immuno

1. Techniques
d’immunofluorescence

2. Plan:
I. Aspects fondamentaux:
1-Phénomène de la fluorescence.
2-Fluorochromes.
3-Microscope équipé pour la fluorescence.
4-Système immunologique.
5-Problèmes posés par l’interprétation de l’immunofluorescence.
II. Méthodes:
1-Immunofluorescence sur frottis ou sur coupe.
Immunofluorescence directe.
Immunofluorescence indirecte.
III. Applications:
1-Autoimmunité.
2-Microbiologie.
3-Immunocytochimie.

3. I. ASPECTS FONDAMENTAUX

4.  1. Phénomène de fluorescence
- 1944: Albert Coons
les anticorps pouvaient être marqués par des molécules qui ont la
propriété d’êtres fluorescentes, appelées Fluorophores ou
Fluorochromes.
Elles absorbent la lumière d’une certaine longueur d’onde
(excitation) et émettent de la lumière d’une autre longueur d’onde
(émission).
• La fluorescence est un phénomène physique caractérisé par
l’émission d’une lumière de plus faible énergie que celle absorbée.
• La molécule excitée retourne à son état de repos , en passant par un
état intermédiaire.

5. Chaque corps fluorescent possède 3 caractéristiques:
o Spectre d’excitation:
Seuls certains rayonnements de quantum d’énergie précis sont absorbés.
Etat de base Etat excité
Energie
o Spectre d’émission:
Le retour de l’état intermédiaire à l’état de base s’accompagne de l’émission de
photon de lumière particulière pour chaque corps fluorescent.
o Rendement quantique:
Le rapport entre le nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés.

6. 1.2 Conditions expérimentales permettant de rechercher une
intensité de fluorescence maximale:
- Source d’excitation: utilisation de lampes puissantes.
- Concentration du fluorochrome: l’intensité de la
fluorescence augmente avec la concentration du
fluorochrome.
- Facteurs environnants: pH…

7. 2. Fluorchromes:
* Caractéristiques:
- Spectre d’émission dans le visible.
- Rendement quantique élevé.
- Fluorescence aisément différenciable de l’auto-fluorescence des
tissus.
2.1. Dérivés de la fluorescéine:
-Spectre d’absorption comprenant 3 bandes principales:
*A à 490 nm
*B à 320 nm
*C à 280 nm
-Spectre d’émission, situé dans le visible:
* 520 nm donnant une couleur verte.

8. En pratique on utilise l’isothiocyanate de fluorescéine(FTIC),possédant
une solubilité suffisante dans l’eau pour permettre la conjugaison sans
solvant organique.
 FIGURE 1: Spectre d’absorption
et d’emission.
 FIGURE 2
Spectre d’émission bandes a,b,c situées dans le
visible vers 520 donnant une couleur verte.
490nm (filtre interférentiels)
520nm

9. 2.2 Dérivés de la rhodamine:
-Employée surtout dans le double marquage.
-Spectre d’adsorption comportant trois bandes.
-Spectre d’émission situé dans le jaune et le rouge lointain
(fluorescence rouge orangée).
-En pratique, on utilise le chlorure de l’acide sulfonique de la lissamine
rhodamine (RB200).

10.  FIGURE 3: Spectre d’absorption
et d’ émission.
Figure .4.
Conjugaison du chlorure de acide
sulfonique de la lissamine rhodamin
(RB 200) et du réactif immunologique
protéinique (NH2protéme).
Spectre d’émission bandes sont situées dans
le jaune et le rouge lointain 620 donnant une
fluorescence rouge orangée.
490nm (filtre interférentiels)
520nm
620nm

11. - La microscopie équipée pour la fluorescence à lumière
transmise :
les rayons lumineux suivent le trajet habituel des rayons lumineux d’un microscope ordinaire
en traversant successivement :
La préparation puis le microscope de bas en haut.
-La microscopie pour la fluorescence réfléchie:
Les rayons de la source lumineuse pénètrent dans le microscope entre l’oculaire et l’objectif
Ils se dirigent ensuite vers le bas pour atteindre la préparation . De là ils se réfléchissent à
180° pour se diriger vers le haut à travers le microscope.
Le rayonnement de la source lum est filtré en longueur d’onde par le filtre d’excitation qui
conserve une bande étroite du spectre lumineux. Ce faisceau est dévié vers l’échantillon par
un miroir dichroïque qui possède un fort coefficient de réflexion pour cette fenêtre de
longueur d’onde et un fort coefficient de transmission pour la bande qui correspond au
rayonnement fluorescent émis par l’échantillon.

12. 3 . Microscope équipé pour la fluorescence:
Figure 5. Principe du microscope à fluorescence

13. 3.1 Sources lumineuses:
LAMPES À VAPEUR D’HALOGÈNE
 60 W ou 100W.
 Prix modéré.
 Longue durée d’utilisation.
 Possibilité d’allumer et
d’éteindre à tout moment la
lampe.
LAMPE À VAPEUR DE MERCURE
 50W-100W-200W.
 Prix relativement élevé.
 Durée de vie:200h.
 Diminution de la durée de vie de
50% pour des allumages ttes les
20 min.
 La lampe ne doit pas être remise en
marche immédiatement sans risque
après extinction.
 Elle ne doit pas être éteinte
pendant les 15 premières min.
 Une lampe ayant dépassée son
temps d’utilisation a beaucoup plus
de risque d’éclater.

14. 3.2 Filtres et miroirs
 Filtres d’excitation ou primaires:
- placés entre la source lumineuse et la préparation laissant passer que
les longueurs d’ondes de la lumière excitante.
 Filtres d’arrêt ou secondaires:
- Placés entre la préparation est l’observateur , retirant les radiations
d’excitation non absorbées par l’objet.

15. 4.Système immunologique:
Matériel:
• Frottis de microorganisme ou de
cellules.
• Suspension de cellules vivantes.
• Coupes d’organe(enrobement dans la
paraffine-congélation et section au
cryostat –lyophilisation)
Fixateurs:
• Éthanol 95%.
• Méthanol95%.
• Acétone.
• Formaldéhyde 1 à 4%.
• Acide acétique à 5% dans l’éthanol
absolu à -20°.
4.1 Préparation de l’antigène
Pour l’isothiocyanate de
fluorescéine:
• pH:9,5.
• [Ig]: 20mg/ml.
• Quantité fluorochrome:
20mg/1 g d’Ig
(4molecules de fluorochrome en
moyenne pour 1 molécule d’IgG).
• Temps d’incubation:3h à T° du
laboratoire, dans l’obscurité.
• Ramener le pH à 7.2 pour arrêter la
réaction.
4.2 Conjugaison au fluorochrome

16. 5. Problèmes poses à l’interprétation
 Auto-fluorescence bleue-verte des tissus.( filtre adéquat)
 Récepteur pour le fragment Fc des Ig. / F(ab’)2
 Présence de facteurs rhumatoïdes.
 Présence d’autres anticorps.
Réactions faussement
positives

17. Réactions faussement
négatives
•Phénomène de zone ou de compétition.

18. II-Méthodes

19. Immunofluorescence sur frottis ou sur coupe
Immunofluorescence directe Immunofluorescence indirecte

20. 1.Immunofluorescence directe( IFD):
Mise en évidence de l’antigène
• Marquage des AC spécifiques de chaque Ag
.
Avantages:
•une seule réaction est effectuée.
• le contrôle de spécificité est plus simple.
Applications :
•Identifier un germe.
•Analyser dans une biopsie tissulaire les dépôts
d’immunoglobulines et de complément.
•Le phénotypage des populations lymphocytaires
Bet T.

21. •Dans ce cas on recherche sur le même
frottis ou la même coupes deux antigènes
différents .
•On utilise alors deux réactifs différents:
-un anticorps contre le premier antigène
marqué à la fluorescéine.
-un anticorps marque à la rhodamine.
•Les deux conjuguais peuvent être ajoutés
successivement ou ensemble.
Double marquage

22. 2.Immunofluorescence indirecte:
 La fixation de l’anticorps primaire non marque
spécifique de l’antigène recherché, est révélée
grâce à une anti globuline fluorescente.
Les antiglobulines proviennent d’un mélange de
sérums obtenus après immunisation d’animaux
avec les γglobulines d’origine humaine.
Avantages:
•Plus grande sensibilité que la méthode directe (4
à 10 fois supérieure).
•Car de multiples molécules de fluorochrome se
lient à chaque molécule d’anticorps primaires.( le
1er
AC sert ici d’antigène avec plusieursc sites
antigéniques)

23. Mise en évidence de l’antigène
Mise en évidence de
l’anticorps dans les tissus
2.Immunofluorescence indirecte (IFI):
Mise en évidence de
l’anticorps dans le sérum
•Il est nécessaire que la molécule antigénique ait plusieurs
épitopes.
•On fait agir d’abord sur la coupe l’antigène.
•Lavage .
•L’anticorps de même spécificité marqué est ajouté dans un
second temps.
« Sandwich »
•Exceptionnelle.

24. Mise en évidence de l’antigène
Mise en évidence de
l’anticorps dans les tissus
2.Immunofluorescence indirecte (IFI):
Mise en évidence de
l’anticorps dans le sérum
•Permet la mise en évidence des anticorps dans le sérum humain vis-à-vis
de microorganisme ou des auto anticorps.
•Simple.
•Sensible.
•La qualité des résultats provient de la valeur de l’antiglobuline fluorescente.

25. Mise en évidence de l’antigène
Mise en évidence de
l’anticorps dans les tissus
2.Immunofluorescence indirecte (IFI):
Mise en évidence de
l’anticorps dans le sérum
•Autre approche indirecte : utilisant un 2ème
AC anti-isotype conjugué à la
biotine puis une avidine conjuguée à un fluochrome , protéine qui se lie à la
biotine avec une affinité extrêmement élevée.
•Recherche d’AC pour les MAI.
• Deux avantages: - l’AC primaire n’a pas besoin d’être conjugué à un
fluorochrome
-Evite la perte d’AC qui survient habituellement lors de la
Rx de conjuguaison.
•Sensible.

26. III. APPLICATIONS:

27.  1.Autoimmunité:
•L’immunofluorescence indirecte permet la détection d’auto- anticorps avec les
avantages suivants:
-Facilité d’exécution.
-Bonne sensibilité.
-détection de plusieurs anticorps à la fois.
Le choix du substrat dépend: - type d’auto-Ac recherché
- Distribution et richesse des
Ag
correspondants
•L’immunofluorescence indirecte, sur frottis cellulaire ou coupe d’organe est la
méthode de routine la plus utilisée pour dépister de nombreux anticorps.

28. • La dilution initiale du sérum est fonction du type d’auto-AC recherché
• On choisira pour chaque type d’auto-AC la dilution initiale du sérum à
partir de laquelle les titres des auto-AC deviennent cliniquement
significatifs.
- AAN: 1/80.
-AMA: anti-mito: 1/40.
-AEA: anti-endomysium: 1/10.
• Une fluorescence perceptible d’auto-AC est suivie d’une dilution du
sérum de ½ en ½ jusqu’à extinction de la fluorescence .
•Le titre de l’auto-Ac recherché correspond à l’inverse de la dernière
dilution donnant une fluorescence.

29. Anticorps antinucléaires
Anticorps anti-organites
intracytoplasmiques
Anticorps spécifiques
d’organes
Divers substrats peuvent être utilisés en raison de la non-spécificité d’organe
et d’éspece de la pluparts des anticorps anti-nucléaire,mais on se limite à:
• Cellules HEp2 cultivée sur lame.
• Trypanosomidés(Crithidia luciliae) pour détecter les anti-ADN double brin sur le
kinetoplaste.
Des anticorps anti-mitochondrie, anti-muscle lisse, anti-microsome de foie et
de rein sont simultanément décelable si on teste le sérum sur des coupes d’un bloc
associant foie, rein, et estomac de rat ou de souris.
L’aspect de la fluorecsence permet de reconnaitre divers types d’anticorps,
chacun particulier d’une maladie hépatique différente.
Les anticorps anti-muscle lisse peuvent être caractérisés comme anti-
cytosquelette sur des fibroblastes ou des cellules HEp2 cultivées en présence de
colchicine.
• Décelable sur de coupes d’organes.
• Les plus recherchés sont : anti-microsome de thyroïde
anti-microsome de cellules pariétales de
l’estomac.
anti-microsome de corticosurrénale.
anti-ilots de Langherhans.
anti-substance intercellulaire d’epithélium
malpighien
anti-muscle lisse.

30.  2.Microbiologie:
Identification d’un microorganisme
Recherche d’anticorps anti-
microorganisme
Bactériologie :
Immunofluorescence directe permet
l’identification des agents infectieux dans
tous les liquides biologiques:
-LCR: Klebsellia pneuminiae, etc..
-Gorge: Streptocoque A, B, C, G
-Prélèvement génitaux, urines, selles,
etc…
Immunofluorescence indirecte permet:
-La détection d’anticorps circulants .
-Evaluation de leurs taux.
-Détermination de leurs classe.
En pratique sont réalisés:
-Le sérodiagnostic de la toxoplasmose.
-La recherche d’anticorps anti-Tréponema
pallidum

31.  3.Immunocytochimie:
L’immunofluorescence permet :
-L’identification d’une substance biochimique:
Pour identifier les cellules productrices d’une substance donnée. Grace à la
production d’anticorps spécifiques vis-à-vis de cette substance , il est possible de montrer le
lieu de synthèse de celle-ci.
-la caractérisation des lésions anatomo-pathologiques:
L’immunofluorescence directe permet de déceler des dépôts d’immunoglobulines ou
de compléments dans les tissus.