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Extrapolation des bioréacteurs
(Bioreactor scale-up)
Frank Delvigne
Gembloux Agro-Bio Tech – University of Liège
Unité de bio-industries
Passage des Déportés, 2
5030 Gembloux, Belgique
Agro-Bio Tech
Synopsis
1. Introduction
2. Caractérisation des hétérogénéités spatiales des bioréacteurs
3. Caractérisation de l’hétérogénéité des populations microbiennes
4. Application : production d’une protéine hétérologue chez E. coli
5. Influence du scale-up sur l’excrétion de protéines
1. Introduction
Schéma général de développement d’un bioprocédé microbien
Shaken bioreactors – lab-scale
Reactor dimension (D)
Stirred bioreactor – lab-scale
Stirred bioreactor – industrial
scale
- Epuration des eaux
- Biogaz
- Biocarburant
- Acides organiques
- Alcools
- Acides aminés
- Enzymes
- Polymères
- Arômes
- Antibiotiques
- Protéines recombinantes
Prix de
revient
Volume du
réacteur
Les procédures d’extrapolation seront différentes en fonction du produit visé
Intégration des gradients de concentration : exemple de l’épuration des eaux
Zones avec
limitation en
oxygène dissous
permettant la
dénitrification
Perte de contrôle des gradients de concentration : exemple d’une production fed-
batch
2. Caractérisation de l’hétérogénéité des bioréacteurs
Gradient de substrat dans les
procédés fed-batch
Enfors et al. [2001] Journal of
biotechnology
Gradient en oxygène dissous
dans les procédés aérobies
Schütze et al. [2006] 12th
European Conference on Mixing
Apparition de facteurs aléatoires
Caractérisation des gradients de concentration par modélisation numérique
Mécanique des fluides numériques
Demande importante en puissance de calcul et difficile à coupler avec la physiologie
microbienne
Approche scale-down
Comment reproduire à l’échelle du laboratoire les défauts d’écoulement des
bioréacteurs industriels ?
Zone de
l’agitateur
Boucle de
circulation
Zone d’ajout
Réacteur industriel
Réacteur SCALE-
DOWN
Zone non
mélangée
Réacteur
agité de
laboratoire
Zone d’ajout
Pompe
péristaltique
Time
Substrate
level Excess level
Limitation level
Starvation level
DO
probe
<
DO-
controlled
feed
Microbial cell 1
Microbial cell 2
Microbial cell 3
Réacteur scale-down à deux
compartiments
Circulation des cellules microbiennes dans les réacteurs scale-down
3. Caractérisation de l’hétérogénéité des populations
microbiennes
Exemple d’une culture pure de Bacillus subtilis dans des conditions
homogènes. Les cellules portent un double rapporteur vert/rouge. Les
cellules vertes montrent une croissance normale, les cellules rouges
montrent un réarrangement vers un état de compétence. Les cellules non
colorées sont des spores. Au sein d’une population dite clonale, les
systèmes rapporteurs permettent de mettre en évidence les mécanismes
de bistabilité.
Test LIVE/DEAD pour le suivi d’un procédé de production de bactéries lactiques
Double coloration
cFDA/PI
3.1. Méthodes permettant d’estimer l’hétérogénéité d’une population microbienne :
système rapporteur fluorescent
Différents variants sont disponibles pour le suivi simultané de plusieurs gènes
Pstress
Séquence
protéine fluo
Stimulus extracellulaire (S, O2, pH)
Transduction
Synthèse GFP
Source de bistabilité : fluctuations intrinsèques et extrinsèques
Schéma réactionnel type : activation d’un gène
Schéma réactionnel : Au niveau mathématique :
système d’équations différentielles
Temps de
génération : k8 =
log(2)/tg
Stimulus
Petit volume cellulaire, faible nombre de réactif : effet aléatoire des réactions
Phénotype 1
Phénotype 2
3.2. Méthodes de détection : cytométrie en flux
Laser
488nm
Forward
scatter
(FSC)
Side scatter (SSC)
Green fluorescence (FL1)
Yellow fluorescence (FL2)
Red fluorescence(FL3)
Cells
sample
4. Application : production d’une protéine hétérologue
chez Escherichia coli
Stirred bioreactor
VL = 1L to 10L ; ts = 10 min to 15 min
Recycle loop (plug-flow)
VL = 0,1L to 2L ; ts = 45s to 200s
Transduction
ARNm
GFP
ttranscription = 20-70s
ttranslation = 4min
Choix d’un promoteur de stress
Exemple pour E. coli : environ 4000 ORFs :
Ma et al. [2004] BMC Bioinformatics, 5:199
Promoteurs de stress gouvernant
l’induction/répression de
plusieurs centaines de gènes
(master regulator)
Exemple : rpoS réponse générale
au stress
Réseau d’interaction
Réseau d’interaction
avec classification
hierarchique
Contraintes liées au procédé :
- Eviter les excès de glucose (acétate) et les carences (phase stationnaire)
- Eviter les carences en oxygène dissous (lactate, formate,…)
→ Alimentation en mode fed-batch
• Au niveau industriel : perte partielle du contrôle du profil d’ajout en
glucose (apparition de gradients)
• Au niveau laboratoire (screening de souches microbienne) :aucun
contrôle
Time
Substrate
level
Oxygen
level
S Limitation level
<
Exponential/constant
feed
Batch Fed-batch
Well-
mixed
C-SDR
P-SDR
P-SDR
Global mixing
efficiency
Global mixing
efficiency
5. Influence du scale-up sur l’excrétion des protéines
METHODOLOGY
Pstress
GFP coding
sequence
Substrate limitation
Signal
transduction
GFP synthesis
Intracellular state
Extracellular state
Export
system
Extracellular GFP
Effet bénéfique des fluctuations environnementales : maintient de la viabilité
microbienne
Analyses effectuées par cytométrie en flux après coloration à l’iodure de propidum
Enfors et al. [2001] J. Biotech, 85, 175-185
Test de coloration à l’iodure de propidium
Global GFP production in chemostat mode
GFP leakage to the extracellular medium
GFP extracellulaire
Secretomic analysis of the impact of bioreactor performances
2-D gel electrophoresis performed on a fed-batch bioreactor (cell density around 40 g/L)
110 spots analyzed by MALDI-MS
Merci de votre attention
Pour plus d’informations :
- Delvigne et al. [2011] Biochem. Eng. J., 55, 131-139
- Delvigne et al. [2011] Biotech. J., 8, 968-978

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  • 1. Extrapolation des bioréacteurs (Bioreactor scale-up) Frank Delvigne Gembloux Agro-Bio Tech – University of Liège Unité de bio-industries Passage des Déportés, 2 5030 Gembloux, Belgique Agro-Bio Tech
  • 2. Synopsis 1. Introduction 2. Caractérisation des hétérogénéités spatiales des bioréacteurs 3. Caractérisation de l’hétérogénéité des populations microbiennes 4. Application : production d’une protéine hétérologue chez E. coli 5. Influence du scale-up sur l’excrétion de protéines
  • 3. 1. Introduction Schéma général de développement d’un bioprocédé microbien Shaken bioreactors – lab-scale Reactor dimension (D) Stirred bioreactor – lab-scale Stirred bioreactor – industrial scale
  • 4. - Epuration des eaux - Biogaz - Biocarburant - Acides organiques - Alcools - Acides aminés - Enzymes - Polymères - Arômes - Antibiotiques - Protéines recombinantes Prix de revient Volume du réacteur Les procédures d’extrapolation seront différentes en fonction du produit visé
  • 5. Intégration des gradients de concentration : exemple de l’épuration des eaux Zones avec limitation en oxygène dissous permettant la dénitrification
  • 6. Perte de contrôle des gradients de concentration : exemple d’une production fed- batch
  • 7. 2. Caractérisation de l’hétérogénéité des bioréacteurs Gradient de substrat dans les procédés fed-batch Enfors et al. [2001] Journal of biotechnology Gradient en oxygène dissous dans les procédés aérobies Schütze et al. [2006] 12th European Conference on Mixing
  • 8.
  • 10. Caractérisation des gradients de concentration par modélisation numérique Mécanique des fluides numériques Demande importante en puissance de calcul et difficile à coupler avec la physiologie microbienne
  • 11. Approche scale-down Comment reproduire à l’échelle du laboratoire les défauts d’écoulement des bioréacteurs industriels ? Zone de l’agitateur Boucle de circulation Zone d’ajout Réacteur industriel Réacteur SCALE- DOWN Zone non mélangée Réacteur agité de laboratoire Zone d’ajout Pompe péristaltique
  • 12. Time Substrate level Excess level Limitation level Starvation level DO probe < DO- controlled feed Microbial cell 1 Microbial cell 2 Microbial cell 3 Réacteur scale-down à deux compartiments Circulation des cellules microbiennes dans les réacteurs scale-down
  • 13. 3. Caractérisation de l’hétérogénéité des populations microbiennes Exemple d’une culture pure de Bacillus subtilis dans des conditions homogènes. Les cellules portent un double rapporteur vert/rouge. Les cellules vertes montrent une croissance normale, les cellules rouges montrent un réarrangement vers un état de compétence. Les cellules non colorées sont des spores. Au sein d’une population dite clonale, les systèmes rapporteurs permettent de mettre en évidence les mécanismes de bistabilité.
  • 14. Test LIVE/DEAD pour le suivi d’un procédé de production de bactéries lactiques Double coloration cFDA/PI
  • 15. 3.1. Méthodes permettant d’estimer l’hétérogénéité d’une population microbienne : système rapporteur fluorescent Différents variants sont disponibles pour le suivi simultané de plusieurs gènes Pstress Séquence protéine fluo Stimulus extracellulaire (S, O2, pH) Transduction Synthèse GFP
  • 16. Source de bistabilité : fluctuations intrinsèques et extrinsèques Schéma réactionnel type : activation d’un gène
  • 17. Schéma réactionnel : Au niveau mathématique : système d’équations différentielles Temps de génération : k8 = log(2)/tg Stimulus
  • 18. Petit volume cellulaire, faible nombre de réactif : effet aléatoire des réactions Phénotype 1 Phénotype 2
  • 19. 3.2. Méthodes de détection : cytométrie en flux Laser 488nm Forward scatter (FSC) Side scatter (SSC) Green fluorescence (FL1) Yellow fluorescence (FL2) Red fluorescence(FL3) Cells sample
  • 20. 4. Application : production d’une protéine hétérologue chez Escherichia coli Stirred bioreactor VL = 1L to 10L ; ts = 10 min to 15 min Recycle loop (plug-flow) VL = 0,1L to 2L ; ts = 45s to 200s Transduction ARNm GFP ttranscription = 20-70s ttranslation = 4min
  • 21. Choix d’un promoteur de stress Exemple pour E. coli : environ 4000 ORFs : Ma et al. [2004] BMC Bioinformatics, 5:199 Promoteurs de stress gouvernant l’induction/répression de plusieurs centaines de gènes (master regulator) Exemple : rpoS réponse générale au stress Réseau d’interaction Réseau d’interaction avec classification hierarchique
  • 22. Contraintes liées au procédé : - Eviter les excès de glucose (acétate) et les carences (phase stationnaire) - Eviter les carences en oxygène dissous (lactate, formate,…) → Alimentation en mode fed-batch • Au niveau industriel : perte partielle du contrôle du profil d’ajout en glucose (apparition de gradients) • Au niveau laboratoire (screening de souches microbienne) :aucun contrôle Time Substrate level Oxygen level S Limitation level < Exponential/constant feed
  • 25.
  • 26. 5. Influence du scale-up sur l’excrétion des protéines METHODOLOGY Pstress GFP coding sequence Substrate limitation Signal transduction GFP synthesis Intracellular state Extracellular state Export system Extracellular GFP
  • 27. Effet bénéfique des fluctuations environnementales : maintient de la viabilité microbienne Analyses effectuées par cytométrie en flux après coloration à l’iodure de propidum Enfors et al. [2001] J. Biotech, 85, 175-185
  • 28. Test de coloration à l’iodure de propidium
  • 29. Global GFP production in chemostat mode GFP leakage to the extracellular medium
  • 31. Secretomic analysis of the impact of bioreactor performances 2-D gel electrophoresis performed on a fed-batch bioreactor (cell density around 40 g/L) 110 spots analyzed by MALDI-MS
  • 32. Merci de votre attention Pour plus d’informations : - Delvigne et al. [2011] Biochem. Eng. J., 55, 131-139 - Delvigne et al. [2011] Biotech. J., 8, 968-978