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Sérodiagnostic de la
Syphilis
VDRL-TPHA
Par : S / Abdessemed
Abdsalah
INTRODUCTION
• Le diagnostic sérologique repose sur la
mise en évidence des anticorps induits
par l’infection et retrouvés dans le sérum.
• Le sérum est traité pour retirer
certaines substances qui peuvent gêner la
technique ce qui aboutit à une certaine
dilution
• Le patient doit être de préférence à jeun
Abdsalah
Les réactions sérologiques
Réaction à antigène
non tréponémique
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Réaction à antigène
tréponémique
Abdsalah
:
VDRL( veneral disease research laboratory)
Principe:
Réaction d’agglutination passive sur lame en
verre.
Antigène utilisé est d’origine cardiolipidique
constitué de microcristaux de cholestérol sur
lesquels sont adsorbés les molécules de
cardiolipide = Haptène de Wasserman.
Des particules de charbon sont piégés dans la
combinaison Ac-Ag pour faciliter la lecture.
Abdsalah
Matériel et réactifs
Sérum frais.
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 Matériel:
Centrifugeuse
Micropipettes réglables ( 5-50µL)
Plaques en verre
Portoir pour tubes à hémolyse
Agitateur rotatif de Kline
Container de déchets contaminés
Eau de Javel
Abdsalah
Mode opératoire:
Réaction qualitative Réaction quantitative
( dépistage) (dépistage positif)
Deux types de réactions
Abdsalah
Réaction qualitative
Distribuer 50µL de sérum sur chaque puit
de la plaque en verre.
 Ajouter 16µL d’Antigène VDRL.
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Abdsalah
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inconnu
Sérum 50 µl de S + 50 µl de S - 50µL d’eau
physiologique
50 µl de
sérum
inconnu.
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physiologique.
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physiologique 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl
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50
reporter reporter
50
reporter 50 reporter 50 jeter 50µl
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le cas du dépistage positif.
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Matériel et réactifs
Sérum frais
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Mode opératoire:
Deux types de réactions
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( dépistage) (dépistage positif)
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Technique qualitative
• 1. chaque échantillon va utiliser 3 puits de la
plaque.
• 2. Déposer 190µl de diluant et 10 µl de sérum
dans le puit 1.
• 3. Avec une pipette, mixer le contenu du puit
1 et en transférer 25µl aux puits 2 et 3.
• 4. Homogénéiser complètement le réactif
TPHA et le contrôle TPHA. Ajouter 75 µl de
contrôle TPHA au puit 2 et 75 µl de réactif
TPHA au puit 3.
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• 5-Agiter doucement la plaque jusqu’ à
obtenir un mélange homogène de manière à
être sur d’éviter une contamination croisée.
• 6. incuber la plaque pendant 45 à 60
minutes à 18-25°C. Pendant l’incubation,
garder la µplaque bien à l’abri de sources de
chaleur, des rayons solaires et de toutes
vibrations.
• 7. Lire et consigner les résultats ; les
résultats sont stables 24 heures si la
plaque est couverte et les précautions ci-
dessus respectées.
Abdsalah
Cupule
A B C
Diluant
en µl
190
Sérum
en µl
10 25 *
25 *
HS en µl
75
HNS en µl 75
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Puit 1 : voile uniforme
couvrant tout le puit
→ Fortement positif.
Puit 2 : voile couvrant
le 2/3 du puit →
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le 1/3 du puit →
Faiblement positifs.
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serré
à bord nets (absence
de voile) → Négatif.
Lecture des résultats
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Fortement positif Aspect de voile couvrant
uniformément le fond de la
cupule
Pas d’agglutination ; aspect
de bouton compact
Faiblement positif Aspect de voile couvrant
approximativement 1/3 du
fond de la cupule
Pas d’agglutination ; aspect
de bouton compact
indéterminé Aspect de voile montant
clairement un anneau
central distinct (voile non
uniforme)
Pas d’agglutination ; aspect
de bouton compact
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montrant clairement un
petit anneau central clair
Pas d’agglutination ; aspect
de bouton compact
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Interprétation des résultats
Abdsalah
Technique quantitative
• 1. Chaque échantillon va utiliser 8 puits de
la plaque labellisés de A à H.
• 2. Déposer 25µl de diluant dans les puits de
B à H uniquement.
• 3. Transférer 25µl de sérum dilué au 1/20
dans les puits A et B uniquement.
• 4. Prendre 25 µl du sérum dilué du puit B et
effectuer des doubles dilutions du sérum
des puits B et H inclus et éliminer les 25 µl
de sérum du puit H.
Abdsalah
• Ajouter 75µl de réactif TPHA au puit A à
H inclus.
• 6. Agiter doucement la plaque jusqu’à
obtenir un mélange homogène.
• 7. Incuber la plaque pendant 45 à60
minutes à 18-25°C. pendant l’incubation,
garder la plaque bien à l’abri des sources de
chaleur, des rayons solaires et de toutes
vibrations.
• 8. Lire et consigner les résultats ; les
résultats sont stables 24 heures si la
plaque est couverte et les précautions ci-
dessus respectées.
Abdsalah
Cupule
A B C D E F G H
Diluant
en µl
25 25 25 25 25 25 25
Sérum
1/20 en µ
l
25 25 * 25* 25* 25* 25* 25* 25**
HS en µl 75 75 75 75 75 75 75 75
Dilution 1 / 80 1 / 160 1 / 320 1 / 640 1 / 1280 1 / 2560 1 / 5120 1 / 10240
Lecture + + + + + - - -
Titre retenu 1280 ( dernière cupule présentant une hémagglutination nette ).
* : reporter 25 µl dans la cupule suivante à gauche.
**: jeter 25 µl dans l'eau de javel.
25
Abdsalah
Absorption non spécifique
• 1. Déposer 100µl de l’échantillon dans un
petit tube et ajouter 400µl de contrôle
TPHA.
• 2. Bien mélanger le tube
• 3. Centrifuger le tube 15 minutes à 1000
rpm et tester le surnageant par la
méthode qualitative.
Abdsalah
• 4. Remarque : l’échantillon est
maintenant à 1/5 ; ceci doit être pris en
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VDRL - TPHA

  • 2. Abdsalah INTRODUCTION • Le diagnostic sérologique repose sur la mise en évidence des anticorps induits par l’infection et retrouvés dans le sérum. • Le sérum est traité pour retirer certaines substances qui peuvent gêner la technique ce qui aboutit à une certaine dilution • Le patient doit être de préférence à jeun
  • 3. Abdsalah Les réactions sérologiques Réaction à antigène non tréponémique (Ag cardiolipidique) Réaction à antigène tréponémique
  • 4. Abdsalah : VDRL( veneral disease research laboratory) Principe: Réaction d’agglutination passive sur lame en verre. Antigène utilisé est d’origine cardiolipidique constitué de microcristaux de cholestérol sur lesquels sont adsorbés les molécules de cardiolipide = Haptène de Wasserman. Des particules de charbon sont piégés dans la combinaison Ac-Ag pour faciliter la lecture.
  • 5. Abdsalah Matériel et réactifs Sérum frais.  Eau physiologique.  Antigène VDRL près à l’emploi.  Matériel: Centrifugeuse Micropipettes réglables ( 5-50µL) Plaques en verre Portoir pour tubes à hémolyse Agitateur rotatif de Kline Container de déchets contaminés Eau de Javel
  • 6. Abdsalah Mode opératoire: Réaction qualitative Réaction quantitative ( dépistage) (dépistage positif) Deux types de réactions
  • 7. Abdsalah Réaction qualitative Distribuer 50µL de sérum sur chaque puit de la plaque en verre.  Ajouter 16µL d’Antigène VDRL.  Placer la plaque sur l’agitateur de Kline pendant 8mn.  Lire immédiatement au microscope.
  • 8. Abdsalah Puits Témoin + Témoin - Témoin Ag VDRL Sérum inconnu Sérum 50 µl de S + 50 µl de S - 50µL d’eau physiologique 50 µl de sérum inconnu. Antigène VDRL 16µl 16µl 16µl 16µl Placer sur un plateau rotatif (agitateur de kline) pendant 8 minutes. Lecture + - -
  • 11. Abdsalah Réaction quantitative Lorsque la réaction qualitative est positive on réalise la même réaction avec une série de dilution du sérum au (1/2, 1/4, 1/8, 1/16,1/32…) avec de l’eau physiologique.  Le titre d’anticorps est exprimé par l’inverse de la dernière dilution donnant une réaction positive nette.
  • 12. Abdsalah Puits 1 2 3 4 5 Eau physiologique 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl Dilution 1 / 2 1 / 4 1 / 8 1 / 16 1 / 32 Sérum à analyser En µl 50 reporter reporter 50 reporter 50 reporter 50 jeter 50µl dans l’eau de Javel Ag VDRL 16µl 16µl 16µl 16µl 16µl agitation pendant 8 minutes. Lecture
  • 13. Abdsalah TPHA: ( Treponema pallidum hemagglutination assay) Principe:  Réaction d’hemmagglutination passive réalisée sur des microplaques.  L’Antigène utilisé est un lysat de tréponema pallidum adsorbé sur des hématies.  Le dépistage consiste à tester le sérum à la dilution de 1/80.  Des dilutions sont effectuées pour le titre dans le cas du dépistage positif.
  • 14. Abdsalah Matériel et réactifs Sérum frais Coffret de réactif pour TPHA: o Hématies tests o Hématies contrôles o Diluant o Témoin positif o Témoin négatif
  • 15. Abdsalah o Centrifugeuse o Micropipette réglable (5 -50 µL),( 50 – 200 µL) o Pipette multicanaux o Plaque de microtitration à fond en U o Portoir pour tubes à hémolyse o Container de déchets contaminés
  • 16. Abdsalah Mode opératoire: Deux types de réactions Réaction qualitative Réaction quantitative ( dépistage) (dépistage positif)
  • 17. Abdsalah Technique qualitative • 1. chaque échantillon va utiliser 3 puits de la plaque. • 2. Déposer 190µl de diluant et 10 µl de sérum dans le puit 1. • 3. Avec une pipette, mixer le contenu du puit 1 et en transférer 25µl aux puits 2 et 3. • 4. Homogénéiser complètement le réactif TPHA et le contrôle TPHA. Ajouter 75 µl de contrôle TPHA au puit 2 et 75 µl de réactif TPHA au puit 3.
  • 18. Abdsalah • 5-Agiter doucement la plaque jusqu’ à obtenir un mélange homogène de manière à être sur d’éviter une contamination croisée. • 6. incuber la plaque pendant 45 à 60 minutes à 18-25°C. Pendant l’incubation, garder la µplaque bien à l’abri de sources de chaleur, des rayons solaires et de toutes vibrations. • 7. Lire et consigner les résultats ; les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et les précautions ci- dessus respectées.
  • 19. Abdsalah Cupule A B C Diluant en µl 190 Sérum en µl 10 25 * 25 * HS en µl 75 HNS en µl 75 Lecture + + +
  • 20. Abdsalah Puit 1 : voile uniforme couvrant tout le puit → Fortement positif. Puit 2 : voile couvrant le 2/3 du puit → Moyennement positif. Puit 3 : voile couvrant le 1/3 du puit → Faiblement positifs. Puit 4 : Anneau très serré à bord nets (absence de voile) → Négatif. Lecture des résultats
  • 21. Abdsalah Résultats Cupules échantillons Cupules de contrôle Fortement positif Aspect de voile couvrant uniformément le fond de la cupule Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact Faiblement positif Aspect de voile couvrant approximativement 1/3 du fond de la cupule Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact indéterminé Aspect de voile montant clairement un anneau central distinct (voile non uniforme) Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact Négatif Aspect de bouton compact montrant clairement un petit anneau central clair Pas d’agglutination ; aspect de bouton compact Non spécifique Réaction positive Réaction positive Interprétation des résultats
  • 22. Abdsalah Technique quantitative • 1. Chaque échantillon va utiliser 8 puits de la plaque labellisés de A à H. • 2. Déposer 25µl de diluant dans les puits de B à H uniquement. • 3. Transférer 25µl de sérum dilué au 1/20 dans les puits A et B uniquement. • 4. Prendre 25 µl du sérum dilué du puit B et effectuer des doubles dilutions du sérum des puits B et H inclus et éliminer les 25 µl de sérum du puit H.
  • 23. Abdsalah • Ajouter 75µl de réactif TPHA au puit A à H inclus. • 6. Agiter doucement la plaque jusqu’à obtenir un mélange homogène. • 7. Incuber la plaque pendant 45 à60 minutes à 18-25°C. pendant l’incubation, garder la plaque bien à l’abri des sources de chaleur, des rayons solaires et de toutes vibrations. • 8. Lire et consigner les résultats ; les résultats sont stables 24 heures si la plaque est couverte et les précautions ci- dessus respectées.
  • 24. Abdsalah Cupule A B C D E F G H Diluant en µl 25 25 25 25 25 25 25 Sérum 1/20 en µ l 25 25 * 25* 25* 25* 25* 25* 25** HS en µl 75 75 75 75 75 75 75 75 Dilution 1 / 80 1 / 160 1 / 320 1 / 640 1 / 1280 1 / 2560 1 / 5120 1 / 10240 Lecture + + + + + - - - Titre retenu 1280 ( dernière cupule présentant une hémagglutination nette ). * : reporter 25 µl dans la cupule suivante à gauche. **: jeter 25 µl dans l'eau de javel. 25
  • 25. Abdsalah Absorption non spécifique • 1. Déposer 100µl de l’échantillon dans un petit tube et ajouter 400µl de contrôle TPHA. • 2. Bien mélanger le tube • 3. Centrifuger le tube 15 minutes à 1000 rpm et tester le surnageant par la méthode qualitative.
  • 26. Abdsalah • 4. Remarque : l’échantillon est maintenant à 1/5 ; ceci doit être pris en compte lors de la préparation des dilutions. • 5. Si le résultat est de nouveau non spécifique, l’échantillon doit être testé par une autre technique telle que le FTA-ABS.