Le document traite de la microbiologie quantitative, abordant les méthodes d'échantillonnage et de mesure des microorganismes, leur activité enzymatique, et la quantification de la biomasse. Il décrit également divers outils et techniques telles que la PCR, l'électrophorèse, et l'utilisation d'isotopes pour analyser la diversité génétique et fonctionnelle des communautés microbiennes. Les méthodes expérimentales sont détaillées, allant du comptage direct au marquage isotopique, en passant par l'extraction d'acides nucléiques et la culture de microorganismes.

1. MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE

2. I- MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE
Microorganismes =
- combien? Quel taux?
- distribution?
- diversité?
- rôle fonctionnel?
- contrôles?
Méthodes de mesure
standardisées, précises, répétables, sensibles

3. 1- Echantillonnage
Eau Sédiment
Accès direct, éloigné éloigné
Echantillonnage filet, bouteille, filtre pelle, carottier
Traitement dilution, concentration dilution
- stériliser ou rincer
- fixation (glutaraldéhyde, formaldéhyde)
- stockage (4 ou - 20 ou - 80°C)
- faire les analyses le + vite possible!!!!

4. Filet à plancton
(algues et protozoaires)
Bouteille de Niskin

5. Pelle à sédiment
Carottier

6. 2. Activité enzymatique
enzyme
Substrat produit
Disparition du substrat
Apparition du produit
- Activité réelle
dynamique
- Activité potentielle
Traceurs et marquage
- fluorescent, coloré
- isotopique stable ou radioactif

7. 2.1- Dynamique AUTOCLAVED
150
Fe(II)
Quantifier substrats et produits 100
Fe (II) uM
Au cours du temps
50
Réduction de Fe (III) 0
0 200 400 600 800
time (h)
Inhibiteurs ou compétiteurs
nitrapyrine NH4+ oxidase
chlorate NO2- oxidase
C2H2 N2O réductases

8. 2.2- Traceurs et marqueurs
Ajout de substrat devenir?
- chromogène ou fluorogène
- marquage isotopique
Attention!!!
Activité potentielle
- Microcosmes (radioactifs, chromogène, fluorogène)
- Nature (isotopes stables)

9. Substrat chromogène ou fluorogène
Colorimétrie
Microplaque Biolog
INT
respiration
INT-formazan
Fluorimétrie
Methylumbellyferone
Amino-methylcoumarine

10. Marquage isotopique
Même élément = différentes masses
Carbon-12 Carbon-13 Carbon-14
electrons
neutrons
protons
(6P + 6N) (6P + 7N) (6P + 8N)
Isotopes stables Isotopes radioactifs

11. Isotopes radioactifs
3H [3H]-CH3 Oxydation du méthane
14C [14C]-CaCO3 photosynthèse
35S [35S]-SO42- Réduction des sulfates
Particules β
Excitation
Cocktail scintillant = solvant
3H
Solvant + émulsifiant + fluor
cpm fluor

12. Isotopes stables Fractionnement
Soufre 32S, 33S, 34S, 35S
Isotope + léger réagit + vite
Desulfovibrio spp.
SO42- H2S enrichi en 32S
Desulfatomaculum spp.
Rapport isotopique
34S/32S – 34S/32Sstandard
échantillon
δ34Sechantillon = x 1000
34S/32S
standard

13. Spectromètre de masse + GC
Séparation et identification Rapport masse/charge
des isotopes
• 13C/12C = 0.011225
ions
• 13C/12C = 0.011071
• 13C/12C = 0.010918
Bombardement e-
Masse molaire

14. 3- Biomasse
Densité = nb de cellule par volume ou par surface
Biomasse = mg de C par volume ou par surface
fg C Cell-1
culture
Escherichia coli 109-323
bacterioplancton
Antarctique 7-13

15. 2 Stratégies:
Comptage direct
DIRECT
Biomarqueurs
Quantité?
INDIRECT culture

16. 2.1. CULTURE EN MILIEU SOLIDE
COMPTAGE des UFC

17. 2.2. CULTURE LIQUIDE Estimation statistique
Nombre le plus probable (NPP)
1 ml dans 9 ml
Table de Mac Grady (extrait)
NPP
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
3 2 0 9
+ + + - -
+ - - - - 3 2 1 15
+ + - - - 3 2 2 21
3 2 1 0 0
Bactéries/ml = 15/10-2 = 1500

18. 2.3. COMPTAGE DIRECT
Hémocytomètre Microscope Eucaryotes
photonique
Electrolyte Compteur de particules
= cytomètre de flux
Fluorescence
Microscope à
épifluorescence

19. Hémocytomètre
Algues,
champignons,
protozoaires

20. Microscope à épifluorescence
Occulaire
Filtre
em.
Filtre
exc.
objectif
excitation emission
Acridine orange, DAPI, Syber green

21. Hybridation
FISH
Populations, groupes taxonomiques

22. Cytomètre de flux
SSC = granularité
Flux Détecteur de
d’échantillon lumière
FSC = taille
SSC
Laser
FSC
488nm
Dispersion et émission

23. 2.4. BIOMARQUEURS
ADN, ATP, chla, lipides, acide muramique….
DNA 1.6-5.7 fg / bactérie
ATP 1 fg / bactérie
Problèmes = état physiologique, tous les organismes vivants

24. LIPIDES Membranes cytoplasmiques
Acides gras
phospholipidiques Acides gras
FAME = Fatty acid methyl ester
PLFA = Phospholipid linked fatty acids
1- Extraction avec des solvants
2- Esterification
3- chromatographie gazeuse

25. Groupes fonctionnels
Champignons18:2w6
Bactéries 18:1w7c
cy19:0
i15:0
a15:0 Actinomycètes 10Me 18:0
i14:0
Biomarqueurs = diversité + biomasse

26. ACIDES NUCLEIQUES -
ARNm =
ADN
gènes fonctionnels
ARNr 23S
ARNr 16S
ARNr 5S
Extraction= +
1- lyse (physique, chimique, enzymatique)
2- extraction (phenol/chloroforme)
3- purification
4- précipitation (éthanol, iso-propanol)
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

27. PCR = Polymerase Chain Reaction
Température ºC
dénaturation 94-96
1er cycle
amorces 50-60
hybridation
+ dNTPs polymérase élongation
72
94-96
2e cycle

28. PCR en temps réel
Sonde TaqMan
mesurer à chaque cycle d’amplification la quantité
d’ADN par marquage fluorescent
log[ADN]=a(nombre de cycle)+b
[ADN]
Nb de cycles

29. 4- Diversité génétique = Acides nucléiques
ARNm = diversité phénotypique
ADN = diversité génotypique
- Population
- Groupes fonctionnels
- Communauté
PROFIL = code barre de l’espèce ou de la communauté
SEQUENCE = succession de paires de base

30. Quel gène amplifier?
- ARN ribosomal genres et espèces
16S ITS 23S
- Eléments répétés espèces
- DNA gyrase (gyrA et gyrB) espèces
- Gènes fonctionnels groupes fonctionnels
Ex. Nir K et Nir S codent des nitrites réductases
dénitrification

31. Séparation par la TAILLE
Fragments de taille variable
ITS, éléments répétés, microsatellites
Paires de bases
- 1000
Électrophorèse
500
en cuve ou en
capillaire
+ 200
Gel d’agarose ou d’acrylamide
par LC (pair d’ions)

32. Fragments de même taille ARNr 16S, gènes fonctionnels
Couper avec une enzyme de restriction
POPULATION
A B
Souche
RFLP
(restriction fragment
length polymorphism)

33. COMMUNAUTE Trop de bandes
*
Espèce A
amorce fluorescente* *
Espèce B
A B A+B A+B
*
Gel d’acrylamide
(electrophorèse *
capillaire) RFLP tRFLP

34. Séparation par la COMPOSITION
% bases G+C DENATURATION
Électrophorèse sur gel d’acrylamide
GC clamp Amplicon
Gradient dénaturant chimique (DGGE)
ou
thermique (TGGE, TTGE)
Élution à 65 ºC
dHPLC
pair d’ions

35. CONFORMATION = SSCP
Single strand conformation polymorphism
Électrophorèse d’acrylamide
(gel ou capillaire)
ARNr 16S, gènes fonctionnels Dans le gel à 20°C les simples
brins se replient sur eux-mêmes
A+B
Dénaturation (98°C-5 min)
2 simples brins

36. Analyse du profil = Diversité et structure
Richesse: nombre de phylotypes
chaque bande = 1 phylotype ou OTU
Structure: profil de bandes
Similarité entre 2 communautés = similarité entre 2
profils
Composition? Quelles espèces?

37. Identification = séquençage
Analyse phylogénétique
Électrophorèse
ou dHPLC
Séquençage
séparation des Identification
phylotypes

38. Séparer sans électrophorèse= clonage
restriction Plasmides 2 kb
β-galactosidase
Fosmides 40kb
vecteur
Cosmides 40kb
Résistance
BAC 300 kb
ADN environnement
YAC >300 kb
vecteur
ligation sélection

39. Maxima cloaca (genoscope- Evry)

40. séquençage ATGGCCTTAAAAGC
ATGGCCTTAAAAGC
ATGGCCTTAAAAG
ATGGCCTTAAAA
PCR
ATGGCCTTAAA
ATGGCCTTAA
Électrophorèse ATGGCCTTA
capillaire ATGGCCTT
ATGGCCT dNTPs
ATGGCC fluorescents
ATGGC
ATGG STOP!
ATG
AT
A

41. Hybridation
Puces à ADN
ARNr 16S ou gènes fonctionnels

42. Attention!!!
Choix de la méthode
Biais