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MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE
I- MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE

Microorganismes =
           - combien? Quel taux?
           - distribution?
           - diversité?
           - rôle fonctionnel?
           - contrôles?



       Méthodes de mesure
       standardisées, précises, répétables, sensibles
1- Echantillonnage

                                    Eau                    Sédiment

Accès                  direct, éloigné                 éloigné

Echantillonnage        filet, bouteille, filtre        pelle, carottier


Traitement             dilution, concentration         dilution



             - stériliser ou rincer
             - fixation (glutaraldéhyde, formaldéhyde)
             - stockage (4 ou - 20 ou - 80°C)
             - faire les analyses le + vite possible!!!!
Filet à plancton
                      (algues et protozoaires)




Bouteille de Niskin
Pelle à sédiment




Carottier
2. Activité enzymatique

               enzyme
    Substrat               produit

   Disparition du substrat
   Apparition du produit


           - Activité réelle
                  dynamique

           - Activité potentielle
                  Traceurs et marquage
                  - fluorescent, coloré
                  - isotopique stable ou radioactif
2.1- Dynamique                                               AUTOCLAVED
                                              150
                                                             Fe(II)




Quantifier substrats et produits              100




                                     Fe (II) uM
Au cours du temps
                                                  50




            Réduction de Fe (III)                  0
                                                       0   200           400     600   800
                                                                      time (h)


    Inhibiteurs ou compétiteurs
           nitrapyrine              NH4+ oxidase
           chlorate                 NO2- oxidase
           C2H2                     N2O réductases
2.2- Traceurs et marqueurs


 Ajout de substrat             devenir?

        - chromogène ou fluorogène

        - marquage isotopique


  Attention!!!
        Activité potentielle

     - Microcosmes (radioactifs, chromogène, fluorogène)

     - Nature (isotopes stables)
Substrat chromogène ou fluorogène
Colorimétrie
                                     Microplaque Biolog


                                        INT
                                              respiration

                                        INT-formazan




 Fluorimétrie

                                    Methylumbellyferone
                                    Amino-methylcoumarine
Marquage isotopique


      Même élément = différentes masses



    Carbon-12                Carbon-13          Carbon-14
                 electrons


                 neutrons


                 protons

     (6P + 6N)                (6P + 7N)           (6P + 8N)




           Isotopes stables               Isotopes radioactifs
Isotopes radioactifs

3H    [3H]-CH3                   Oxydation du méthane

14C   [14C]-CaCO3                photosynthèse

35S   [35S]-SO42-                Réduction des sulfates



      Particules β
                                                     Excitation

        Cocktail scintillant =                       solvant
                                            3H
        Solvant + émulsifiant + fluor

                                           cpm       fluor
Isotopes stables                    Fractionnement

    Soufre             32S, 33S, 34S, 35S




                           Isotope + léger                réagit + vite
Desulfovibrio spp.
                                      SO42-               H2S       enrichi en 32S
Desulfatomaculum spp.



     Rapport isotopique
                      34S/32S              – 34S/32Sstandard
                             échantillon
       δ34Sechantillon =                                       x 1000
                                34S/32S
                                       standard
Spectromètre de masse + GC

    Séparation et identification      Rapport masse/charge
    des isotopes

•    13C/12C = 0.011225
                                         ions
•    13C/12C = 0.011071

•    13C/12C = 0.010918



                             Bombardement e-




                                                Masse molaire
3- Biomasse


   Densité = nb de cellule par volume ou par surface

   Biomasse = mg de C par volume ou par surface


                                       fg C Cell-1
culture
      Escherichia coli                 109-323
bacterioplancton
      Antarctique                      7-13
2 Stratégies:


                            Comptage direct


                 DIRECT

                            Biomarqueurs

Quantité?


                 INDIRECT    culture
2.1. CULTURE EN MILIEU SOLIDE




             COMPTAGE des UFC
2.2. CULTURE LIQUIDE           Estimation statistique
 Nombre le plus probable (NPP)
                    1 ml dans 9 ml




                                 Table de Mac Grady (extrait)
                                               NPP
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
                                  3   2    0   9
  +   +    + -       -
  +    -   -    -    -            3   2    1   15
  +    +   -    -    -            3   2    2   21
  3    2   1   0     0

                     Bactéries/ml = 15/10-2 = 1500
2.3. COMPTAGE DIRECT


Hémocytomètre    Microscope         Eucaryotes
                 photonique

Electrolyte       Compteur de particules
                  = cytomètre de flux
Fluorescence
                  Microscope à
                  épifluorescence
Hémocytomètre



                Algues,
                champignons,
                protozoaires
Microscope à épifluorescence
                  Occulaire
                                   Filtre
                                   em.

Filtre
exc.
                      objectif


         excitation         emission



  Acridine orange, DAPI, Syber green
Hybridation
                    FISH




  Populations, groupes taxonomiques
Cytomètre de flux



                                 SSC = granularité
 Flux            Détecteur de
 d’échantillon   lumière
                                                     FSC = taille




                           SSC
Laser
                           FSC
488nm



  Dispersion et émission
2.4. BIOMARQUEURS

      ADN, ATP, chla, lipides, acide muramique….




DNA          1.6-5.7 fg / bactérie


ATP          1 fg / bactérie
Problèmes = état physiologique, tous les organismes vivants
LIPIDES         Membranes cytoplasmiques

                       Acides gras
                       phospholipidiques         Acides gras




        FAME = Fatty acid methyl ester
        PLFA = Phospholipid linked fatty acids


 1- Extraction avec des solvants
 2- Esterification
 3- chromatographie gazeuse
Groupes fonctionnels


               Champignons18:2w6
                                   Bactéries 18:1w7c


                                         cy19:0

         i15:0



                 a15:0                Actinomycètes 10Me 18:0
       i14:0




               Biomarqueurs = diversité + biomasse
ACIDES NUCLEIQUES                   -

 ARNm =
                                                          ADN
 gènes fonctionnels
                                                          ARNr 23S
                                                          ARNr 16S
                                                          ARNr 5S


 Extraction=                       +
        1- lyse (physique, chimique, enzymatique)
        2- extraction (phenol/chloroforme)
        3- purification
        4- précipitation (éthanol, iso-propanol)
  http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm
  http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html
PCR = Polymerase Chain Reaction
                                       Température ºC



                               dénaturation         94-96

                                                       1er cycle
                  amorces                      50-60
                               hybridation



+ dNTPs           polymérase   élongation
                                               72




                                                    94-96


                                                2e cycle
PCR en temps réel

                          Sonde TaqMan




        mesurer à chaque cycle d’amplification la quantité
        d’ADN par marquage fluorescent


                                log[ADN]=a(nombre de cycle)+b
[ADN]




           Nb de cycles
4- Diversité génétique       = Acides nucléiques




         ARNm = diversité phénotypique
         ADN = diversité génotypique

                   - Population
                   - Groupes fonctionnels
                   - Communauté



 PROFIL = code barre de l’espèce ou de la communauté
 SEQUENCE = succession de paires de base
Quel gène amplifier?


- ARN ribosomal              genres et espèces
        16S        ITS                23S


- Eléments répétés             espèces


- DNA gyrase (gyrA et gyrB)           espèces


- Gènes fonctionnels            groupes fonctionnels

     Ex. Nir K et Nir S codent des nitrites réductases
           dénitrification
Séparation par la TAILLE
Fragments de taille variable
                         ITS, éléments répétés, microsatellites
                                                Paires de bases
                  -                                1000

 Électrophorèse
                                                    500


  en cuve ou en
  capillaire
                  +                                 200


  Gel d’agarose ou d’acrylamide
  par LC (pair d’ions)
Fragments de même taille   ARNr 16S, gènes fonctionnels

   Couper avec une enzyme de restriction
         POPULATION



                                      A    B


                                                Souche


                                      RFLP
                                      (restriction fragment
                                      length polymorphism)
COMMUNAUTE             Trop de bandes
                                              *
                                                  Espèce A
amorce fluorescente*                          *
                                                  Espèce B

                             A    B     A+B       A+B

                                                    *
Gel d’acrylamide
(electrophorèse                                     *
capillaire)                      RFLP         tRFLP
Séparation par la COMPOSITION

 % bases G+C              DENATURATION
Électrophorèse sur gel d’acrylamide
            GC clamp      Amplicon


                             Gradient dénaturant chimique (DGGE)
                             ou
                             thermique (TGGE, TTGE)



                                  Élution à 65 ºC

            dHPLC
            pair d’ions
CONFORMATION = SSCP
 Single strand conformation polymorphism
                  Électrophorèse d’acrylamide
                  (gel ou capillaire)

ARNr 16S, gènes fonctionnels            Dans le gel à 20°C les simples
                                        brins se replient sur eux-mêmes

                                          A+B
Dénaturation (98°C-5 min)

2 simples brins
Analyse du profil = Diversité et structure


                      Richesse: nombre de phylotypes


                      chaque bande = 1 phylotype ou OTU



                      Structure: profil de bandes


       Similarité entre 2 communautés = similarité entre 2
       profils

   Composition? Quelles espèces?
Identification = séquençage
                        Analyse phylogénétique

Électrophorèse
ou dHPLC



                 Séquençage




   séparation des          Identification
   phylotypes
Séparer sans électrophorèse= clonage

restriction                           Plasmides   2 kb
              β-galactosidase
                                      Fosmides    40kb
                 vecteur
                                      Cosmides    40kb
              Résistance
                                      BAC         300 kb

                 ADN environnement
                                      YAC         >300 kb

                 vecteur


              ligation               sélection
Maxima cloaca (genoscope- Evry)
séquençage         ATGGCCTTAAAAGC

                   ATGGCCTTAAAAGC
                   ATGGCCTTAAAAG
                   ATGGCCTTAAAA
     PCR
                   ATGGCCTTAAA
                   ATGGCCTTAA
  Électrophorèse   ATGGCCTTA
  capillaire       ATGGCCTT
                   ATGGCCT         dNTPs
                   ATGGCC       fluorescents
                   ATGGC
                   ATGG           STOP!
                   ATG
                   AT
                   A
Hybridation
                  Puces à ADN




   ARNr 16S ou gènes fonctionnels
Attention!!!
Choix de la méthode
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  • 2. I- MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE Microorganismes = - combien? Quel taux? - distribution? - diversité? - rôle fonctionnel? - contrôles? Méthodes de mesure standardisées, précises, répétables, sensibles
  • 3. 1- Echantillonnage Eau Sédiment Accès direct, éloigné éloigné Echantillonnage filet, bouteille, filtre pelle, carottier Traitement dilution, concentration dilution - stériliser ou rincer - fixation (glutaraldéhyde, formaldéhyde) - stockage (4 ou - 20 ou - 80°C) - faire les analyses le + vite possible!!!!
  • 4. Filet à plancton (algues et protozoaires) Bouteille de Niskin
  • 6. 2. Activité enzymatique enzyme Substrat produit Disparition du substrat Apparition du produit - Activité réelle dynamique - Activité potentielle Traceurs et marquage - fluorescent, coloré - isotopique stable ou radioactif
  • 7. 2.1- Dynamique AUTOCLAVED 150 Fe(II) Quantifier substrats et produits 100 Fe (II) uM Au cours du temps 50 Réduction de Fe (III) 0 0 200 400 600 800 time (h) Inhibiteurs ou compétiteurs nitrapyrine NH4+ oxidase chlorate NO2- oxidase C2H2 N2O réductases
  • 8. 2.2- Traceurs et marqueurs Ajout de substrat devenir? - chromogène ou fluorogène - marquage isotopique Attention!!! Activité potentielle - Microcosmes (radioactifs, chromogène, fluorogène) - Nature (isotopes stables)
  • 9. Substrat chromogène ou fluorogène Colorimétrie Microplaque Biolog INT respiration INT-formazan Fluorimétrie Methylumbellyferone Amino-methylcoumarine
  • 10. Marquage isotopique Même élément = différentes masses Carbon-12 Carbon-13 Carbon-14 electrons neutrons protons (6P + 6N) (6P + 7N) (6P + 8N) Isotopes stables Isotopes radioactifs
  • 11. Isotopes radioactifs 3H [3H]-CH3 Oxydation du méthane 14C [14C]-CaCO3 photosynthèse 35S [35S]-SO42- Réduction des sulfates Particules β Excitation Cocktail scintillant = solvant 3H Solvant + émulsifiant + fluor cpm fluor
  • 12. Isotopes stables Fractionnement Soufre 32S, 33S, 34S, 35S Isotope + léger réagit + vite Desulfovibrio spp. SO42- H2S enrichi en 32S Desulfatomaculum spp. Rapport isotopique 34S/32S – 34S/32Sstandard échantillon δ34Sechantillon = x 1000 34S/32S standard
  • 13. Spectromètre de masse + GC Séparation et identification Rapport masse/charge des isotopes • 13C/12C = 0.011225 ions • 13C/12C = 0.011071 • 13C/12C = 0.010918 Bombardement e- Masse molaire
  • 14. 3- Biomasse Densité = nb de cellule par volume ou par surface Biomasse = mg de C par volume ou par surface fg C Cell-1 culture Escherichia coli 109-323 bacterioplancton Antarctique 7-13
  • 15. 2 Stratégies: Comptage direct DIRECT Biomarqueurs Quantité? INDIRECT culture
  • 16. 2.1. CULTURE EN MILIEU SOLIDE COMPTAGE des UFC
  • 17. 2.2. CULTURE LIQUIDE Estimation statistique Nombre le plus probable (NPP) 1 ml dans 9 ml Table de Mac Grady (extrait) NPP 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 3 2 0 9 + + + - - + - - - - 3 2 1 15 + + - - - 3 2 2 21 3 2 1 0 0 Bactéries/ml = 15/10-2 = 1500
  • 18. 2.3. COMPTAGE DIRECT Hémocytomètre Microscope Eucaryotes photonique Electrolyte Compteur de particules = cytomètre de flux Fluorescence Microscope à épifluorescence
  • 19. Hémocytomètre Algues, champignons, protozoaires
  • 20. Microscope à épifluorescence Occulaire Filtre em. Filtre exc. objectif excitation emission Acridine orange, DAPI, Syber green
  • 21. Hybridation FISH Populations, groupes taxonomiques
  • 22. Cytomètre de flux SSC = granularité Flux Détecteur de d’échantillon lumière FSC = taille SSC Laser FSC 488nm Dispersion et émission
  • 23. 2.4. BIOMARQUEURS ADN, ATP, chla, lipides, acide muramique…. DNA 1.6-5.7 fg / bactérie ATP 1 fg / bactérie Problèmes = état physiologique, tous les organismes vivants
  • 24. LIPIDES Membranes cytoplasmiques Acides gras phospholipidiques Acides gras FAME = Fatty acid methyl ester PLFA = Phospholipid linked fatty acids 1- Extraction avec des solvants 2- Esterification 3- chromatographie gazeuse
  • 25. Groupes fonctionnels Champignons18:2w6 Bactéries 18:1w7c cy19:0 i15:0 a15:0 Actinomycètes 10Me 18:0 i14:0 Biomarqueurs = diversité + biomasse
  • 26. ACIDES NUCLEIQUES - ARNm = ADN gènes fonctionnels ARNr 23S ARNr 16S ARNr 5S Extraction= + 1- lyse (physique, chimique, enzymatique) 2- extraction (phenol/chloroforme) 3- purification 4- précipitation (éthanol, iso-propanol) http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html
  • 27. PCR = Polymerase Chain Reaction Température ºC dénaturation 94-96 1er cycle amorces 50-60 hybridation + dNTPs polymérase élongation 72 94-96 2e cycle
  • 28. PCR en temps réel Sonde TaqMan mesurer à chaque cycle d’amplification la quantité d’ADN par marquage fluorescent log[ADN]=a(nombre de cycle)+b [ADN] Nb de cycles
  • 29. 4- Diversité génétique = Acides nucléiques ARNm = diversité phénotypique ADN = diversité génotypique - Population - Groupes fonctionnels - Communauté PROFIL = code barre de l’espèce ou de la communauté SEQUENCE = succession de paires de base
  • 30. Quel gène amplifier? - ARN ribosomal genres et espèces 16S ITS 23S - Eléments répétés espèces - DNA gyrase (gyrA et gyrB) espèces - Gènes fonctionnels groupes fonctionnels Ex. Nir K et Nir S codent des nitrites réductases dénitrification
  • 31. Séparation par la TAILLE Fragments de taille variable ITS, éléments répétés, microsatellites Paires de bases - 1000 Électrophorèse 500 en cuve ou en capillaire + 200 Gel d’agarose ou d’acrylamide par LC (pair d’ions)
  • 32. Fragments de même taille ARNr 16S, gènes fonctionnels Couper avec une enzyme de restriction POPULATION A B Souche RFLP (restriction fragment length polymorphism)
  • 33. COMMUNAUTE Trop de bandes * Espèce A amorce fluorescente* * Espèce B A B A+B A+B * Gel d’acrylamide (electrophorèse * capillaire) RFLP tRFLP
  • 34. Séparation par la COMPOSITION % bases G+C DENATURATION Électrophorèse sur gel d’acrylamide GC clamp Amplicon Gradient dénaturant chimique (DGGE) ou thermique (TGGE, TTGE) Élution à 65 ºC dHPLC pair d’ions
  • 35. CONFORMATION = SSCP Single strand conformation polymorphism Électrophorèse d’acrylamide (gel ou capillaire) ARNr 16S, gènes fonctionnels Dans le gel à 20°C les simples brins se replient sur eux-mêmes A+B Dénaturation (98°C-5 min) 2 simples brins
  • 36. Analyse du profil = Diversité et structure Richesse: nombre de phylotypes chaque bande = 1 phylotype ou OTU Structure: profil de bandes Similarité entre 2 communautés = similarité entre 2 profils Composition? Quelles espèces?
  • 37. Identification = séquençage Analyse phylogénétique Électrophorèse ou dHPLC Séquençage séparation des Identification phylotypes
  • 38. Séparer sans électrophorèse= clonage restriction Plasmides 2 kb β-galactosidase Fosmides 40kb vecteur Cosmides 40kb Résistance BAC 300 kb ADN environnement YAC >300 kb vecteur ligation sélection
  • 40. séquençage ATGGCCTTAAAAGC ATGGCCTTAAAAGC ATGGCCTTAAAAG ATGGCCTTAAAA PCR ATGGCCTTAAA ATGGCCTTAA Électrophorèse ATGGCCTTA capillaire ATGGCCTT ATGGCCT dNTPs ATGGCC fluorescents ATGGC ATGG STOP! ATG AT A
  • 41. Hybridation Puces à ADN ARNr 16S ou gènes fonctionnels
  • 42. Attention!!! Choix de la méthode Biais