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S/A 
Le dépistage de 
l’antigène HBs 
(Par méthode ELISA) 
LL 
S / Abdessemed
S/A 
Intérêt diagnostique : 
Une hépatite virale de type B est le plus 
souvent accompagnée de l’apparition de 
l’antigène de surface du virus de l’hépatite 
B dans le sérum. En règle générale, l’AgHBs 
peut être mis en évidence dans le sérum dès 
2 à 3 semaines avant le début de la maladie, 
et atteint son point culminant au moment de 
l’apparition des symptômes caractéristique 
(ictère, modification de la concentration 
des enzymes spécifiques du foie).
S/A 
On observe ensuite généralement une 
lente élimination de l’antigène. Chez un 
certain nombre de sujets, et chez un 
pourcentage inconnu de personnes ayant 
été infectées par le virus de l’hépatite B 
de façon subclinique, l’antigène peut 
rester mesurable dans le sérum pendant 
des années, voire à vie.
S/A 
Dans la mesure où une transfusion de sang 
contenant de l’AgHBs a entraîné une 
hépatite B dans de nombreux cas, le 
principal intérêt de la mise en évidences de 
l’AgHBs réside dans le dépistage des dons 
de sang, afin de réduire la fréquence des 
hépatites B post-transfusionnelles. La 
détection de l’AgHBs est également 
utilisée pour le diagnostic des hépatites B 
aigues ou chroniques.
S/A
S/A
stade Ag HBS Ag HBe Ac anti HBS Ac anti HBC Ac anti HBe 
Hépatite : Début 
S/A 
Etat 
Guérison 
++ 
+/- 
- 
+ 
+ 
- 
- 
- 
+/- 
- 
++ 
+ 
- 
- 
+ 
Hépatite 
chronique 
+ + - + - 
Porteur sain + +/- - + -/+ 
Vaccination - - + - -
S/A 
1. Principe : 
Enzygnost ®HBs Ag est un test 
immunoenzymatique basé sur une réaction 
en deux étapes : l’Ag HBs contenu dans 
l’échantillon à tester réagit tout d’abord 
simultanément d’une part avec les anticorps 
anti-HBs polyclonaux fixés à la surface des 
cupules de plaque de microtitration, et 
d’autre part avec le conjugué 1 (anti- 
HBs/Biotine, coloré en bleu). Après 
élimination des éléments non liés, le 
conjugué 2 (streptavidine/POD, coloré en 
jaune) réagit ensuite avec le conjugué 1.
S/A 
Après élimination des éléments non liés, 
l’activité enzymatique du conjugué 2 liée 
est mesurée (réaction colorée en bleu). 
La transformation enzymatique du 
chromogène est ensuite interrompue par 
l’addition de la solution d’arrêt POD 
(réaction colorée en jaune). L’intensité 
de la coloration est directement 
proportionnelle à la concentration 
antigénique de l’échantillon.
S/A
S/A 
2. Réactifs : 
Plaque Enzygnost® HBs Ag 5.0 : plaque de 
microtitration recouverte d’AC de mouton anti- 
AgHBs. 
Conjugué 1 (anti-HBs/Biotine) : anti-HBs 
monoclonal (de souris). Conjugué à la biotine, 
coloré en bleu. Agent de conservation (phénol : 
max. 1 g/l) 
Conjugué 2 (streptavidine/POD) : streptavidine 
conjugué à la peroxydase (POD). Coloré en jaune. 
Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l)
S/A 
Sérum de contrôle HBs Ag négatif : sérum 
humain, valeur de D.O. indicative : ≤ 0,150. 
Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l) 
Sérum de contrôle HBs Ag positif : sérum 
humain stabilisé.0, 4 ± 0,2 (standard du 
PEI {Paul-Ehrlich-Institut})), valeur de 
D.O. indicative : ≥ 0,7. Agent de 
conservation (phénol : max. 1 g/l).
S/A
S/A 
Préparation des réactifs : 
 Porter tous les réactifs et échantillons à +15/+25°C 
avant le début du test, sans sortir la plaque de son 
emballage. 
 Sortir du cadre les barrettes non utilisées dans le 
test, et les conserver pour un usage ultérieur. 
 Pour une plaque, diluer 20mL de solution de lavage 
POD avec l’eau distillée ou désionisée en complétant 
à 400 mL. 
 Pour une plaque, diluer 1 mL de chromogène TMB 
avec 10 mL de tampon/substrat TMB dans le flacon 
plastique vide inclus dans le coffret (solution 
d’emploi du chromogène) et la conserver dans le 
flacon fermé à l’abri de la lumière.
S/A 
Matériel nécessaire : 
Incubateur : bain marie couvert (+37±1° 
C) ou méthode d’incubation équivalente. 
Pipettes : pipettes 
à embout de 25, 
100 et 1000μL.
S/A 
Laveur 
Lecteur de plaques "Elisa" 
Incubateur
S/A 
3. Echantillons à tester : 
Utiliser des échantillons (sérum humains 
ou plasmas citrates, héparines ou 
prélevés sur EDTA) obtenus selon les 
techniques standard des laboratoires. 
Les échantillons peuvent être conservés 
3 jours maximum à +2/+8°C. 
Pour une conservation plus longue, les 
congeler.
S/A 
4. Réalisation du test 
Distribution des contrôles et échantillons : 
distribuer dans 3 cupules (A1 à C1) 100 μL 
de sérum de contrôle négatif, dans 1 cupule 
(D1) 100μL de sérum de contrôle positif, 
dans les cupules suivantes 100μL de chacun 
des échantillons non dilués, puis en fin de 
série ou en fin de plaque de nouveau 100μL 
de sérum de contrôle positif. 
Les pipetages doivent être enchaînés, et ne 
pas durer plus de 30min par plaque.
S/A 
Enchaîner la distribution du conjugué 1 
immédiatement après celle des 
échantillons. 
Distribution de conjugué 1 : distribuer 
dans chaque cupule 25 μL de conjugué 1 
(anti-HBs/Biotine). Couvrir ensuite d’une 
feuille adhésive et placer la plaque dans 
l’incubateur immédiatement après la 
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S/A 
Incubation : laisser incuber 60 ± 2min à 
37 ± 1° C, et enchaîner immédiatement 
le processus de lavage.
S/A 
Lavage : retirer la feuille adhésive, 
aspirer le contenu de toutes les cupules, 
et distribuer dans chacune d’elles 
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S/A 
Distribution du conjugué 2 : ajouter dans 
chaque cupule 100μL du conjugué 2 
(streptavidine/POD), couvrir d’une 
nouvelle feuille adhésive, et placer 
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Incubation : laisser incuber 30 ± 2min 
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processus de lavage.
S/A 
Lavage : retirer la feuille adhésive,Répéter 
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Incubation du substrat : laisser incuber 30 
± 2min à +15/+25° C, à l’abri de la lumière.
S/A 
Arrêt de la réaction : retirer la feuille 
adhésive et ajouter dans chaque cupule 
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S/A 
Mesure : faire une mesure 
photométrique dans l’heure qui suit à 
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doit être de 650 nm (éventuellement 
comprise entre 615 et 690 nm).
S/A 
5. Validation du test : 
Calculer les valeurs moyennes des 
sérums de contrôle à partir des 
différentes valeurs mesurées si : 
0,010 ≤ DO.neg ≤ 0,150 
DO .POS ≥ 0 ,700 
Sur les 3 valeurs mesurées du sérum 
de contrôle négatif, une valeur sortant du 
domaine indiqué peut être négligée.
S/A 
Pour le sérum de contrôle positif, les 
deux valeurs obtenues doivent se 
trouver dans le domaine indiqué. 
Si ces critères ne sont pas remplis, le 
test doit être recommencé.
S/A 
Calculer la valeur moyenne des DO du 
sérum de contrôle négatif. 
A cette valeur moyenne, ajouter 0,050 
pour obtenir la valeur-seuil : 
 Moyenne D.Oneg + 0,050 = valeur-seuil 
(cut off)
S/A 
6. Résultats du test 
D.O échantillon < cut off = négatif 
D.O échantillon ≥ cut off = positif 
Les échantillons dont la valeur est 
trouvée ≥ à la V.S doivent être retestés 
en double.
S/A 
Si les deux valeurs de densités 
obtenues dans le deuxième test sont 
trouvées inferieures à la V.S, 
l’échantillon doit être considéré comme 
négatif.
S/A 
Si au moins une des deux valeurs 
obtenues dans le deuxième test est 
trouvée à nouveau ≥ à la V.S, l’échantillon 
doit être considéré comme 
provisoirement positif et doit être 
confirmé par un test de confirmation.
S/A 
Antigène HBS « test de 
confirmation »
S/A 
1. Principe : 
L’échantillon à analyser est incubé avec 
des antiHBS (humain) « R1 », pour la 
comparaison on reprend le même 
échantillon avec du sérum contrôle 
négatif (exempt d’anticorps 
antiHBS) « R2 ». 
Les anticorps en excès saturent tous les 
déterminants antigéniques de l’antigène 
HBS présent dans l’échantillon.
S/A 
Un test de dépistage réalisé ensuite 
indique qu’il n y a plus d’antigène HBS, 
l’échantillon mélangé avec le sérum de 
contrôle « R2 » est positif. 
Lorsque la réaction est non spécifique, 
on obtient même après addition d’anti 
HBS « R1 » une réaction positive.
S/A 
2. Réactifs : 
o antiHBS humain stabilisé « R1 » 
o sérum de contrôle humain exempt 
d’anticorps antiHBS « R 2 » 
tous les réactifs utilisés dans le test de 
dépistage
S/A 
Remarque : les échantillons qui ont 
présenté lors du test de dépistage des 
D.O ≥ au sérum de contrôle positif 
doivent êtres dilués au préalable au 1/10 
ou au 1/100 avec une solution saline 
isotonique.
S/A 
3. Mode opératoire : 
Dans deux tubes, mélanger respectivement : 
Tube 1 Tube 2 
échantillon 200 μl 200 μl 
Réactif « 1 » 50μl ----- 
Réactif « 2 » ------ 50μl 
Traiter le contrôle positif comme échantillon. 
-- Incuber 1 heure entre 37et 40 ° C. 
-- Utiliser les échantillons ainsi traités dans un test de 
dépistage en incluant les témoins positifs et témoins négatifs.
S/A 
4. Analyse des résultats : 
Analyse visuelle : placer le portoir sur 
fond blanc. 
Le témoin positif non traité orange-jaune. 
Le témoin négatif incolore. 
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avoir une coloration nettement plus faible 
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Dépistage de l'antigène hbs

  • 1. S/A Le dépistage de l’antigène HBs (Par méthode ELISA) LL S / Abdessemed
  • 2. S/A Intérêt diagnostique : Une hépatite virale de type B est le plus souvent accompagnée de l’apparition de l’antigène de surface du virus de l’hépatite B dans le sérum. En règle générale, l’AgHBs peut être mis en évidence dans le sérum dès 2 à 3 semaines avant le début de la maladie, et atteint son point culminant au moment de l’apparition des symptômes caractéristique (ictère, modification de la concentration des enzymes spécifiques du foie).
  • 3. S/A On observe ensuite généralement une lente élimination de l’antigène. Chez un certain nombre de sujets, et chez un pourcentage inconnu de personnes ayant été infectées par le virus de l’hépatite B de façon subclinique, l’antigène peut rester mesurable dans le sérum pendant des années, voire à vie.
  • 4. S/A Dans la mesure où une transfusion de sang contenant de l’AgHBs a entraîné une hépatite B dans de nombreux cas, le principal intérêt de la mise en évidences de l’AgHBs réside dans le dépistage des dons de sang, afin de réduire la fréquence des hépatites B post-transfusionnelles. La détection de l’AgHBs est également utilisée pour le diagnostic des hépatites B aigues ou chroniques.
  • 5. S/A
  • 6. S/A
  • 7. stade Ag HBS Ag HBe Ac anti HBS Ac anti HBC Ac anti HBe Hépatite : Début S/A Etat Guérison ++ +/- - + + - - - +/- - ++ + - - + Hépatite chronique + + - + - Porteur sain + +/- - + -/+ Vaccination - - + - -
  • 8. S/A 1. Principe : Enzygnost ®HBs Ag est un test immunoenzymatique basé sur une réaction en deux étapes : l’Ag HBs contenu dans l’échantillon à tester réagit tout d’abord simultanément d’une part avec les anticorps anti-HBs polyclonaux fixés à la surface des cupules de plaque de microtitration, et d’autre part avec le conjugué 1 (anti- HBs/Biotine, coloré en bleu). Après élimination des éléments non liés, le conjugué 2 (streptavidine/POD, coloré en jaune) réagit ensuite avec le conjugué 1.
  • 9. S/A Après élimination des éléments non liés, l’activité enzymatique du conjugué 2 liée est mesurée (réaction colorée en bleu). La transformation enzymatique du chromogène est ensuite interrompue par l’addition de la solution d’arrêt POD (réaction colorée en jaune). L’intensité de la coloration est directement proportionnelle à la concentration antigénique de l’échantillon.
  • 10. S/A
  • 11. S/A 2. Réactifs : Plaque Enzygnost® HBs Ag 5.0 : plaque de microtitration recouverte d’AC de mouton anti- AgHBs. Conjugué 1 (anti-HBs/Biotine) : anti-HBs monoclonal (de souris). Conjugué à la biotine, coloré en bleu. Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l) Conjugué 2 (streptavidine/POD) : streptavidine conjugué à la peroxydase (POD). Coloré en jaune. Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l)
  • 12. S/A Sérum de contrôle HBs Ag négatif : sérum humain, valeur de D.O. indicative : ≤ 0,150. Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l) Sérum de contrôle HBs Ag positif : sérum humain stabilisé.0, 4 ± 0,2 (standard du PEI {Paul-Ehrlich-Institut})), valeur de D.O. indicative : ≥ 0,7. Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l).
  • 13. S/A
  • 14. S/A Préparation des réactifs :  Porter tous les réactifs et échantillons à +15/+25°C avant le début du test, sans sortir la plaque de son emballage.  Sortir du cadre les barrettes non utilisées dans le test, et les conserver pour un usage ultérieur.  Pour une plaque, diluer 20mL de solution de lavage POD avec l’eau distillée ou désionisée en complétant à 400 mL.  Pour une plaque, diluer 1 mL de chromogène TMB avec 10 mL de tampon/substrat TMB dans le flacon plastique vide inclus dans le coffret (solution d’emploi du chromogène) et la conserver dans le flacon fermé à l’abri de la lumière.
  • 15. S/A Matériel nécessaire : Incubateur : bain marie couvert (+37±1° C) ou méthode d’incubation équivalente. Pipettes : pipettes à embout de 25, 100 et 1000μL.
  • 16. S/A Laveur Lecteur de plaques "Elisa" Incubateur
  • 17. S/A 3. Echantillons à tester : Utiliser des échantillons (sérum humains ou plasmas citrates, héparines ou prélevés sur EDTA) obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être conservés 3 jours maximum à +2/+8°C. Pour une conservation plus longue, les congeler.
  • 18. S/A 4. Réalisation du test Distribution des contrôles et échantillons : distribuer dans 3 cupules (A1 à C1) 100 μL de sérum de contrôle négatif, dans 1 cupule (D1) 100μL de sérum de contrôle positif, dans les cupules suivantes 100μL de chacun des échantillons non dilués, puis en fin de série ou en fin de plaque de nouveau 100μL de sérum de contrôle positif. Les pipetages doivent être enchaînés, et ne pas durer plus de 30min par plaque.
  • 19. S/A Enchaîner la distribution du conjugué 1 immédiatement après celle des échantillons. Distribution de conjugué 1 : distribuer dans chaque cupule 25 μL de conjugué 1 (anti-HBs/Biotine). Couvrir ensuite d’une feuille adhésive et placer la plaque dans l’incubateur immédiatement après la distribution du conjugué.
  • 20. S/A Incubation : laisser incuber 60 ± 2min à 37 ± 1° C, et enchaîner immédiatement le processus de lavage.
  • 21. S/A Lavage : retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et distribuer dans chacune d’elles environ. 0,3 ml de solution de lavage. Répéter 4 fois l’opération, en respectant un temps de contact de 10sec. Dès la fin de processus de lavage, distribuer immédiatement le conjugué 2 afin d’éviter tout desséchement.
  • 22. S/A Distribution du conjugué 2 : ajouter dans chaque cupule 100μL du conjugué 2 (streptavidine/POD), couvrir d’une nouvelle feuille adhésive, et placer immédiatement la plaque dans l’incubateur. Incubation : laisser incuber 30 ± 2min à37 ± 1°C, et enchaîner immédiatement le processus de lavage.
  • 23. S/A Lavage : retirer la feuille adhésive,Répéter 4 fois l’opération. Dès la fin de processus de lavage, distribuer immédiatement le substrat. Distribution du substrat : distribuer dans chaque cupule 75μL de solution d’emploi du chromogène, puis couvrir la plaque d’une nouvelle feuille adhésive. Incubation du substrat : laisser incuber 30 ± 2min à +15/+25° C, à l’abri de la lumière.
  • 24. S/A Arrêt de la réaction : retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 75μL de solution d’arrêt POD en respectant le même rythme
  • 25. S/A Mesure : faire une mesure photométrique dans l’heure qui suit à 450nm. La longueur d’onde de référence doit être de 650 nm (éventuellement comprise entre 615 et 690 nm).
  • 26. S/A 5. Validation du test : Calculer les valeurs moyennes des sérums de contrôle à partir des différentes valeurs mesurées si : 0,010 ≤ DO.neg ≤ 0,150 DO .POS ≥ 0 ,700 Sur les 3 valeurs mesurées du sérum de contrôle négatif, une valeur sortant du domaine indiqué peut être négligée.
  • 27. S/A Pour le sérum de contrôle positif, les deux valeurs obtenues doivent se trouver dans le domaine indiqué. Si ces critères ne sont pas remplis, le test doit être recommencé.
  • 28. S/A Calculer la valeur moyenne des DO du sérum de contrôle négatif. A cette valeur moyenne, ajouter 0,050 pour obtenir la valeur-seuil :  Moyenne D.Oneg + 0,050 = valeur-seuil (cut off)
  • 29. S/A 6. Résultats du test D.O échantillon < cut off = négatif D.O échantillon ≥ cut off = positif Les échantillons dont la valeur est trouvée ≥ à la V.S doivent être retestés en double.
  • 30. S/A Si les deux valeurs de densités obtenues dans le deuxième test sont trouvées inferieures à la V.S, l’échantillon doit être considéré comme négatif.
  • 31. S/A Si au moins une des deux valeurs obtenues dans le deuxième test est trouvée à nouveau ≥ à la V.S, l’échantillon doit être considéré comme provisoirement positif et doit être confirmé par un test de confirmation.
  • 32. S/A Antigène HBS « test de confirmation »
  • 33. S/A 1. Principe : L’échantillon à analyser est incubé avec des antiHBS (humain) « R1 », pour la comparaison on reprend le même échantillon avec du sérum contrôle négatif (exempt d’anticorps antiHBS) « R2 ». Les anticorps en excès saturent tous les déterminants antigéniques de l’antigène HBS présent dans l’échantillon.
  • 34. S/A Un test de dépistage réalisé ensuite indique qu’il n y a plus d’antigène HBS, l’échantillon mélangé avec le sérum de contrôle « R2 » est positif. Lorsque la réaction est non spécifique, on obtient même après addition d’anti HBS « R1 » une réaction positive.
  • 35. S/A 2. Réactifs : o antiHBS humain stabilisé « R1 » o sérum de contrôle humain exempt d’anticorps antiHBS « R 2 » tous les réactifs utilisés dans le test de dépistage
  • 36. S/A Remarque : les échantillons qui ont présenté lors du test de dépistage des D.O ≥ au sérum de contrôle positif doivent êtres dilués au préalable au 1/10 ou au 1/100 avec une solution saline isotonique.
  • 37. S/A 3. Mode opératoire : Dans deux tubes, mélanger respectivement : Tube 1 Tube 2 échantillon 200 μl 200 μl Réactif « 1 » 50μl ----- Réactif « 2 » ------ 50μl Traiter le contrôle positif comme échantillon. -- Incuber 1 heure entre 37et 40 ° C. -- Utiliser les échantillons ainsi traités dans un test de dépistage en incluant les témoins positifs et témoins négatifs.
  • 38. S/A 4. Analyse des résultats : Analyse visuelle : placer le portoir sur fond blanc. Le témoin positif non traité orange-jaune. Le témoin négatif incolore. Le témoin positif traité par le « R1 » doit avoir une coloration nettement plus faible que le témoin positif mélangé au « R2 » sinon refaire le test.
  • 39. S/A