ce cours s'adresse aux étudiants de graduation en médecine et pharmacie. il résume les techniques d'analyses sérologiques employés en parasitologie ainsi que les principales utilisations

1. APPLICATIONS DE
L’IMMUNOANALYSE EN
PARASITOLOGIE-MYCOLOGIE
T.DJERBOUA
PHARMACIEN MAITRE ASSISTANT EN MICROBIOLOGIE , UNITE BELLOUA-CHU TIZI-OUZOU.
ANNÉE UNIVERSITAIRE : 2015-2016
EMAIL :
DRTAOUFIK123@HOTMAIL.FR
UNIVERSITE MOULOU-MAAMERI DE TIZI-OUZOU
FACULTE DE MEDECINE
DEPARTEMENT DE PHARMACIE
COURS DE 3EME ANNEE PHARMACIE
MODULE DE PARASITOLOGIE

2. A LA UNE !
1.INTRODUCTION
2.OBJECTIFS PEDAGOGIQUES
3.INTERET DE LA QUESTION
4.PRINCIPES GENERAUX DES REACTIONS MIS EN JEUX
5.LES IMMUNODOSAGES PRIMAIRES (AVEC MARQUEUR) -) les
reactions immunoenzymatiques
6.LES IMMUNODOSAGES SECONDAIRES :
-les reactions d’immunoprécipitation
-les réactions d’agglutination

3. I.INTRODUCTION
Découvertes il y a 45 ans , les techniques d’immunoanalyse constituent des outils analytiques très performants a la
disposition du biologiste
elle permettent la DETECTION et / ou la QUANTIFICATION de très nombreuses molécules biologiques
Ces techniques ont pour base la réaction entre antigène et anticorps
Il en existe plusieurs types , ayant diverses indications , certains sont automatisables et font partie de la pratique de
routine du laboratoire de pathologies infectieuses
Dans le domaine de l’infectiologie , elle permettent aussi bien la recherche d’antigènes que d’anticorps

4. II.OBJECTIFS PEDAGOGIQUES
A l'issu du cours, l'étudiant sera capable de :
*Connaitre l’interet de l’application de l’immunoanalyse en parasitologie-mycologie
*connaitre les principes de bases , communes a toutes les méthodes d’immunoanalyse
*connaitre les différentes approches techniques , leurs avantages et inconvénients
*connaitre les pathologies parasitaires et mycosiques recherchés par immunoanalyse

5. III.INTERET DE LA QUESTION (INDICATIONS
APPORTER UN ARGUMENT A LA CLINIQUE
TOUTE SITUATION OU ON NE PEUT RETROUVER LE PARASITE LUI MEME
1) En phase de migration larvaire, le parasite immature effectue son cycle dans I'organisme et n'emet pas
encore d'oeufs (par exemple) la douve pendant 90 jours, I‘Ascaris et les bilharzies pendant 60 jours)
2) Devant une Iocalisation uniquement viscerale des parasite: il est tres traumatisant et, de plus, assez illusoire,
d'essayer de les retrouver dans les ponctions. C'est le cas, par exemple, des amibes dans I'amibiase hepatique ou
pulmonaire, ou du toxoplasme dans la toxoplasmose cérébrale ou encore de la larve de Taenia solium dans
la cysticercose
3) Au stade chronique d'affections ayant évolué vers une sequestration des parasites dans certains
organes, la ponction-biopsie est trop aléatoire (par exemple, Trichinella dans les muscles,Trypanosoma cruzi dans
le muscle cardiaque).
4) Dans les impasses parasitaires / Blocage a l’état larvaire chez l’homme: un parasite animal, sous forme
larvaire le plus souvent, et non adapte & I 'homme, migre au hasard : Larva migrans cutanee ou viscerale. Seule
cette dernière Localisation va provoquer la formation d'anticorps (par exemple, Toxocara canis ou ascaris de chien).
Dans le deuxième cas (arrêt au stade larvaire l’exemple type est le kyste hydatique dont la ponction est contre
indiquée,
5) Iorsque la charge parasitaire est faible ou Iorsque le parasitisme est intermittent (par exemple,paludisme en
dehors des acces, trypanosomose).

7. III.INTERET DE LA QUESTION
(INDICATIONS)APPORTER UNE AIDE A LA TECHNIQUE
sont utilises pour faciliter les techniques conventionnelles : Leishmaniose , Cryptosporidiose ,
amibiase, Paludisme …

8. IV.PRINCIPES GENERAUX DES REACTIONS
PRECIPITATION
AGGLUTINATION
IMMUNODOSAGE AVEC
MARQUEUR
ENZYME
FLUOROPHORE
RADIO-ISOTOPE
SUBSTANCE CHIMI-LUMINESCENTE
REACTION
DIRECTEMENT
VISUALISABLE
REACTION NON
VISUALISABLE

9. V.IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEUR
TERMINOLOGIE
3) Traceur (MARQUEUR) : molécule liée a
un antigène/anticorps de détection et donne
un signale mesurable (coloration,
fluorescence , radioactivité ,
chimiluminescence…)
1) Antigène/anticorps de capture :
represente la partie liée au support solide , il
permet de fixer l’élément recherché
2) Antigène/anticorps de detection : partie
portant le traceur et qui permet de reveller la
réaction de formation du complexe immun

10. V.IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEUR
PRINCIPES GENERAUX
IMMUNODOSAGE AVEC
MARQEUR
EN UN SEUL TEMP
(PHASE HOMOGENE)
EN PLUSIEURS TEMPS
+++
(PHASE HETEROGENE)
TYPE DE MARQUAGE
PAR EXES
D’ANTICORPS
(Sandwitch)
PAR DEFAUT
D’ANTICORPS
(COMPETITION)
NOMBRE
D’ETAPES
SHEMA
REACTIONNEL

11. V.IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEUR
TYPE DE MARQUAGE *RADIOACTIF : Iode 125 , H3, Co57 …
*FLUORESCENT: Fluoresceine , Rhodamine, Ions (Eu 3+, Sm 3+…)
*ENZYME: Peroxidase , Phosphatase , Glucose oxydase …
*SUBSTANCE CHIMI/BIOLUMINESCENTE:Luminole/H2O2,
Luciferine/luciferase
V.IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEUR

12. V.IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEUR
PAR DEFAUT DE
DETECTEUR
(COMPETITION)
Il s'agit de techniques dans lesquelles des
molécules marquées et non marquées (celle
recherches sensés être en excès) d'une
même espèce entrent en compétition vis-à-vis
d'un nombre limité de sites de liaison
appartenant à un réactif spécifique (anticorps le
plus souvent)
Etablissement d’un équilibre entre les espèces
réactionnelles et le nombre de sites de liaison
SITES DE
LIAISON
(capteur)
molecule
marquee
(traceur)
Molecule non
marquée (a
doser)

13. V.IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEUR
PAR DEFAUT
D’ANTICORPS
(COMPETITION)
Une fois l'équilibre atteint, le pourcentage de
marqueur lié est inversement proportionnel à
la concentration de substance non marquée que
l'on veut doser et qui a été ajoutée au milieu
réactionnel
APPLICABLE AUX ANTIGENES A 1 SEUL
EPITOPE!!!!!!

14. V.IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEUR
PAR EXES DE
DETECTEUR
Consiste a extraire l’analyte a l’aide d’un
molécule de capture (ou directement fixé sur un
support) en excès et de le révéler a l’aide d’une
molécule de détection en excès aussi
Les techniques « Sandwitch » sont de loin les
plus utilisées

15. V.IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEUR
PAR EXES DE
DETECTEUR
AVANTAGES :
*Amélioration de la sensibilite (Exes de detecteur)
*Amélioration de la spécificité (2 anticorps)
*Possibilité de purification d’un isotype d’Ig
particulier ou d’une fraction antigènique pariculière
(immunocapture)
*Combinable a d’autres techniques notamment de
séparation (ELIFA, ELIEDA…)

16. V.IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEUR
PAR EXES DE
DETECTEUR
INCONVENIENTS :
*pas de possibilité pour les antigènes a 1 seul
épitope
*effet crochet (quantité d’analyte+++)
*interference d’anticorps hétérophiles (ex facteur
rhumatoide)
*réactions croisées

17. V.LES REACTIONS IMMUNOENZYMATIQUES
METHODES ELISA
*LE MARQUEUR EST UNE ENZYME FIXEE SUR UN ANTIGENE OU UN
ANTICORPS
*PLUSIEURS TYPES D’ENZYMES SONT UTILISEES DANS LES TROUSSES
COMMERCIALES (peroxydase, Phosphatase…)
*nécessite une étape supplémentaire pour la
révélation de la réaction : addition du
substrat spécifique de l’enzyme (Coloration,
fluorescence …
Mesurable par spectrophotométrie
*cette technique peut être quantitative ou
qualitative et est totalement automatisable

18. V.LES REACTIONS IMMUNOENZYMATIQUES
METHODES ELISA
*La molecule de capture est fixée sur un
support solide (verre, plastic …)
*l’enzyme peut être directement liée au
détecteur ou indirectement (ex
Streptavidine-biotine)

19. V.LES REACTIONS IMMUNOENZYMATIQUES
METHODES ELISA
*LES VARIANTS :
DIRECTE : la molécule marquée réagit
Directement avec l’analyte (antigènes++)
INDIRECTE: la molécule marquée réagi
indirectement avec l’analyte (anticorps++)
=) étape supplémentaire

20. V.LES REACTIONS IMMUNOENZYMATIQUES
METHODES ELISA
*LES VARIANTS :
ELISA SANDWITCH : l’analyte est pris en
sandwitch entre le capteur et le marqueur
ELISA COMPETITION
ELISA COUPLEE A DES TECHNIQUES DE SEPARATION: notamment la
filtration (ELIFA) et l’immunoelectrodiffusion (ELIEDA)
Résultat
On obtient des indexes de fixation
Peut etre qualitatif , semi quantitatif ou quantitatif

21. V.LES REACTIONS IMMUNOENZYMATIQUES
METHODES ELISA
Avantages
 Lecture objective
 Automatisable
 Pas de compétition avec les IgG
 Absence d’interférence avec le facteur rhumatoïde
 Réactifs commercialisés
Inconvénients
 Matériel spécifique
 La recherche des antigènes dépend du stade de la maladie
 La recherche des anticorps dépend du type et de l’intégrité
de la réponse immunitaire
Quantification variable selon les modalités de calcul de l’index
de positivité (selon les laboratoires)

22. V.LES REACTIONS IMMUNOENZYMATIQUES
METHODES ELISA
Applications en parasitologie –mycologie (antigènes parasitaires et et anticorps
 Toxoplasmose congéniale
 Paludisme
 Leishmaniose
 Trypanosomiase
 Bilharziose
 Trichinellose
 Amibiase
 Filariose
 Hydatidose
 Syndrome de Larva Migrans
 Candidose profonde
 Cryptococcose
 Aspergillose invasive
 *Histoplasmose …

23. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
*la réaction de précipitation : complexes immuns
insolubles se forment en abondance.
*Elle permet de détecter un antigène, un anticorps,
ou d'analyser un mélange d'antigènes.
*L'utilisation d'un milieu gélifié (agarose
+++)permet de produire des gradients réguliers de
concentration d'antigène et d'anticorps, afin de
créer les conditions optimales de la précipitation
(contrairement au milieu liquide).
*La diffusion peut être accélérée par électrophorèse.
*Les complexes immuns sont emprisonnés dans les
mailles du gel et ne peuvent plus migrer, ils forment
des arcs ou lignes de précipitation.
THEORIE DE MARRACK (heteroplymeres insolubles
Ou réseau antigène-anticorps)

24. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
 LA COURBE DE PRECIPITATION

25. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
 LES REACTIONS QUALITATIVES
1) L’IMMUNODIFFUSION RADIALE
(OUCHTERLONY)
*Double diffusion Ag et Ac en fonction de
leur PM - permet l’analyse qualitative
d’un mélange d’Ag en solution
Dans des boîtes de Pétri recouvertes d'un gel d'agarose à 1 % (la concentration dépend de la
qualité de l'agarose), des puits sont creusés avec un emporte-pièce. L'antigène et l'anticorps sont
déposés dans les puits. Dans la zone de rencontre de l'antigène avec l'anticorps, il se forme un arc
de précipité au bout de 24 à 48 heures, visible avec un éclairage à fond noir ou en colorant les
protéines

26. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
 LES REACTIONS QUALITATIVES
1) L’IMMUNODIFFUSION RADIALE
(OUCHTERLONY)
La distance du précipité au puits est fonction de plusieurs paramètres :
 le carré de la distance du précipité au puits est proportionnel à la concentration du réactif,
l'antigène ou l'anticorps. Si un arc est collé au puits, il faudra diluer moins ce réactif;
 les grosses molécules diffusent moins vite, et l'arc sera proche du puits.
Dans un mélange antigénique complexe, cette méthode permet :
 de dénombrer le nombre d'antigènes. Chaque arc correspond à au moins un antigène

27. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
 LES REACTIONS QUALITATIVES
2) Immunoéléctrodiffusion ou
électrosynerese
Consiste a utiliser le courant d’endosmose
qui au court d’une éléctrophorese
provoque la migration des
gammaglobulines en direction de la
cathode (l’antigène migrant vers l’anode)
Il y a ainsi accélération de la précipitation

28. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
 LES REACTIONS QUALITATIVES
3) Immunoéléctrophorese (IEP)
Étape 1 :La/les fractions antigéniques
subissent une migraion éléctrophoretique
en fonction de leurs charge le long de
l’axe de migration
Étape 2 : diffusion passive a cet axe d’un
immusérum montera des arcs de
précipitation formé au points de rencontre
(Ag-Ac)

29. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
 LES REACTIONS QUALITATIVES
3) Immunoéléctrophorese (IEP)
Étape 1 :La/les fractions antigéniques
subissent une migraion éléctrophoretique
en fonction de leurs charge le long de
l’axe de migration
Étape 2 : diffusion passive a cet axe d’un
immusérum montera des arcs de
précipitation formé au points de rencontre
(Ag-Ac)

30. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
 Avantages et inconvenients
 1) Ouchterlony:
*execution rapide et comode , simple a realiser
*reproductible et économique
*assez spécifique
*interessante pour les études épidémiologiques
*les principaux inconvénients étant la durée (parfois plus de 3 jours) et le
manque de sensibilité

31. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
 Avantages et inconvenients
2)IED
*execution rapide et comode , simple a realiser
*reproductible et économique
*assez spécifique et assez sensible
*interessante pour les études épidémiologiques
*les principaux inconvénients étant l’utilisation de cuve d’éléctrophorese et le
delais

32. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
 Avantages et inconvenients
3) IEP
*bonne sensibilité et spécificité
*Arcs spécifiques majeurs et immunogènes (ex Arc 5 pour le kyste hydatique)
*reproductible et peu couteurse
*très interessante sur le plan diagnostic
*les principaux inconvénients sont la durée (très longue), l’utilisation de cuve
d’éléctrophorese , une grande quantité de sérum.
*non adaptée aux études épidémiologiques.

33. VI.LES REACTIONS DE PRECIPITATION
 APPLICATIONS
*Protozooses (Amibiase)
*Helminthiases (Kyste hydatique , Shistosomiase , Fasciolose…)
*Mycoses profondes (Aspergillose , Candidose…)
ATTENTION aux interference (infections , maladies auto-immunes , affections
malignes…)