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TITRAGE DES ANTICORPS
ANTI-STREPTOLYSINE O
(ASLO)
« par réaction de neutralisation »
Par : S/Abdessemed
Abdsalah
1. PRINCIPE
• On recherche la présence d’anticorps anti-
streptolysine (ASLO) dans le sérum du
patient suspecté d’infection
streptococcique. Dans ce but, on utilise
comme antigène la streptolysine protéine
produite par les streptocoques b-
hémolytiques (groupe A, C ou G) et capable
de se fixer au cholestérol membranaire
des cellules cibles (hématies, leucocytes…)
pour former des pores.
Abdsalah
 Dans un 1er temps, on met en présence :
o Des quantités connues et croissantes de
SLO réparties dans les cupules d’une
barrette
o Un volume constant du sérum à titrer.
Abdsalah
• Pendant l’incubation, si le sérum contient
des Ac anti-SLO (ASLO), ils se fixent
grâce à leurs paratopes sur les épitopes
spécifiques de la streptolysine et
neutralisent son activité : on parle de
réaction de neutralisation de l’activité.
Si le sérum ne contient pas d’Ac anti-
SLO, la streptolysine n’est pas
neutralisée.
Abdsalah
• Dans un second temps, pour révéler la
réaction, on ajoute des globules rouges
de lapin (cibles de la SLO). Après
incubation :
• S’il y a hémolyse : la SLO est active, elle
n’a donc pas été neutralisée. Le sérum ne
contient pas d’ASLO.
• S’il n’y a pas d’hémolyse : la SLO a été
neutralisée par les ASLO présents dans
le sérum.
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2. ELEMENTS EN PRESENCE
o Sérums à tester
• Ils doivent être ramenés à température
ambiante avant utilisation.
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• Le sérum contrôle positif est testé en même
temps que les sérums des patients et à
l’ouverture de chaque nouveau coffret. Il
permet un contrôle de qualité indispensable
pour la validation des résultats des patients :
• Contrôle de la qualité des GR de lapin et
réactifs du coffret
• Contrôle de la qualité d’exécution des
réactions.
Abdsalah
o Réactifs
Ils se conservent entre +2°C et +8°C, mais
doivent être ramenés à température ambiante
avant utilisation.
• Streptolysine O
• Réducteur
• Sérum de contrôle positif
• Tampon phosphate-Nacl PH 6,6
• Globules rouges de lapin
Abdsalah
– Matériel nécessaire
• Support de barrette
• Couvercles de microplaques adaptés aux
supports
• Pipettes automatiques et cônes
correspondants
• Portoir et tubes à hémolyse à usage unique
• Etuve ou bain thermostaté à 37°C.
Abdsalah
3. REALISATION PRATIQUE
• Diluer les sérums à tester au 1/100 dans le
mélange tampon-réducteur : 10µL de sérum+
990 µL de réactif
• Prévoir le nombre de barrettes nécessaires
et les placer sur un support
• Pour chaque sérum, répartir 75 µL de dilution
dans chacun des 8 puits d’une barrette à
partir du repère rouge ASL
• Agiter le support 1 min, par tapotement
latéral, pour dissoudre la streptolysine
Abdsalah
• Incuber 15 min à température ambiante (18-
25°C)
• Distribuer 75 µL de suspension à 2% de GRL
dans chaque puits des différentes barrettes
• Agiter doucement le support pour homogénéiser
• Recouvrir pour éviter la dessiccation, puis
incuber:
– Soit 1h15 à 1h30 à température ambiante
– Soit 45 min à température ambiante, puis
centrifuger 2 min à 2000 tr/min
• Effectuer la lecture
Abdsalah
– Lecture
• Sortir chaque barrette du support et
observer latéralement pour noter la
présence ou l’absence d’hémolyse dans
chacun des puits.
Abdsalah
Abdsalah
Abdsalah
4. RESULTATS ET
INTERPRETATION
• Le résultat du patient ne peut être validé
que si le résultat du témoin sérum est
correct.
– Discussion du témoin sérum (puits N°8)
• Composition : GR de lapin + sérum dilué
(absence de SLO)
• Il vérifie la qualité de la suspension de
GRL et le comportement du sérum vis-à-vis
des GRL, en l’absence de SLO.
Abdsalah
• Résultat correct attendu : absence
d’hémolyse.
• Les résultats des autres puits peuvent
alors être interprétés.
Abdsalah
• En cas de résultat anormal : il y a
hémolyse. Cela peut correspondre à deux
éventualités :
– L’anomalie ne concerne qu’une ou quelques
barrettes de la série : cela signifie que le
sérum correspondant au témoin anormal
contient des substances provoquant l’hémolyse
des GRL.
– Tous les puits de la barrette présentent une
hémolyse et le résultat obtenu pour ce sérum
n’est pas validable.
Abdsalah
– L’anomalie concerne toutes les barrettes de la
série et tous les puits : cela signifie que les
GRL sont hémolysés spontanément, donc non
utilisables.
– Les résultats obtenus avec le sérum de
contrôle et les sérums des patients ne sont
pas validables.
– Il faut recommencer toute la série avec une
autre suspension de GR.
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– Détermination du titre des sérums
• A partir du repère "ASL" indiqué sur la
barrette, noter le dernier puits de GR
entièrement sédimentés donc non
hémolysés : il correspond à la plus grande
quantité de SLO pouvant être neutralisée
par les Ac contenus dans le sérum dilué.
Dans ce puits, le nombre d’U.ASLO est ≥
nombre d’U.SLO.
Abdsalah
• Le tableau ci-dessous donne la
correspondance entre le numéro du puits
(à partir du repère "ASL" indiqué sur la
barrette) et le titre du sérum en
U.ASLO/mL.
N° du puits 1 2 3 4 5 6 7 8
Titre en U.ASLO/mL ou
nature du témoin
100 200 300 400 600 800 ≥ 1200 T sérum
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Exemple de résultat :
N° puits 1 2 3 4 5 6 7 8
Titre en U.ASLO/mL
100 200 300 400 600 800 ≥ 1200 T sérum
Lecture Absence
d’hémolyse
Absence
d’hémolyse
Absence
d’hémolyse
Absence
d’hémolyse
Absence
d’hémolyse
Hémolyse Hémolyse Absence
d’hémolyse
Interprétation Neutralisation totale de la SLO SLO non neutralisée
Témoin
correct
Conclusion Titre du sérum : 600 U.ASLO/mL
Abdsalah
Remarques :
• Les titres obtenus pour les sérums d’une
série ne peuvent être validés que si le titre
trouvé pour le sérum de contrôle, testé
avec cette série, est égal à celui indiqué
par le fournisseur.
• Si le titre d’un sérum est supérieur ou égal
à 1200 U.ASLO/mL, il faut refaire le
titrage de ce sérum à partir d’une dilution
1/1000 et multiplier par 10 la valeur
donnée par le tableau.
Abdsalah
Interprétation
En fonction du contexte clinique, en cas de résultat
négatif ou douteux à la fois pour les ASD et les ASLO,
on peut être amené à vérifier la sérologie sur un second
prélèvement environ 15 jours plus tard.
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TITRAGE DES ANTICORPS ANTI-STREPTOLYSINE O (ASLO)

  • 1. Abdsalah TITRAGE DES ANTICORPS ANTI-STREPTOLYSINE O (ASLO) « par réaction de neutralisation » Par : S/Abdessemed
  • 2. Abdsalah 1. PRINCIPE • On recherche la présence d’anticorps anti- streptolysine (ASLO) dans le sérum du patient suspecté d’infection streptococcique. Dans ce but, on utilise comme antigène la streptolysine protéine produite par les streptocoques b- hémolytiques (groupe A, C ou G) et capable de se fixer au cholestérol membranaire des cellules cibles (hématies, leucocytes…) pour former des pores.
  • 3. Abdsalah  Dans un 1er temps, on met en présence : o Des quantités connues et croissantes de SLO réparties dans les cupules d’une barrette o Un volume constant du sérum à titrer.
  • 4. Abdsalah • Pendant l’incubation, si le sérum contient des Ac anti-SLO (ASLO), ils se fixent grâce à leurs paratopes sur les épitopes spécifiques de la streptolysine et neutralisent son activité : on parle de réaction de neutralisation de l’activité. Si le sérum ne contient pas d’Ac anti- SLO, la streptolysine n’est pas neutralisée.
  • 5. Abdsalah • Dans un second temps, pour révéler la réaction, on ajoute des globules rouges de lapin (cibles de la SLO). Après incubation : • S’il y a hémolyse : la SLO est active, elle n’a donc pas été neutralisée. Le sérum ne contient pas d’ASLO. • S’il n’y a pas d’hémolyse : la SLO a été neutralisée par les ASLO présents dans le sérum.
  • 7. Abdsalah 2. ELEMENTS EN PRESENCE o Sérums à tester • Ils doivent être ramenés à température ambiante avant utilisation.
  • 9. Abdsalah • Le sérum contrôle positif est testé en même temps que les sérums des patients et à l’ouverture de chaque nouveau coffret. Il permet un contrôle de qualité indispensable pour la validation des résultats des patients : • Contrôle de la qualité des GR de lapin et réactifs du coffret • Contrôle de la qualité d’exécution des réactions.
  • 10. Abdsalah o Réactifs Ils se conservent entre +2°C et +8°C, mais doivent être ramenés à température ambiante avant utilisation. • Streptolysine O • Réducteur • Sérum de contrôle positif • Tampon phosphate-Nacl PH 6,6 • Globules rouges de lapin
  • 11. Abdsalah – Matériel nécessaire • Support de barrette • Couvercles de microplaques adaptés aux supports • Pipettes automatiques et cônes correspondants • Portoir et tubes à hémolyse à usage unique • Etuve ou bain thermostaté à 37°C.
  • 12. Abdsalah 3. REALISATION PRATIQUE • Diluer les sérums à tester au 1/100 dans le mélange tampon-réducteur : 10µL de sérum+ 990 µL de réactif • Prévoir le nombre de barrettes nécessaires et les placer sur un support • Pour chaque sérum, répartir 75 µL de dilution dans chacun des 8 puits d’une barrette à partir du repère rouge ASL • Agiter le support 1 min, par tapotement latéral, pour dissoudre la streptolysine
  • 13. Abdsalah • Incuber 15 min à température ambiante (18- 25°C) • Distribuer 75 µL de suspension à 2% de GRL dans chaque puits des différentes barrettes • Agiter doucement le support pour homogénéiser • Recouvrir pour éviter la dessiccation, puis incuber: – Soit 1h15 à 1h30 à température ambiante – Soit 45 min à température ambiante, puis centrifuger 2 min à 2000 tr/min • Effectuer la lecture
  • 14. Abdsalah – Lecture • Sortir chaque barrette du support et observer latéralement pour noter la présence ou l’absence d’hémolyse dans chacun des puits.
  • 17. Abdsalah 4. RESULTATS ET INTERPRETATION • Le résultat du patient ne peut être validé que si le résultat du témoin sérum est correct. – Discussion du témoin sérum (puits N°8) • Composition : GR de lapin + sérum dilué (absence de SLO) • Il vérifie la qualité de la suspension de GRL et le comportement du sérum vis-à-vis des GRL, en l’absence de SLO.
  • 18. Abdsalah • Résultat correct attendu : absence d’hémolyse. • Les résultats des autres puits peuvent alors être interprétés.
  • 19. Abdsalah • En cas de résultat anormal : il y a hémolyse. Cela peut correspondre à deux éventualités : – L’anomalie ne concerne qu’une ou quelques barrettes de la série : cela signifie que le sérum correspondant au témoin anormal contient des substances provoquant l’hémolyse des GRL. – Tous les puits de la barrette présentent une hémolyse et le résultat obtenu pour ce sérum n’est pas validable.
  • 20. Abdsalah – L’anomalie concerne toutes les barrettes de la série et tous les puits : cela signifie que les GRL sont hémolysés spontanément, donc non utilisables. – Les résultats obtenus avec le sérum de contrôle et les sérums des patients ne sont pas validables. – Il faut recommencer toute la série avec une autre suspension de GR.
  • 21. Abdsalah – Détermination du titre des sérums • A partir du repère "ASL" indiqué sur la barrette, noter le dernier puits de GR entièrement sédimentés donc non hémolysés : il correspond à la plus grande quantité de SLO pouvant être neutralisée par les Ac contenus dans le sérum dilué. Dans ce puits, le nombre d’U.ASLO est ≥ nombre d’U.SLO.
  • 22. Abdsalah • Le tableau ci-dessous donne la correspondance entre le numéro du puits (à partir du repère "ASL" indiqué sur la barrette) et le titre du sérum en U.ASLO/mL. N° du puits 1 2 3 4 5 6 7 8 Titre en U.ASLO/mL ou nature du témoin 100 200 300 400 600 800 ≥ 1200 T sérum
  • 23. Abdsalah Exemple de résultat : N° puits 1 2 3 4 5 6 7 8 Titre en U.ASLO/mL 100 200 300 400 600 800 ≥ 1200 T sérum Lecture Absence d’hémolyse Absence d’hémolyse Absence d’hémolyse Absence d’hémolyse Absence d’hémolyse Hémolyse Hémolyse Absence d’hémolyse Interprétation Neutralisation totale de la SLO SLO non neutralisée Témoin correct Conclusion Titre du sérum : 600 U.ASLO/mL
  • 24. Abdsalah Remarques : • Les titres obtenus pour les sérums d’une série ne peuvent être validés que si le titre trouvé pour le sérum de contrôle, testé avec cette série, est égal à celui indiqué par le fournisseur. • Si le titre d’un sérum est supérieur ou égal à 1200 U.ASLO/mL, il faut refaire le titrage de ce sérum à partir d’une dilution 1/1000 et multiplier par 10 la valeur donnée par le tableau.
  • 25. Abdsalah Interprétation En fonction du contexte clinique, en cas de résultat négatif ou douteux à la fois pour les ASD et les ASLO, on peut être amené à vérifier la sérologie sur un second prélèvement environ 15 jours plus tard.