Télécharger pour lire hors ligne
etude et diagnostic des virus les methodes utilisées
- 1. 1 COURS VIROLOGIE Etude etdiagnostic des virus : Les méthodes utilisées Dr Ousmane FAYE Unité des arbovirus et virus de fièvres hémorragiques Institut Pasteur de Dakar
- 2. Plan du cours -Historique • Méthodes d’étude des virus • Multiplication des virus en culture cellulaire • Culture et croissance • Types de culture cellulaires • Types de cultures cellulaires • Préparation de l’échantillon et inoculation • Détection de la réplication virale • Culture virale sur oeufs embryonnés • Multiplication des virus en culture cellulaire • Infection in vivo • Purification du virus • Dénombrement de particules virales • Etude de l’acide nucléique viral (génome) • Analyse de restriction • Hybridation moléculaire (Southern- et Northern blot) • Amplification génique (PCR) • Clonage et séquençage • Bioinformatique • Etude des protéines virales • Western blot • Méthodes de diagnostic • Spécimens et échantillons pour le diagnostic virologique • Signification de la détection virale • Diagnostic des infections virales • Diagnostic direct non spécifique • Diagnostic direct spécifique • Diagnostic indirect
- 3. Historique : • 1898: Mise en évidence de l’agent de la fièvre aphteuse (agent filtrable, virus) Loeffler et Frosch • Début XXe siècle : mise en évidence des méthodes basées sur réaction antigène/anticorps (sérologie, test de la fixation du complément) • 1948 : première description de la croissance d’un virus en culture cellulaire (Weller et Enders) • 1956 : première utilisation d’anticorps fluorescents pour la mise en évidence du virus de l’Influenza humain dans des sécrétions nasales (Liu) • 1970 : développement de la technologie des anticorps monoclonaux • Fin du XXe siècle : essor des technologies basées sur l’amplification moléculaire (PCR)
- 4. Multiplication des virusen culture Définition : Les lignées cellulaires sont des cellules "immortelles", car (1) elles sont cancéreuses ; (2) sont contaminées par un virus qui les rend immortelles (3) ont été modifiées par génie génétique pour être immortelles Objectifs : • Avoir un grand nombre de cellules pour les analyses • Machinerie cellulaire donc réplication • Localisation des protéines • Diagnostic virologique • Conservation virus et fabrication vaccin
- 5. Mise en culturedu virus Culture et croissance cellulaire Milieu de croissance : liquide, riche en AA, minéraux, tampon pH, source d’énergie, facteur de croissance, facteur d’attachement • Eau • Ions minéraux osmolarité :0,9 g par L pH autour de 7,2. • Source de carbone et d'énergie (glucose, pyruvate par exemple) • Facteurs de croissance : • les acides aminés essentiels • les vitamines • des acides gras • Gaz : • dioxygène les cellules étant aérobies • le dioxyde de carbone ~5% ; 37°C
- 6. Mise en culturedu virus Types de cultures cellulaires • Cellules adhérentes : • 2 types de morphologie : épithéliale (polygonale) et fibroblastique (étiré). • Cellules non adhérentes : • Flottent dans le milieu de culture Sphériques; Destinées à la production cellulaire en masse.
- 7. Mise en culturedu virus Types de cultures cellulaires • Culture de cellules primaires : • cellules mises en culture à partir de l’organe prélevé chez l’animal (souvent un foetus), utilisées dès la 1ère culture. • Lignée diploïde ou semi-continue: • nombre de chromosomes constant, durée de vie limitée (cellules engagent leur sénescence après un certain nombre de divisions) • Lignée continue ou transformées: • transformées in vitro ou provenant de tumeurs, aneuploïdes, durée de vie illimitée (« immortalisées ») • Cellules hématopoïétiques: • croissance en suspension
- 8. Cellule illustration QuickTime™ etun décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 9. Mise en culturedu virus Détection de la multiplication virale • Effet cytopathogène : • Changement morphologiques des cellules lors d’une Xcation virale. • Caractérisé par: • arrêt ou diminution de la synthèse des ARN et des protéines cellulaires, • fusion des cellules, • relargage des enzymes lysosomiales, • modification de la perméabilité de la membrane cellulaire, • changements diffus des structures intracellulaires, • présence de corps d’inclusion d’origine virale, • aberrations chromosomiques • Hémadsorption • Capacité d’un virus à agglutiner des hématies en surface des cellules qui infectent par expression en surface membranaire de protéines virales appelées hémagglutinines QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 10. Mise en culturedu virus Détection de la multiplication virale • Interférence • Basée sur une moindre permissivité de la culture cellulaire à l’infection par un virus défini si préalablement infectée par un virus présent dans l’échantillon à tester • Détection quantitative de l’acide nucléique ou des antigènes viraux • Méthodes d’étude du génome ou des protéines virales
- 11. Mise en culturedu virus Culture virale sur oeufs embryonnés QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 12. Infections in vivo •Ethique • Protocoles de manipulations/infections d’animaux doivent être soumis pour approbation préalable à une commission d’éthique • Notions de modèle animal/hôte spécifique de l’infection • Conditions de biosécurité (BSL 2, 3, 4) • En fonction de la classe de risque du pathogène • Suivie fonction des virus QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 13. Purification des virusà partir d’une suspension • Par centrifugation : • 1. Centrifugations différentielles : • Centrifugation à basse accélération • Centrifugation à haute accélération sur surnageant Obtention d’un culot contenant le virus semi-purifié • 2. Ultracentrifugation : • séparation virus-impuretés par propriétés physiques • "en gradient de densité à l’équilibre" (séparation sur base de la densité) • "zonale" (séparation sur base de la vitesse de sédimentation) Obtention d’une suspension de virus très purifiée
- 14. Dénombrement de particulesvirales • Particules physiques = infectieuses + non infectieuses (ex: particules défectives interférentes) • Particules infectieuses = capable de mener à bien un cycle complet de multiplication virale (peuvent être dénombrées par la méthode des plages de lyse ou par la méthode des DICC50) basées toutes deux sur l’effet cytopathogène : « lyse de la cellule infectée »
- 15. Dénombrement de particulesvirales Méthode des plages de lyse QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 16. Dénombrement de particulesvirales On cherche la dilution virale pour laquelle 50% des supports de cellules montrent un effet cytopathogène (cette dilution est celle dont le volume contient une DICC50). Pour les animaux on parle de DL50 Utilisation de microscopie electronique pour compter les particules virales QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 17. Etude de l’acidenucléique viral Analyse de restriction • Elle s’effectue par : • Par des enzymes appelées endonucléases, reconnaissant des sites spécifiques dans une séquence nucléotidique et clivant à cet endroit • Enzymes d’origine souvent bactérienne (mécanisme de protection contre les bactériophages) • Exemple: • Nco I : 5’...CGATGG...3’ 3’...GGTACC...5’ QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 18. Etude de l’acidenucléique viral Hybridation moléculaire (Southern et Northern blot) • Southern blot : est une méthode de BM permettant l'analyse de l'ADN Digestion ADN par une enzyme de restriction sont Séparation par électrophorèse et Transférés sur une membrane par marquage via action capillaire. Tester la membrane en utilisant une sonde ADN marquée avec un complément de la séquence en question. • Northern blot : est une méthode de BM permettant l'analyse de l'ARN QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 19. Etude de l’acidenucléique viral Amplification génique PCR Classique Principe : Recherche de l’ARN ou ADN par amplification Méthode : Utilisation d’amorces spécifiques Visualisation : gel d’agarose QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette imag QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 20. Etude de l’acidenucléique viral Amplification génique PCR à temps réel Principe : Recherche de l’ARN ou ADN par amplification Méthode : Utilisation d’amorces et de sondes spécifiques Visualisation durant l’amplification QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ etun décompresseur sontrequispourvisionnercetteimage.
- 21. Diagnostic PCR en tempsréel: QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 22. Etude de l’acidenucléique viral Clonage et séquençage • Détermination précise de la séquence en nucléotides (laboratoires spécialisés) • Méthode de Sanger (plus rarement Maxam et Gilbert) • Si virus à ARN : ADN complémentaire nécessaire (transcription inverse requise) • A partir du produit de PCR ou clonage de la séquence QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionne QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. Bioinformatique: Analyse des séquences O FAYE EID 2013
- 23. Etude de l’acidenucléique viral Bioinformatique • Différentes analyses possibles à partir des séquences nucléotidiques rentrées dans des banques de données (ex: GenBank) disponibles via internet. • Ex: phylogénie, identification des séquences codantes (cadres de lectures et gènes), identifications des fonctions des produits de gènes viraux par analogie, développement d’outils de diagnostic (choix d’amorces de PCR)
- 24. Etude des protéinesvirales Western Blot Western blotting ou Immunoblot : électrophorèse, transfert sur membrane puis identification des déterminants antigéniques par des anticorps spécifiques et révélation par une méthode immuno- enzymatique. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 25. Méthodes de diagnosticvirologiques virémie 5 IgM RT-PCR ELISA IgM IgG IFI Isolement viral 0 10 IgG 16
- 26. Spécimens et échantillonspour le diagnostic virologique • La qualité du diagnostic viral (probabilité d’identifier l’agent étiologique) dépend fortement de la qualité de l’échantillon reçu par la laboratoire (quantité, durée et conditions du transport). • Le meilleur prélèvement est souvent obtenu sur le site de la lésion et dans les premiers jours de l’apparition de celle-ci. • La culture virale requiert des conditions plus drastiques que celle requises pour la détection des antigènes ou la PCR • Transport de + d’1h : 4°C (autre que sang) • Transport de + de 24h : -70°C (attention à la t° de congélation pour certains virus : RSV, herpèsvirus)
- 27. Spécimens et échantillonspour le diagnostic virologique QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 28. Signification de ladétection virale • La détection du virus dans un échantillon (surtout après utilisation de méthodes très sensibles comme la PCR) n’est pas un preuve en elle-même de l’implication de ce virus dans l’étiologie des signes cliniques • Toujours remettre le résultat du test dans son contexte sémiologique (signes cliniques relevés par le praticien) et pathologique
- 29. Diagnostic des infectionsvirales Les cibles de la détection Structure virale détectée Méthode Quelques applications courantes Diagnostic « indirect » Anticorps anti-viraux sérologies virales presque tous les virus Diagnostic « direct » spécifique Particules virales complètes culture virale Arbovirus,, Entérovirus Protéines virales diagnostic direct « rapide » Rotavirus, Adenovirus, RSV, Grippe, Virus Parainfluenza, Acides nucléiques viraux biologie moléculaire virus neurotropes (HHV-1…) Diagnostic « direct » non spécifique : culture de virus
- 30. Diagnostic des infectionsvirales Pathologie observée, récolte des signes cliniques Diagnostic différentiel Confirmation de l’étiologie par : - Mise en évidence de l’agent pathogène (direct) - Mise en évidence de la réponse immunitaire (indirect)
- 31. Diagnostic des infectionsvirales Méthodes de diagnostic direct non spécifique Effet cytopathogène en culture de cellules Type cellulaire est affecté Temps et vitesse de progression de l’effet cytopathogène Distribution de l’effet (diffus, focal, limité aux marges de la culture) Nature des changements morphologiques Mortalité des souriceaux jours après infection QuickTime™ et u décompresseur sont requis pour visio
- 32. Diagnostic des infectionsvirales Méthodes de diagnostic direct spécifique • Détection de l’ADN viral à partir du prélèvement • Détection des protéines virales : • Techniques immunoenzymatiques (ELISA) • Techniques d’immunofluorescence • Mise en évidence directe du virus: • Microscopie électronique
- 33. Diagnostic des infectionsvirales Méthodes de diagnostic direct spécifique ELISA QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. Principe de la réaction ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) : Formation d’un complexe antigène - anticorps - Sérum supposé contenir les anticorps recherchés - Antigène (réactif commercial) adsorbé sur un support plastique (plaque 96 puits) Détection du complexe antigène-anticorps par fixation d’un anticorps anti-U humaine - par une enzyme (méthode immuno-enzymatique) - par une molécule fluorescente (immuno-fluorescence) QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette im
- 34. Diagnostic 1 - Habillage(coating) avec l’anticorps de capture 2 - sérum à tester 3 - Antigène spécifique 4 - Anticorps spécifique 5 - Révélation Principe : Recherche des anticorps (IgM et IgG) ou antigènes ELISA
- 35. Technique de laboratoire Elisa Elisa QuickTime™et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 36. Technique de laboratoire Elisa: Recherche antigène ou anticorps Elisa : Recherche antigène ou anticorps Anti IgG de souris marqué Anticorps de souris IgM de mouton Sérum à tester Broyat à tester Antigène Anti µ de mouton Anti µ humain Antigène capture IgM Substrat OT Attention aux réactions croisées Attention aux réactions croisées
- 37. Diagnostic des infectionsvirales Méthodes de diagnostic direct spécifique Immunofluorescence La technique de référence Sensibilité et spécificité > 99.9% Rapide Personnel doit être entrainé QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 38. Diagnostic des infectionsvirales Méthodes de diagnostic direct: Microscopie électronique QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image.
- 39. MERCI DE VOTREATTENTION
Notes de l'éditeur
- #1 Pourquoi une présentation de l'IP? Pour souhaiter bienvenue Notoriété Multiples facettes