Le document présente une évaluation des tests de diagnostic rapide pour le paludisme, notamment à travers l'analyse des protéines histidine-rich (HRP-II) et lactate déshydrogénase (PLDH) ainsi que leur polymorphisme. Il souligne que la diversité génétique affecte la sensibilité des tests et propose le développement de tests optimisés pour différentes souches et régions. Enfin, il souligne l'importance d'améliorer les pratiques de laboratoire pour une meilleure gestion de l'épidémie de paludisme.

1. Raymond TABUE
Entomologiste Médical
PNLP Cameroun
Elisabeth RAVAOARISOA
Institut Pasteur de Madagascar
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
EVALUATION
par les FACILITATEURS

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3. Raymond TABUE
Entomologiste Médical
PNLP Cameroun
Elisabeth RAVAOARISOA
Institut Pasteur de Madagascar
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
EVALUATION
par les FACILITATEURS

4.  Du gène à la protéine
 Histidine Rich Protein II (HRP-II)
 Expression
 Séquence
 Plasmodium Lactate Deshydrogenase (pLDH)
 Expression
 Séquence
 Polymorphisme intra-spécifique de HRP-II
 Polymorphisme inter-spécifique de pLDH
 Conclusion
Mots clés: Gène, polymorphisme, HRP-II, pLDH, diagnostic, espèce
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5. Gène: Un gène est une séquence d‘Acide DésoxyriboNucléique
(ADN) qui spécifie la synthèse d'une chaîne de polypeptide
ADN ARNm Protéine
Transcription Traduction
Inactivation de la
protéine
Augmentation de
l’efficacité de la
protéine
ADN
Mutation
(Insertion,
Délétion,Substitution)
Phase de lecture respectéeDécalage de phase de lecture
Mutation silencieuse Mutation non silencieuse
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6.  Utilisation fréquente de HRP-II et pLDH en Test de Diagnostic
Rapide (TDR) du paludisme:
Immunocapture des antigènes circulants
Système anticorps capture- révélation
 TDR d’une grande utilité dans la prise en charge du paludisme
dans les zones rurales sans microscopie.
 Polymorphisme des antigènes cibles affecte la sensibilité des tests?
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7.  Expression (Howard J. 1986, Mayxay M. 2001) :
Spécifique de Plasmodium falciparum
Protéine abondante
Expression à tous les stades asexués
Demi-vie élevée (environ 10 jours)
 Séquence (N° accession Swiss-Prot: sp|P05227|HRP1_PLAFA ):
Poids moléculaire 72 Kda
35% Histidine, 40% Alanine et 12% Aspartate
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8.  Expression (Makler M.T. et al. 1998, Berwal R. et al. 2008):
Pan- spécifique
Enzyme abondante
Demi-vie courte (2,5 jours environ)
 Séquence
LDH présent chez l’homme
pLDH diffère de la LDH humaine: épitope unique, utilisation
cofacteur APAD (Pyridine Adénine Dinucléotide)
296-310 acides aminés selon l’espèce plasmodiale
Région C-terminale très conservée.
N d’accession Swiss-Prot
Q76NM3|Q76NM3_PLAF7 P. falciparum
Q6JH30|Q6JH30_PLAVI P. vivax
Q6JH31|Q6JH31_PLAMA P. malariae
Q6JH32|Q6JH32_9APIC P. ovale
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9. 27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009

10.  Evidence 1: Baker J. et al. 2005
Collecte de 75 échantillons provenant de 19 pays.
Extraction, amplification et génotypage, évaluation du nombre 14 séquences répétitives
de Pf HRP-II
Etude comparative avec les TDR actuels
Le nombre des répétitions affecte la sensibilité des tests basés avec
HRP-II
Diversité génétique varie d’une région à une autre
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11.  Evidence 2: Lee N. et al. 2006
46 échantillons provenant de 4 pays,
8 souches de P. falciparum
Evaluation de 4 anticorps
monoclonaux
Extraction d’antigène des isolats
(analyse par Dot et Western blot,
épitope mapping par ELISA)
Substitution au niveau des épitopes, diminution de la reconnaissance
des anticorps
La fréquence des épitopes diffère d’un pays à un autre
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12. F1:Séquence de réference FCCI/HN
F:Seuence des isolats P. falciparum
M:Sequence des isolats de P. .malariae
O1:Séquence des isolats de P. ovale
O2 et O3: Séquences des isolats de P. ovale
V: Séquence de la souche de référence de P. vivax
Y: Séquence de la souche de référence de P. berghei
C: Séquence de la souche de référence de P. chabaudi
Collection des 8 espèces
plasmodiales de part le monde
Extraction, amplification, Nested-
PCR et génotypage
Variabilité intra-spécifique n’affecte pas l’efficacité des TDR pan-spécifiques
 Evidence: Talman A. et al. 2007
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13. Polymorphisme HRP-II: faux-négatifs
 Criblage des régions conservées, épitopes universellement connus,
synthèse d’anticorps monoclonaux spécifiques à ces épitopes
 Ou utilisation d’anticorps monoclonaux qui ne sont pas affectés
par la variation génétique
 Combinaison des anticorps reconnaissant différents épitopes
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14.  pLDH très conservée et élimination rapide
Couplage avec HRP-II pour une meilleure sensibilité
 Développement d’une nouvelle génération de TDR basé sur
pLDH spécifique de P. vivax couplé avec pLDH spécifique de P.
falciparum
Fiabilité du diagnostic différentiel?
Epitope(s) cible(s)?
Zone géographique cible?
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15.  Il en ressort que le polymorphisme est l’un des facteurs
contribuant à la sensibilité des test, il est donc nécessaire de:
- Développer des tests de TDR sensibles à toutes les régions
- Améliorer la bonne stabilité des TDR à la température
- Améliorer les bonnes pratiques de laboratoire
 Avec le programme de lutte visant l’élimination du paludisme (P.
falciparum), il convient de:
- Développer des tests différentiels de P. vivax (meilleure
prise en charge, limitation des résistances et diminution du risque
de recrudescence à P. vivax )
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16.  Baker J. et al. Genetic diversity of P. falciparum Histidine Rich Protein –II
(PfHRP-II) and its effect on the performance of PfHRP-II based Rapid
Diagnostic Test. The Journal of infectious diseases 2005,192: 870-877.
 Berwal R. et al. Plasmodium falciparum: Enchanced soluble expression,
purification and biochemical characterization of lactate dehydrogenase.
Experimental Parasitology 2008, 120: 135-141.
 Howard J.R. et al. Secretion of a Malarial Histidine Rich Protein (PfHRP-II)
from P. falciparum infected erythrocytes. The Journal of Cell Biology 1986, 103: 1269-
1277.
 Makler M.T. et al. Lactate dehydrogenase and the diagnosis of malaria.
Parasitology Today 1998, 14: 376-377.
 Mayxay M. et al. Persistence of Plasmodium falciparum HRP-2 in successfully
treated acute falciparum malaria Transactions of The Royal Society Of Tropical Medicine
And Hygiene 2001, 9 5: 179-182.
 Lee N. et al. Effect of sequence variation in P. falciparum Histidine Rich Protein
II on binding of specific monoclonal antibodies: implication of Rapid Diagnostic
Tests for Malaria. Journal of Clinical Microbiology 2006, 2773-2778.
 Talman A.M. et al. Evaluation of the intra-and inter-specific genetic variability
of Plasmodium Lactate déhydrogenase. Malaria Journal 2007, 6: 140-146.
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17. 27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009