sang doit être réparti avant que l'on atteigne le bout de
    la lame.




   Vérifier que l'étalement est bien fait (voir dessin A) :
    -   il ne doit pas présenter de lignes transversales ou horizontales
    -   il doit être lisse aux extrémités, et non irrégulier ou strié, comme sur le
        dessin B
    -   il ne doit pas être trop long ni trop épais
    -   il doit être étalé uniformément




   Un séchage correct est capital pour          conserver la qualité de l'étalement,
    surtout dans les pays à climat humide. Sécher en agitant rapidement à 5 cm
    environ d'une lampe à alcool allumée ; sur le côté de la lampe, un peu au-
    dessus de la flamme (mais jamais directement au-dessus).




                                            7
   Inscrire sur la lame le nom et le numéro du malade. Écrire au crayon gras sur
    la partie épaisse de l'étalement, qui n'est pas utilisée pour l'examen.




                                           8
Coloration de la goutte épaisse

                              Matériel nécessaire


     Éprouvette de 50 ml
     Pipette en verre de 5 ml
     Poire en caoutchouc
     Bac à coloration
     Agitateur
     Pinces à lame
     Râtelier à lames
     Minuterie
     Colorant de Giemsa
     Eau du robinet ou de pluie




                         Préparation du Giemsa à 10 %


     Remplir le bac à coloration avec 45 ml d’eau du robinet ou de pluie
     Ajouter 5 ml de colorant de Giemsa à l’aide d’une pipette plastique
     Mélanger à l’aide d’un agitateur
NB : La solution de Giemsa à 10 % ne se conserve que 2 jours



                             Coloration des lames
     Plonger les lames à colorer dans la cuve à coloration contenant la solution
      de Giemsa à 10 %
     Laisser colorer pendant 10 minutes
     Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet
     Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale




                                          9
Coloration du frottis mince

                              Matériel nécessaire


   Coloration rapide Kit RAL 555 (3 x 100 ml)
   Recharge fixateurs RAL 555
   Recharge Eosine RAL 555
   Recharge Bleu RAL 555




                             Coloration des lames


   Plonger 30 secondes la lame dans le fixateur (flacon 1)
   Plonger 30 secondes la lame dans l’éosine (flacon 2)
   Rincer la lame à l’eau du robinet
   Plonger la lame 2 minutes dans le bleu (flacon 3)
   Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet
   Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale




                                         10
ETAPE 3
 Examen de la goutte épaisse à la recherche des
                       parasites du paludisme

L'examen d'une goutte épaisse est basé sur l'observation microscopique de 100
champs de bonne qualité. C'est-à-dire que l'on ne peut pas déclarer le
prélèvement négatif avant d'avoir examiné 100 champs sans parasite.




                 Technique d'examen des gouttes épaisses


1.   Mettre de l'huile à immersion sur la goutte épaisse.
2.   Amener l'objectif à immersion 100 x au-dessus de la zone sélectionnée de la
     goutte épaisse.
3.   Abaisser l'objectif jusqu'à ce qu'il entre en contact avec l'huile.
4.   S'assurer que la zone choisie a bien la qualité requise et examiner la lame
     sur 100 champs avec l'objectif à immersion. Ne déplacer la lame que d'un
     champ à la fois, en suivant le schéma ci-dessus. Corriger la mise au point
     fine avec la vis micrométrique.
5.   Pour vous aider, utilisez un compteur manuel pour compter le nombre de
     champs examinés.




                                          11
A l'examen, vous devez observer :


   La     goutte   épaisse   est   formée    d'un   grand      nombre   d'hématies
    déshémoglobinisées rassemblées en paquets.


   Lors de la coloration de la goutte épaisse, l'eau de la solution de Giemsa agit
    sur les globules rouges non fixés : le contenu des cellules se dissout alors
    dans l'eau.


   Les leucocytes et les plaquettes présentent un aspect très semblable à ce que
    l'on observe dans un frottis. Comme ils n'ont pas été étalés par le frottis, les
    globules blancs paraissent plus petits, avec un cytoplasme plus compact
    autour du noyau.




                                                     Hématies
         N : Neutrophile
         E : Éosinophile
         L : Lymphocyte
         P : Plaquettes



Dans les gouttes épaisses, les parasites, comme les globules blancs,
apparaissent plus petits que dans les frottis. Il vous faudra sans doute regarder
avec beaucoup d'attention avant de les apercevoir. Vous devrez refaire la mise au



                                         12
point fine avec la vis micrométrique chaque fois que vous changez de champ.
Vous observerez ainsi la goutte épaisse dans différents plans horizontaux.


Les fins anneaux de cytoplasme apparaissent parfois interrompus ou incomplets.
C'est l'aspect normal des trophozoïtes dans les gouttes épaisses.
De même l'absence d'hématie peut également rendre difficile l'observation des
granulations de Schüffner ; en fait, dans les parties les plus épaisses de la goutte
il est parfois impossible de les voir. On peut cependant souvent        observer le
«fantôme» des globules rouges entourant les parasites dans les parties les plus
fines, en général au bord de la goutte épaisse, ce qui aide à poser le diagnostic.


Remarque : Il est impossible d'observer les taches de Maurer avec P. falciparum
dans une goutte épaisse.




                                        13
Les espèces plasmodiales dans les gouttes épaisses

             Plasmodium falciparum
       Trophozoïtes jeunes, en croissance, et/ou gamétocytes matures
                           généralement visibles




      Trophozoïtes                                     Schizontes




                                Gamétocytes



                     Plasmodium vivax
  Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner dans les
fantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la goutte épaisse




          Trophozoïtes                                    Schizontes




                                Gamétocytes




                                      14
Plasmodium ovale
  Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner nettement
visibles dans les fantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la
                               goutte épaisse




            Trophozoïtes                                        Schizontes




                                  Gamétocytes




                 Plasmodium malariae
                           Tous les stades sont visibles




           Trophozoïtes                                     Schizontes




                                 Gamétocytes




                                        15
ETAPE 4
Identification des espèces de Plasmodium sur la
               goutte épaisse et le frottis mince

    En cas de résultat positif, il est nécessaire d’examiner le frottis mince pour
                      déterminer le ou les espèce(s) en cause.


                              Examen du frottis mince
Pour examiner un frottis, procéder de façon systématique et normalisée :
   Mettre la lame sur la platine.
   Placer l'objectif 100 x à immersion au-dessus du bord du frottis, à mi-distance
    de ses deux extrémités.
   Mettre une goutte d'huile à immersion à cet endroit.
   Abaisser l'objectif à immersion jusqu'à ce qu'il soit en contact avec l'huile.
   Examiner le frottis de la façon suivante pour déterminer le ou les espèce(s) en
    cause.




                   Identification des espèces plasmodiales




                                           16
Les parasites découverts dans le sang en sont à différents stades de
                                 développement




Les hématies parasitées peuvent rester identiques ou changer de couleur ou de
forme, ou encore contenir des granulations roses (granulations de Schüffner).




Attention : on peut trouver plusieurs espèces associées chez un même malade.




                                       17
Plasmodium falciparum
                             Trophozoïte jeune
                                 Stade fréquent
           Cytoplasme : petit anneau fin, bleu pâle, sans granulations
                   Chromatine : 1 ou 2 petits grains rouges




                             Trophozoïte adulte
                               Stade fréquent
   Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, ou aspect en virgule, ou en point
                               d'exclamation




                                  Schizonte
                                   Très rare
Pratiquement jamais trouvés dans les étalements de sang (sauf dans les cas très
                                      graves)
                             Mérozoites : 18 à 32
                         Pigment: brun foncé ou noir




                                       18
Gamétocyte
                              Stade assez fréquent
                       Forme : banane, croissant ou faux
                 Couleur : bleu (mâle) ou bleu soutenu (femelle)
                               Noyau : rose-rouge
Pigment : quelques grains bleu- noir situés au centre du cytoplasme, ou dispersés




                                   Hématie
                              De taille normale
 Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes.
 Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières.


                             Densité parasitaire
                              Souvent très élevée




                                       19
Plasmodium malariae
                             Trophozoïte jeune
                               Stade fréquent
Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, avec quelques grains de pigments noirs
                     Chromatine : 1 grosse tâche rouges




                             Trophozoïte adulte
                                 Stade fréquent
Cytoplasme : soit tâche compacte, arrondie, bleu foncé, avec de nombreux grains
                                          de
      pigment noirs, soit disposé en bande (étalements minces seulement).
                    Chromatine : tâche ronde ou bande rouge




                                      20
Schizonte
                            Stade assez fréquent
                              Mérozoites : 8 à 10
  Chacun est une grosse tâche rouge entourée d’un peu de cytoplasme pâle.
Ils peuvent avoir une disposition irrégulière (forme jeune) ou être disposés en
                               couronne (forme adulte




                                Gamétocyte
                            Stade assez fréquent
                       Forme : grand, ovale ou arrondi
               Couleur : bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle)
        Noyau : une tâche ronde de chromatine rouge contre un bord
               Pigment : gros grains noirs dans le cytoplasme




                                  Hématie
                        De taille et forme normales
Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes.
Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières.


                            Densité parasitaire
                                    Faible



                                      21
Plasmodium vivax
                             Trophozoïte jeune
                              Stade fréquent
          Cytoplasme : anneau bleu assez gros, à contour irrégulier
                  Chromatine : 1 grain rouge, assez gros




                            Trophozoïte adulte
                            Stade peu fréquent
Cytoplasme : large tâche bleue, irrégulière (quelque fois divisée en 2, 3 ou 4),
                 avec de petits grains de pigment brun-orange.
                       Chromatine : une tâche rouge




                                      22
Schizonte
                              Stade assez fréquent
Mérozoites : 12 à 18 gros grains rouges compacts, posés sur le cytoplasme bleu
                                        pâle




                                Gamétocyte
                               Stade fréquent
      Femelle : ovale ou arrondi, bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle)
    Noyau triangulaire rouge soutenu, souvent placé à une extrémité; nombreux
                 grains de pigments orange dans le cytoplasme.
                           Mâle : arrondi, bleu clair
                     Noyau central rond, rouge clair; quelques
                  grains de pigments orange dans le cytoplasme




                                  Hématie
Grosses granulations de Schüffner, souvent colorées en rose, surtout autour des
                               trophozoïtes adultes.

                            Densité parasitaire
                                   Moyenne




                                      23
Plasmodium ovale
                             Trophozoïte jeune
                  Cytoplasme : anneau régulier, bleu soutenu
                 Chromatine : 1 grain rouge de taille moyenne




                            Trophozoïte adulte
Cytoplasme : tâche ronde compacte, très bleue avec quelques grains de pigment
                                      bruns.
                     Chromatine : une grosse tâche rouge




                                 Schizonte
Mérozoites : 8 à 14 grosses tâches rouges en couronne, autour d’un amas central
                             de grains de pigments bruns.




                                      24
Gamétocyte
                                 Stade fréquent
                  Forme : grand, ovale ou arrondi bleu soutenu
                            Noyau : une tâche ronde
              Pigment : quelques grains bruns dans le cytoplasme
Différent de P. vivax par son pigment brun et de P. malariae par la présence de
                                 grains de Schüffner




                                  Hématie
            Peut paraître ovale, avec des extrémités irrégulières
         Grosses granulations de James rouges, facilement visibles.


                            Densité parasitaire
                                   Moyenne




                                      25
ETAPE 5
Estimation de la densité parasitaire sur la goutte
                  épaisse ou sur le frottis mince

En cas de résultat positif, il est nécessaire d’estimer la densité parasitaire car la
gravité de l’infection palustre est liée au nombre d’hématies parasitées.
Un paludisme à P. falciparum est considéré comme sévère quand le nombre
d’hématies parasitées est supérieur à 100000 par µl, l’accès pernicieux est
probable au-delà de 150000 par µl. Une parasitémie supérieur à 400 000 par µl
est un élément de très mauvais pronostic


                                 Sur la goutte épaisse
  On estime la densité parasitaire sur la goutte épaisse quand le nombre de parasite est faible.



Le calcul de la densité parasitaire va être établit par rapport aux leucocytes. Il
suffit de compter le nombre de parasites que l’on voit et de compter au moins 200
leucocytes. On peut s’aider pour cela d’un compteur de cellules. On estime que le
nombre moyen de leucocytes est de 8000 par µl.


Le calcul du nombre de parasites par µl est


                                              8000 x Nombre de parasites comptés
      Nombre de parasites par µl =
                                                  Nombre de leucocytes comptés



Le pourcentage d’hématies parasitées peut en être déduit en prenant comme
nombre moyen d’hématies, 4 500 000 par µl :

                                                     Nombre de parasites par µl
      Pourcentage d’hématies parasitées =
                                                             45000



                                               26
Exemple :
On compte 358 parasites et 205 leucocytes sur la lame
Le nombre de parasites par µl est donc : (8000 x 358) / 205 = 13 971 par µl
Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : 13 971 / 45 000 = 0,31 %




                                   Sur le frottis mince
   On estime la densité parasitaire sur le frottis mince quand le nombre de parasite est élevé.


On compte le nombre d’hématies parasitées par rapport au nombre d’hématies
saines et on établit le pourcentage d’hématies parasitées.
Il suffit pour cela de compter dans 3 à 4 champs microscopiques, choisis au
hasard mais éloignés les uns des autres, le nombre d’hématies (au minimum de
1000    hématies) et le nombre d’hématies parasitées.
NB : un champ microscopique à l’immersion (x 100) contient entre 150 et 300
hématies




              Environ 150 hématies                              Environ 300 hématies


Le pourcentage d’hématies parasitées est donc :


                                                      Nombre d’hématies parasitées x 100
   Pourcentage d’hématies parasitées            =
                                                      Nombre d’hématies saines




                                               27
Le nombre de parasites par µl peut être calculé en prenant comme nombre
moyen d’hématies, 4 500 000 par µl :



   Nombre de parasites par µl    = % d’hématies parasitées x 45 000




Exemple :
On compte 16 hématies parasitées sur 5 champs microscopiques d’environ 300
hématies.
Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : (16 x 100) / 1500 = 1,06 %
Le nombre de parasites par µl est donc : 1,06 x 45 000 = 48 000 par µl




                                       28

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  • 1. atelier.paludisme@pasteur.mg http://www.pasteur.mg/Atelier-Palu/ LE DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU PALUDISME PAR MICROSCOPIE 6ème édition de l’Atelier Paludisme Session 2008 17 Mars au 18 Avril 2008 Dr Marie Ange Rason - Dr Didier Ménard Unité de Recherche sur le Paludisme Institut Pasteur de Madagascar
  • 2. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU PALUDISME Il comprend plusieurs étapes - ETAPE 1- Prélèvement du malade - ETAPE 2- Préparation et coloration de la goutte épaisse et du frottis mince - ETAPE 3- Examen de la goutte épaisse à la recherche des parasites du paludisme Si la recherche est négative : Conclure par « Examen négatif, Absence de Plasmodium » Si la recherche est positive, passer à l’étape 4 - ETAPE 4- Identification des espèces de Plasmodium sur la goutte épaisse et le frottis mince - ETAPE 5- Estimation de la densité parasitaire sur la goutte épaisse (si il y a peu de parasites) ou sur le frottis mince (si il y a beaucoup de parasites) 2
  • 3. ETAPE 1 Prélèvement du malade Matériel nécessaire  Lames de verre propres  Lancette stérile  Méthanol ou Ethanol  Coton hydrophile  Crayon gras ou stylo graveur Méthode  Chez les enfants et adultes, la piqûre se fait au niveau du 3ème ou 4ème doigt de la main gauche, sur le côté qui est moins sensible que le bout du doigt  Chez les nourrissons de moins de 6 mois, la piqûre se fait au niveau du talon ou du gros orteil.  Nettoyer l'endroit choisi d'abord avec un tampon de coton imbibé d'alcool, puis avec un tampon sec pour enlever toute trace d'alcool. 3
  • 4. Piquer d'un coup sec et rapide.  Essuyer la première goutte de sang avec un tampon de coton sec  De la main droite : prendre une lame en la tenant par les bords. De la main gauche : presser le doigt piqué pour faire sortir une goutte de sang.  Prendre une 2ème lame et recueillir une seconde goutte de sang en la mettant délicatement en contact avec une extrémité de la lame 4
  • 5. ETAPE 2 Préparation et coloration de la goutte épaisse et du frottis mince Préparation de la goutte épaisse  Faire un étalement épais, au centre de la lame.  Étaler le sang avec le coin d'une lame propre jusqu'à épaississement uniforme.  Les étalements trop minces ou trop épais ne se colorent pas bien.  Au bout de la lame, inscrire au crayon gras le numéro du malade.  Laisser sécher à l'air pendant au moins 10 minutes, par exemple sur un plan de travail ensoleillé, à condition de protéger l'étalement contre les mouches et la poussière. 5
  • 6. Préparation du frottis mince  Tenir la lame d'une main. De l'autre, poser le bord de la lame rodée juste en avant de la goutte de sang.  Faire glisser la lame rodée jusqu'à ce qu'elle touche la goutte de sang.  Laisser le sang se répartir tout le long du bord de la lame rodée. 6
  • 7. Pousser la lame rodée jusqu'au bout de la lame d'étalement, d'un mouvement doux et régulier (tout le sang doit être réparti avant que l'on atteigne le bout de la lame.  Vérifier que l'étalement est bien fait (voir dessin A) : - il ne doit pas présenter de lignes transversales ou horizontales - il doit être lisse aux extrémités, et non irrégulier ou strié, comme sur le dessin B - il ne doit pas être trop long ni trop épais - il doit être étalé uniformément  Un séchage correct est capital pour conserver la qualité de l'étalement, surtout dans les pays à climat humide. Sécher en agitant rapidement à 5 cm environ d'une lampe à alcool allumée ; sur le côté de la lampe, un peu au- dessus de la flamme (mais jamais directement au-dessus). 7
  • 8. Inscrire sur la lame le nom et le numéro du malade. Écrire au crayon gras sur la partie épaisse de l'étalement, qui n'est pas utilisée pour l'examen. 8
  • 9. Coloration de la goutte épaisse Matériel nécessaire  Éprouvette de 50 ml  Pipette en verre de 5 ml  Poire en caoutchouc  Bac à coloration  Agitateur  Pinces à lame  Râtelier à lames  Minuterie  Colorant de Giemsa  Eau du robinet ou de pluie Préparation du Giemsa à 10 %  Remplir le bac à coloration avec 45 ml d’eau du robinet ou de pluie  Ajouter 5 ml de colorant de Giemsa à l’aide d’une pipette plastique  Mélanger à l’aide d’un agitateur NB : La solution de Giemsa à 10 % ne se conserve que 2 jours Coloration des lames  Plonger les lames à colorer dans la cuve à coloration contenant la solution de Giemsa à 10 %  Laisser colorer pendant 10 minutes  Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet  Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale 9
  • 10. Coloration du frottis mince Matériel nécessaire  Coloration rapide Kit RAL 555 (3 x 100 ml)  Recharge fixateurs RAL 555  Recharge Eosine RAL 555  Recharge Bleu RAL 555 Coloration des lames  Plonger 30 secondes la lame dans le fixateur (flacon 1)  Plonger 30 secondes la lame dans l’éosine (flacon 2)  Rincer la lame à l’eau du robinet  Plonger la lame 2 minutes dans le bleu (flacon 3)  Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet  Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale 10
  • 11. ETAPE 3 Examen de la goutte épaisse à la recherche des parasites du paludisme L'examen d'une goutte épaisse est basé sur l'observation microscopique de 100 champs de bonne qualité. C'est-à-dire que l'on ne peut pas déclarer le prélèvement négatif avant d'avoir examiné 100 champs sans parasite. Technique d'examen des gouttes épaisses 1. Mettre de l'huile à immersion sur la goutte épaisse. 2. Amener l'objectif à immersion 100 x au-dessus de la zone sélectionnée de la goutte épaisse. 3. Abaisser l'objectif jusqu'à ce qu'il entre en contact avec l'huile. 4. S'assurer que la zone choisie a bien la qualité requise et examiner la lame sur 100 champs avec l'objectif à immersion. Ne déplacer la lame que d'un champ à la fois, en suivant le schéma ci-dessus. Corriger la mise au point fine avec la vis micrométrique. 5. Pour vous aider, utilisez un compteur manuel pour compter le nombre de champs examinés. 11
  • 12. A l'examen, vous devez observer :  La goutte épaisse est formée d'un grand nombre d'hématies déshémoglobinisées rassemblées en paquets.  Lors de la coloration de la goutte épaisse, l'eau de la solution de Giemsa agit sur les globules rouges non fixés : le contenu des cellules se dissout alors dans l'eau.  Les leucocytes et les plaquettes présentent un aspect très semblable à ce que l'on observe dans un frottis. Comme ils n'ont pas été étalés par le frottis, les globules blancs paraissent plus petits, avec un cytoplasme plus compact autour du noyau. Hématies N : Neutrophile E : Éosinophile L : Lymphocyte P : Plaquettes Dans les gouttes épaisses, les parasites, comme les globules blancs, apparaissent plus petits que dans les frottis. Il vous faudra sans doute regarder avec beaucoup d'attention avant de les apercevoir. Vous devrez refaire la mise au 12
  • 13. point fine avec la vis micrométrique chaque fois que vous changez de champ. Vous observerez ainsi la goutte épaisse dans différents plans horizontaux. Les fins anneaux de cytoplasme apparaissent parfois interrompus ou incomplets. C'est l'aspect normal des trophozoïtes dans les gouttes épaisses. De même l'absence d'hématie peut également rendre difficile l'observation des granulations de Schüffner ; en fait, dans les parties les plus épaisses de la goutte il est parfois impossible de les voir. On peut cependant souvent observer le «fantôme» des globules rouges entourant les parasites dans les parties les plus fines, en général au bord de la goutte épaisse, ce qui aide à poser le diagnostic. Remarque : Il est impossible d'observer les taches de Maurer avec P. falciparum dans une goutte épaisse. 13
  • 14. Les espèces plasmodiales dans les gouttes épaisses Plasmodium falciparum Trophozoïtes jeunes, en croissance, et/ou gamétocytes matures généralement visibles Trophozoïtes Schizontes Gamétocytes Plasmodium vivax Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner dans les fantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la goutte épaisse Trophozoïtes Schizontes Gamétocytes 14
  • 15. Plasmodium ovale Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner nettement visibles dans les fantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la goutte épaisse Trophozoïtes Schizontes Gamétocytes Plasmodium malariae Tous les stades sont visibles Trophozoïtes Schizontes Gamétocytes 15
  • 16. ETAPE 4 Identification des espèces de Plasmodium sur la goutte épaisse et le frottis mince En cas de résultat positif, il est nécessaire d’examiner le frottis mince pour déterminer le ou les espèce(s) en cause. Examen du frottis mince Pour examiner un frottis, procéder de façon systématique et normalisée :  Mettre la lame sur la platine.  Placer l'objectif 100 x à immersion au-dessus du bord du frottis, à mi-distance de ses deux extrémités.  Mettre une goutte d'huile à immersion à cet endroit.  Abaisser l'objectif à immersion jusqu'à ce qu'il soit en contact avec l'huile.  Examiner le frottis de la façon suivante pour déterminer le ou les espèce(s) en cause. Identification des espèces plasmodiales 16
  • 17. Les parasites découverts dans le sang en sont à différents stades de développement Les hématies parasitées peuvent rester identiques ou changer de couleur ou de forme, ou encore contenir des granulations roses (granulations de Schüffner). Attention : on peut trouver plusieurs espèces associées chez un même malade. 17
  • 18. Plasmodium falciparum Trophozoïte jeune Stade fréquent Cytoplasme : petit anneau fin, bleu pâle, sans granulations Chromatine : 1 ou 2 petits grains rouges Trophozoïte adulte Stade fréquent Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, ou aspect en virgule, ou en point d'exclamation Schizonte Très rare Pratiquement jamais trouvés dans les étalements de sang (sauf dans les cas très graves) Mérozoites : 18 à 32 Pigment: brun foncé ou noir 18
  • 19. Gamétocyte Stade assez fréquent Forme : banane, croissant ou faux Couleur : bleu (mâle) ou bleu soutenu (femelle) Noyau : rose-rouge Pigment : quelques grains bleu- noir situés au centre du cytoplasme, ou dispersés Hématie De taille normale Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes. Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières. Densité parasitaire Souvent très élevée 19
  • 20. Plasmodium malariae Trophozoïte jeune Stade fréquent Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, avec quelques grains de pigments noirs Chromatine : 1 grosse tâche rouges Trophozoïte adulte Stade fréquent Cytoplasme : soit tâche compacte, arrondie, bleu foncé, avec de nombreux grains de pigment noirs, soit disposé en bande (étalements minces seulement). Chromatine : tâche ronde ou bande rouge 20
  • 21. Schizonte Stade assez fréquent Mérozoites : 8 à 10 Chacun est une grosse tâche rouge entourée d’un peu de cytoplasme pâle. Ils peuvent avoir une disposition irrégulière (forme jeune) ou être disposés en couronne (forme adulte Gamétocyte Stade assez fréquent Forme : grand, ovale ou arrondi Couleur : bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle) Noyau : une tâche ronde de chromatine rouge contre un bord Pigment : gros grains noirs dans le cytoplasme Hématie De taille et forme normales Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes. Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières. Densité parasitaire Faible 21
  • 22. Plasmodium vivax Trophozoïte jeune Stade fréquent Cytoplasme : anneau bleu assez gros, à contour irrégulier Chromatine : 1 grain rouge, assez gros Trophozoïte adulte Stade peu fréquent Cytoplasme : large tâche bleue, irrégulière (quelque fois divisée en 2, 3 ou 4), avec de petits grains de pigment brun-orange. Chromatine : une tâche rouge 22
  • 23. Schizonte Stade assez fréquent Mérozoites : 12 à 18 gros grains rouges compacts, posés sur le cytoplasme bleu pâle Gamétocyte Stade fréquent Femelle : ovale ou arrondi, bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle) Noyau triangulaire rouge soutenu, souvent placé à une extrémité; nombreux grains de pigments orange dans le cytoplasme. Mâle : arrondi, bleu clair Noyau central rond, rouge clair; quelques grains de pigments orange dans le cytoplasme Hématie Grosses granulations de Schüffner, souvent colorées en rose, surtout autour des trophozoïtes adultes. Densité parasitaire Moyenne 23
  • 24. Plasmodium ovale Trophozoïte jeune Cytoplasme : anneau régulier, bleu soutenu Chromatine : 1 grain rouge de taille moyenne Trophozoïte adulte Cytoplasme : tâche ronde compacte, très bleue avec quelques grains de pigment bruns. Chromatine : une grosse tâche rouge Schizonte Mérozoites : 8 à 14 grosses tâches rouges en couronne, autour d’un amas central de grains de pigments bruns. 24
  • 25. Gamétocyte Stade fréquent Forme : grand, ovale ou arrondi bleu soutenu Noyau : une tâche ronde Pigment : quelques grains bruns dans le cytoplasme Différent de P. vivax par son pigment brun et de P. malariae par la présence de grains de Schüffner Hématie Peut paraître ovale, avec des extrémités irrégulières Grosses granulations de James rouges, facilement visibles. Densité parasitaire Moyenne 25
  • 26. ETAPE 5 Estimation de la densité parasitaire sur la goutte épaisse ou sur le frottis mince En cas de résultat positif, il est nécessaire d’estimer la densité parasitaire car la gravité de l’infection palustre est liée au nombre d’hématies parasitées. Un paludisme à P. falciparum est considéré comme sévère quand le nombre d’hématies parasitées est supérieur à 100000 par µl, l’accès pernicieux est probable au-delà de 150000 par µl. Une parasitémie supérieur à 400 000 par µl est un élément de très mauvais pronostic Sur la goutte épaisse On estime la densité parasitaire sur la goutte épaisse quand le nombre de parasite est faible. Le calcul de la densité parasitaire va être établit par rapport aux leucocytes. Il suffit de compter le nombre de parasites que l’on voit et de compter au moins 200 leucocytes. On peut s’aider pour cela d’un compteur de cellules. On estime que le nombre moyen de leucocytes est de 8000 par µl. Le calcul du nombre de parasites par µl est 8000 x Nombre de parasites comptés Nombre de parasites par µl = Nombre de leucocytes comptés Le pourcentage d’hématies parasitées peut en être déduit en prenant comme nombre moyen d’hématies, 4 500 000 par µl : Nombre de parasites par µl Pourcentage d’hématies parasitées = 45000 26
  • 27. Exemple : On compte 358 parasites et 205 leucocytes sur la lame Le nombre de parasites par µl est donc : (8000 x 358) / 205 = 13 971 par µl Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : 13 971 / 45 000 = 0,31 % Sur le frottis mince On estime la densité parasitaire sur le frottis mince quand le nombre de parasite est élevé. On compte le nombre d’hématies parasitées par rapport au nombre d’hématies saines et on établit le pourcentage d’hématies parasitées. Il suffit pour cela de compter dans 3 à 4 champs microscopiques, choisis au hasard mais éloignés les uns des autres, le nombre d’hématies (au minimum de 1000 hématies) et le nombre d’hématies parasitées. NB : un champ microscopique à l’immersion (x 100) contient entre 150 et 300 hématies Environ 150 hématies Environ 300 hématies Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : Nombre d’hématies parasitées x 100 Pourcentage d’hématies parasitées = Nombre d’hématies saines 27
  • 28. Le nombre de parasites par µl peut être calculé en prenant comme nombre moyen d’hématies, 4 500 000 par µl : Nombre de parasites par µl = % d’hématies parasitées x 45 000 Exemple : On compte 16 hématies parasitées sur 5 champs microscopiques d’environ 300 hématies. Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : (16 x 100) / 1500 = 1,06 % Le nombre de parasites par µl est donc : 1,06 x 45 000 = 48 000 par µl 28