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Réalisé par :
 ENNAKHLI SOUHAILA
 ZOURAIR IMANE
 MAZIGH AHMED IAHIA
 OUHMOUCH ABDERRAHIM
Groupe : 2 - 2
Encadré par :
Mme L. HAMAMA
UNIVERSITE SULTANE MOULAY SLIMANE
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
BENI MELLAL
Rapport technique des travaux pratiques :
techniques d’analyses biochimiques
LST : Technologie et qualité des produits agro-alimentaires
Module : techniques d’analyses biochimiques
Année universitaire : 2017 / 2018
Plan :
Introduction générale
TP :1 : Extraction, identification et dosage des
pigments chloroplastiques des végétaux par
spectrophotométrie
TP :2 : Les méthodes de chromatographie :
Principe et application
Conclusion générale
Introduction générale :
Les techniques d’analyses biochimiques désignent
l’ensemble des méthodes de point utilisées en biochimie.
Ces méthodes exploitent les propriétés physico-chimiques
des molécules dans le but de comprendre les divers
phénomènes mis en jeu.
Exemples : chromatographie, spectrophotométrie,
électrophorèse, centrifugation …etc.
Ces analyses biochimiques (qualitatives ou quantitatives)
peuvent avoir comme objectifs :
 La caractérisation des espèces chimiques ;
 La quantification des espèces chimiques ;
TP :1 :
Extraction, identification et dosage
des pigments chloroplastiques des végétaux
par spectrophotométrie :
Lantana sp.
Introduction
Nous savons que les organismes chlorophylliens sont
autotrophes pour le carbone, c'est-à-dire capables de
synthétiser des substances organiques à partir de substances
minérales. Cette synthèse nécessitant la lumière comme
source d'énergie s'appelle donc photosynthèse.
Chez les organismes photosynthétiques, l'utilisation de
l'énergie lumineuse est rendue possible par l'existence de
pigments, molécules organiques ou minérales insolubles dans
l’eau et solubles dans les solvants organiques capables
d'interagir spécifiquement avec certaines longueurs d'onde de
la lumière.
Objectif : disposer de solutions des pigments extraits de
divers échantillons végétaux pour en identifier les constituants et
pour établir les spectres d'absorption correspondants.
I. Les types des pigments chez les végétaux et leurs rôles :
 Les chlorophylles et les caroténoïdes sont solubles dans des
solvants organiques et peuvent donc être séparés à l'aide de
solvants ou de mélanges de solvants des lipides. Ces molécules
sont dites liposolubles.
II. Matériels et méthodes :
 L’extraction : procédé de séparation utilisé pour isoler la molécule
recherchée dans la matrice qui la contient.
-Extraction mécanique par pression : exemple : Huiles…
-Extraction chimique : solide/solide, liquide/liquide, liquide/vapeur ou
solide/vapeur.
 Broyage : faciliter la sortie des substances recherchées en
écrasant les membranes et en détruisant les cellules. On
distingue : broyage mécanique manuel et broyage électrique
(mixeur).
- Exemple :
Broyage mécanique manuel : mortier + pilon
 Centrifugation : procédé de séparation et de fractionnement des
composés d’un mélange en fonction de leur différence de densité
en les soumettant à une force centrifuge.
Centrifugeuse
 Spectrophotométrie : méthode analytique qualitative et
quantitative qui consiste à mesurer l’absorbance ou la densité
optique (DO), la transmittance et la fluorescence d’une solution dans
l’UV que dans le visible.
Spectrophotomètre
III. Protocole expérimental :
1) Préparation des solutions :
Verrerie utilisée :
-Bécher : instrument pour mélanger.
-Fiole jaugée : instrument pour mesurer à température ambiante.
Fiole jaugée
-Préparation de 50 ml d’une solution mère du tampon tris-HCl :1M à pH 7,5 :
La masse molaire du Tris (C4H11NO3) = 121.14 g/mol
1M = solution molaire ; c’est-à-dire : 1 mole 1000 ml
121.14 g 1000 ml
X 50 ml
X = (50 ml X 121.14 g) /1000 ml = 6.05 g
 Alors : 6.05 g 50 ml
-A l’aide d’une spatule propre et sèche, on prend le Tris ;
-Peser le Tris dans un bécher approprié ;
Balance du laboratoire
-Tarer la balance (propre et équilibrée) pour obtenir le poids net (6,05 g) ;
-Ajouter une petite quantité d’eau DD sur le Tris contenu dans le bécher et homogénéiser
à l’aide d’un agitateur magnétique ;
Agitateur magnétique
Aimant magnétique
Spatule
Bécher
Balance du
laboratoire
-Ajuster le pH du Tris (base forte) en ajoutant quelques gouttes de HCl petit à petit à l’aide
d’une pro pipette (acide fort), et en observant la variation du pH sur un pH-mètre jusqu’à
pH7,5 ;
PH-mètre
-Récupérer le reste des molécules dans le bécher et verser le tout dans une fiole jaugée
puis rajouter de l’eau DD jusqu’au trait de jauge (50 ml) ;
-Mettre la préparation dans une bouteille appropriée, la renfermer et l’identifier
(étiquetage).
-Préparer 100 ml d’une solution fille de 50 mM à pH 7,5 :
Principe :
Schéma :
= 5 ml
= 100 ml
+ 95 ml
Eau DD
-Sachant que : Ci. Vi = Cf. Vf
1 M X ? ml = 0.05 M X 100 ml
Vi= (0.05 M X 100 ml) / 1 M = 5 ml
-Alors, à l’aide d’une pipette graduée, on prend 5 ml de la solution mère qu’on
complète avec 95 ml de l’eau DD ;
-Mettre cette solution dans une bouteille appropriée, la renfermer et l’identifier
par étiquetage ;
2) Matériel végétal utilisé : parenchyme du limbe foliaire de Lantana sp.
-Peser l’échantillon dans un papier aluminium ;
Balance du laboratoire
3) Broyage et extraction :
0.4 g de limbe de
feuilles vertes
bien coupées en
petits morceaux
-Broyer finement l’échantillon en présence de sable et du PVP.
-Ajouter un facilitateur de broyage (Tris-HCl) et continuer de broyer ;
-Rajouter 2 ml de tampon et continuer de broyer
-Dans un tube à centrifuger (Falcon) en verre ou en polypropylène (matériel
inerte pour éviter la corrosion à cause de l’acétone), mettre 0.5 ml du broyat puis
rajouter à l’aide d’une pro pipette et sous la Sorbonne active 2 ml d’acétone pure.
Pilon
Mortier
Antioxydant
Pour écraser
les cellules
Facilitateur Pâte
homogène
Tris–HCl
50 mM
pH7,5
Ajout de 2ml
du tampon
- Centrifuger à 6000g pendant 15min et extraire le culot par de l’acétone
80%v/v :
(2 ml de solvant (acétone) / 2.5 ml solution totale) X 100 = 80 %
 C’est-à-dire : Vf / Vi = Facteur de dilution 2.5 ml / 0.5 ml = 5
Ajout de 2ml
d’acétone
Pro pipette
0,5 ml du
broyat
Tube en
Polypropylène
Pipette
pasteur
N.B : On travaille sous
Sorbonne active Gant de
protection
Balance du
laboratoire
Tube de
centrifugation
 On récupère le
surnageant à l’aide
d’une pipette et le
verse dans un micro
tube (tube Eppendorf) :
Surnageant (Pigments, molécules
liposolubles et acétone…)
Culot (Sable, PVP, débris
cellulaires…)
Centrifugeuse
Rotor
Cuve de la centrifugeuse
Tubes de centrifugation
Tube Eppendorf
Surnageant
4) DOSAGE DES PIGMENTS :
Les chlorophylles et les caroténoïdes absorbent certaines radiations
dans la gamme de la lumière visible comprises entre 400 nm et 700 nm :
vers 470 nm (absorption des carotènes), vers 647 et 663 nm (absorption
des chlorophylles).
Pour cela on reprit l’échantillon, on le met dans une cuve en quartz
remplie à ¾ et on mesure son absorbance au spectrophotomètre à 3
longueurs d’onde : 663, 647 nm et 470 nm, en réglant le zéro de
l’absorbance (DO) avec le solvant (l’acétone à 80% v/v).
On a utilisé :1000μl d’acétone 80% + 200μl de surnageant = 1200μl
comme volume total dans la cuve de quartz. Les prises sont faites à l’aide
d’une pro pipette.
 C’est-à-dire : Facteur de dilution= Vf / Vi = 1200μl /200μl = 6
Echantillon cuvette Acétone Pro-pipette
 On obtient la courbe de densité optique = f (longueur d’onde) :
 Tableau des valeurs de DO correspondantes à chaque longueur d’onde utilisée
(470,647 et 663 nm) :
 On a trouvé :
(A663) = 0,5685
(A647) = 0,2378
(A470) = 0,5073
 Vers 470 nm : absorption des carotènes.
 Vers 647 et 663 nm : absorption des chlorophylles.
- On peut dire que dans la courbe :
Un pic Absorption de la lumière à λ quelconque par une molécule
5) Calcul des quantités de chaque pigment :
-On utilise les équations de Lichtenthaler qui donnent la concentration de chaque
pigment en μg /ml dans la cuve :
Chl a = 12,25 (A663) – 2,79 (A647)
Chl b = 21,50 (A647) – 5,10 (A663)
Chl a+b = 7,15 (A663) + 18,71 (A647)
Car = 5,05 (A470) – (1,82 [Chl a] + 85,02 [Chl b])
198
Pour la chlorophylle a, on a :
Chl a = 12,25 (A663) – 2,79 (A647) = 12,25 x 0,57 – 2,79 x 0,23 = 6,30 μg [Chl a] /ml
-En tenant compte le facteur de dilution lors du dosage au spectrophotomètre :
On a : Facteur de la dilution = Vf/Vi = 1200μl solution / 200μl d’échantillon = 6
Alors, on doit multiplier 6,30 μg [Chl a] /ml par 6, on aura : 37,8 μg [Chl a] /ml
-Et dans un deuxième temps, par le facteur de dilution dans l’acétone (broyat dilué 5
fois par l’acétone) :
Fd = Vf/Vi = 2.5 ml / 0.5 ml = 5
Alors, on doit multiplier 37,8 μg [Chl a] /ml par 5, on aura : 189 μg [Chl a] /ml
-Puis par le volume total du broyat (4 ml) :
C’est-à-dire : 189 μg [Chl a] 0,5 ml
X μg [Chl a] 4 ml
Et sachant que : 10-6 g = 10-3 mg = 1μg
Alors : X = 4ml x 189 μg [Chl a] x 10-3 / 0,5 ml = 1,512 mg [Chl a]
-Revenons à la masse initiale de la matière sèche utilisée :
- On a : 0,4 g = 1,512mg [Chl a ] 1 g = X mg [Chl a]
-Pour 1g de matière sèche, on aura : 3,78 mg [Chl a].
-Donc on a : 3,78 mg [Chl a] / g de matière sèche.
- De la même façon, on calcul la quantité des autres pigments en mg par g de
matière sèche :
Pour la Chlorophylle b :
Chl b = 21,50 (A647) – 5,10 (A663) =21,5 x 0,2378 – 5,1 x 0,5685 = 2,21 μg [Chl b] /ml
-Donc on a : 1,32 mg [Chl b] / g de matière sèche
Et pour les caroténoïdes (carotène, lycopène, xanthophylle …) :
Car = 5,05 (A470) – (1,82 [Chl a] + 85,02 [Chl b])
198
= 5,05 x 0,5673 - (1,82 x 6,30 + 85,02 x 2,21) = 1,55 μg [Car] /ml
198
-Donc on a : 0,93 mg [Car] / g de matière sèche
IV. Interprétation des résultats :
Puisqu’il s’agit des feuilles vertes (siège de la photosynthèse),
c’est normal qu’on a trouvé tous les pigments. Surtout de la
chlorophylle a et de la chlorophylle b responsables de la couleur
verte.
Conclusion
La propriété de l’absorbance à une longueur d’onde
donnée confère aux pigments une couleur déterminée
lorsqu'ils sont éclairés par de la lumière blanche.
TP :2 :
Les méthodes de chromatographie :
Principe et application
INTRODUCTION
La chromatographie d'adsorption est une technique de
séparation de composés basée sur la différence d'affinité
existant entre ces composés, la phase mobile, qui entraîne les
composés, et la phase stationnaire. La séparation est basée sur
les différences de vitesses d'entraînement, vers le bas de la
colonne, des substances contenant l'échantillon. Ces vitesses
dépendent de la capacité d'adsorption de l'espèce par la phase
stationnaire, et de la solubilité de cette espèce dans l'éluant.
L’exemple de chromatographie d'adsorption présenté durant
ce TP est la chromatographie sur colonne, elle utilise une
phase stationnaire introduite dans une colonne de silice. C'est
une technique très largement utilisée notamment pour
séparer et purifier les différents constituants d'un mélange.
Objectif :
Au cours de ce TP nous verrons sur l'exemple d'un mélange de
colorants : le E102 et le E131, extraits du sirop de menthe, le
principe de cette technique en utilisant comme phase stationnaire la
silice.
Démonstration de l’intérêt de la chromatographie sur colonne par
rapport à la chromatographie sur couche mince (CCM).
Présentation du matériel :
Nous avons ici besoin de ces différents éléments :
 Pot silice qui contient la phase stationnaire,
 Les deux éluants : eau distillée, puis éthanol,
 Sable et coton,
 Colonne en verre,
 Béchers,
 Pipettes pasteur, pro pipettes,
 Solution contenant le mélange sirop menthe,
 Support de tubes à essai,
 Spectrophotomètre
I. Chromatographie sur colonne d’un sirop de menthe :
1) Principe :
 La technique de chromatographie sur colonne repose sur le
même principe que la chromatographie sur couche mince.
 Les espèces chimiques à séparer sont plus ou moins entraînées
par un éluant sur une phase fixe :
1 - La phase fixe est un solide, le plus souvent de la silice ou de
l'alumine remplissant une colonne.
2 - L'échantillon est déposé en haut de la colonne. La séparation des
espèces chimiques est obtenue par l'écoulement continu d'une
phase mobile (l’éluant) à travers la colonne.
 La séparation est basée sur une différence de vitesses
d'entraînement des espèces chimiques vers le bas de la
colonne.
2) Manipulation :
a) Préparation de la colonne (phase stationnaire) :
 On place tout d'abord un morceau de coton au fond de la colonne
que l'on recouvre d'éluant, afin d'éliminer l'air emprisonné dans le
coton. On ajoute 0,5 centimètres du sable environ au-dessus du
coton, afin que la phase stationnaire ne puisse pas s'échapper de la
colonne.
 Ensuite on remplit la colonne avec la phase stationnaire de silice.
 Une fois la colonne est remplie, on rajoute 0,5 centimètres de sable
en tête de la colonne au-dessus de la surface de silice. Cette couche
permet de réaliser des dépôts et d'ajouter de l'éluant sans
perturber la surface de silice, ce qui empêcherait une bonne
séparation. On rince avec le 1er
éluant qui est l'eau distillée et on le
laisse s'écouler.
 On s'assure régulièrement de ne pas assécher la phase stationnaire,
en vérifiant qu'il reste toujours de l’eau au niveau du sable.
Colonne de silice
 Pour séparer les colorants du sirop de menthe, on utilise :
Phase fixe Eluant (phase mobile)
Révélation
(détection)
La silice
1er
: eau
2ième
: éthanol
visuelle
 Plus une molécule est soluble dans un éluant plus elle est entraînée avec
l’éluant vers le bas de la colonne.
 Le gel de silice retient plus ou moins bien les molécules selon leur structure
moléculaire. On dit que le gel de silice adsorbe les molécules.
Eau distillée(2cm) (éluant)
Sable (<0,5cm)
Silice(5cm) (phase fixe)
Sable (<0,5cm)
Coton
Pipette
-Déposer le coton au fond ;
-Ajout du sable ;
-Introduire la silice ;
V
Pipette
Coton
Sable (<0,5cm)
Silice (5cm)
-Finir avec du sable ;
-Tapoter la colonne et placer un tube sous la colonne ;
-Rincer avec de l’eau (l’éluant) ;
Sable (<0,5cm)
Eau distillée(2cm) (éluant)
b) Dépôt de l’échantillon à séparer :
-Dépôt délicat de 2 gouttes de sirop de menthe en haut de la colonne ;
-Eluer avec de l’eau ;
Sirop de
menthe
Pro pipette
Eau distillée
(Éluant)
Pipette
pasteur
-Récupérer le 1er colorant arrivant en bas dans un tube Eppendorf ;
Jaune de tartrazine (E102)
- Remplacer l’eau (éluant) par l’éthanol pour récupérer le 2ème colorant ;
- Récupérer le 2ème colorant arrivant en bas dans un autre tube Eppendorf
Bleu de patente V (E131)
Mélange
Le bleuLe jaune
Temps
d’élution
Temps
d’élution
Temps
d’élution
Interprétation des résultats de la séparation :
En se basant sur le comportement des deux colorants lors de la séparation
on peut déduire que :
 Le bleu de patenté V présente une grande affinité pour la phase stationnaire
(gel de silice) car il est très adsorbé au silice. Et l'eau n'est alors pas un éluant
capable de l'entraîner, contrairement à l'éthanol.
 Le jaune de tartrazine a plus d’affinité avec la phase mobile (l’eau distillée)
car il est très élué dans l’eau.
Explication : du point de vue chimique ;
 Le bleu de patenté V (E131) avec ses quatre fonctions éthyle C2H5 ressemble
à l’éthanol C2H5-OH. Donc il sera le plus soluble dans ce dernier et en
présentant alors une grande affinité au gel de silice.
Le bleu de patenté V (E131)
 Le jaune de tartrazine (E102) possède des fonctions sels (sels tri sodiques), il
a donc plus d’affinité avec l’eau et par conséquent c’est le moins soluble dans
l’éthanol.
Le jaune de tartrazine (E102)
Remarque :
L’intérêt de la chromatographie sur colonne est de récupérer des
substances, les identifier et les doser à la différence de la
chromatographie sur couche mince (CCM) qui a pour objectif de
séparer des substances dans un but d’analyse ou de purification.
On dit alors que la CCM est une méthode analytique qualitative
tandis que la chromatographie sur colonne et puisqu’elle est
couplée à un spectrophotomètre, on parle -dans ce cas- de
méthode analytique quantitative.
II. Identification des colorants du sirop de menthe et
dosage par spectrophotomètre :
L’utilisation spectrophotomètre permet de tracer les spectres
d'absorption en fonction de la longueur d’onde, du sirop de menthe
et des 2 colorants issus de la séparation précédente.
N.B : Une dilution des solutions obtenues est nécessaire pour ne pas
dépasser la valeur maximale mesurable par le spectrophotomètre.
1) Manipulation :
-Préparer une solution de 10 ml diluée au 1/10 du sirop de menthe ;
-Préparer une solution fille (dilution finale 1/100) ;
-Préparation des cuves des solutions à analyser ;
-Préparer une cuve de l’éluant pour le zéro (blanc) ;
On a utilisé :1200μl comme volume final total dans la cuve. Les prises sont
faites à l’aide d’une pro pipette.
-Faire les spectres et déterminer les longueurs d’ondes λ caractéristiques.
N.B : Pour chacune
des solutions étudiées,
remplir la cuve
spectrophotométrique
au 2/3 maximum
Cuve en quartz
Échantillon
Solvant
utilisé
Pro pipette
2) Résultats de la spectrophotométrie :
 On obtient la courbe de l’absorbance = f (longueur d’onde) :
 Pour le sirop de menthe dilué 100 fois :
 Pour le bleu de patenté dilué 6 fois :
 Pour le jaune de tartrazine dilué 3 fois :
3) Interprétation des résultats de la spectrophotométrie :
D’après les spectre d’absorption :
 Le bleu ‘’E131’’ absorbe à 630 nm.
 Le jaune ‘’E120’’ absorbe à 425 nm.
 Le sirop de menthe absorbe à 630 nm et à 425 nm.
 Tableau des valeurs de DO correspondantes à chaque longueur d’onde utilisée
(425 et 630 nm) :
Solution Absorbance à 425 nm Absorbance à 630 nm
Sirop de menthe 0,0152 0,0763
Bleu de patenté 0,0157 1,0633
Jaune de tartrazine 0,1655 -0,0754
o On a :
Pour le sirop de menthe :
 Dilution : 100 fois
Facteur de dilution= Vf/Vi = 1200μl solution/12μl du sirop de menthe= 100
 Cuve : en quartz ou en plastique car le solvant est l’eau.
 Blanc : l’eau distillée.
 Résultat de la spectrophotométrie :
Longueur d’onde λ 630 nm 425 nm
Densité optique 0,08 0,02
Le sirop de menthe absorbe à deux longueurs d’onde : 630 nm et 425 nm.
Pour le bleu de patente V :
 Dilution : 6 fois
Facteur de dilution= Vf/Vi=1200μl de solution/200μl de bleu de patente= 6
 Cuve : en quartz pour éviter la corrosion car le solvant est l’éthanol.
 Blanc : l’éthanol.
 Résultat de spectrophotométrie :
Longueur d’onde λ 630 nm 425 nm
Densité optique 1 0
La longueur d’onde du bleu est entre 450-500 nm, mais puisque jamais une
molécule absorbe sa propre longueur d’onde. Donc le bleu de patenté absorbe à
630 nm.
Pour le jaune de tartrazine :
 Dilution : 3 fois
Facteur de dilution=Vf/Vi=1200μl de solution/400μl de jaune de tartrazine= 3
 Cuve : en quartz ou en plastique car le solvant est l’eau.
 Blanc : l’eau distillée.
 Résultat de spectrophotométrie :
Longueur d’onde λ 630 nm 425 nm
Densité optique 0 0,2
La longueur d’onde du jaune est entre 565-590 nm, mais jamais une molécule
absorbe sa propre longueur d’onde. Donc le jaune de tartrazine absorbe à 425nm.
4) Détermination de la concentration des trois préparations par
spectrophotométrie :
On utilise la courbe d’étalonnage donnée pour le bleu de patenté V et pour la
tartrazine à partir d’une gamme, pour déterminer les différentes concentrations
correspondantes aux valeurs de DO (absorbance) :
-On a trouvé que :
Pour le sirop de menthe dilué 100 fois :
o A630 = 0,08 ≈ 0,1 [Bleu de patenté V] = 1 mg/l
-En tenant compte le facteur de dilution lors du dosage au spectrophotomètre ;
- On a : Facteur de la dilution = Vf/Vi = 100
-C’est-à-dire on doit multiplier 1 mg/l par 100, on aura : 100 mg/l
 Donc on a : 100 mg de Bleu de patenté V / L de sirop de menthe.
o A425 = 0,02 [Jaune de tartrazine] = 0,5 mg/l
-En tenant compte le facteur de dilution lors du dosage au spectrophotomètre ;
- On a : Facteur de la dilution = Vf/Vi = 100
-C’est-à-dire on doit multiplier 0,5 mg/l par 100, on aura : 50 mg/l
 Donc on a : 50 mg de jaune de tartrazine / L de sirop de menthe.
A Bleu = 1
A Jaune =0,2
A 630 de Sirop de menthe =0,1
A 425 de sirop de menthe = 0,02
Pour le bleu de patenté V dilué 6 fois :
o A630 = 1 [Bleu de patenté V] = 6 mg/l
-En tenant compte le facteur de dilution lors du dosage au spectrophotomètre ;
- On a : Facteur de la dilution = Vf/Vi = 6
-C’est-à-dire on doit multiplier 6 mg/l par 6, on aura : 36 mg/l
 Donc on a : [Bleu de patenté V] = 36 mg / L
Pour le jaune de tartrazine dilué 3 fois :
o A425 = 0,2 [jaune de tartrazine] = 5 mg/l
-En tenant compte le facteur de dilution lors du dosage au spectrophotomètre ;
- On a : Facteur de la dilution = Vf/Vi = 3
-C’est-à-dire on doit multiplier 5 mg/l par 3, on aura : 15 mg/l
 Donc on a : [jaune de tartrazine] = 15 mg / L
5) Les facteurs de dilution des deux colorants après chromatographie :
On a : Ci. Vi = Cf. Vf Ci/Cf = Vi/Vf
Pour le bleu de patenté :
Facteur de la dilution =Ci/Cf =100/36= 2,77
Pour le jaune de tartrazine :
Facteur de la dilution =Ci/Cf =50/15= 3,33
6) Détermination du volume des éluants utilisés pendant les élutions :
 On utilise : Vi = 100 µl :
Pour le bleu de patenté : l’éluant est l’éthanol ;
On a : Fd = Vf/Vi =Ci/Cf = 2,77 Vf = Vi x Fd = 100 x 2,77 = 277 µl
Pour le jaune de tartrazine : l’éluant est l’eau distillée ;
On a : Fd = Vf/Vi =Ci/Cf = 3,33 Vf = Vi x Fd = 100 x 3,33 = 333 µl
7) Détermination des coefficients d’extinction molaires des 2 produits :
 La loi de Lambert-Beer s’exprime : A = ԑ. L. Cm
- A : absorbance ou densité optique de la solution traversée ;
- ԑ : Coefficient d’extinction molaire en L. Mol-1 .cm-1 ;
-C : Concentration molaire de la solution traversée en Mol/L ;
-L : Longueur de la cuve égale à 1cm ;
Le Coefficient d’extinction molaire : £=A/Cm. L
 La relation entre la concentration molaire et la concentration massique
est : C pondérale (massique) = M x C molaire
Pour le jaune de tartrazine :
 On a : DO =1 ; Cp=15 mg / L et M=534,363 ± 0,027 g/mol
Cm = Cp / M = (15x10-3) / 534,363 =2,80 x 10-5 mol /l
Alors : £=A/Cm. L = 1/ 2,80 x 10-5 x 1 = 35714,28 L.mol-1.cm-1
Donc : £= A/Cm. L = 35714,28 L.mol-1.cm-1
Pour le bleu de patenté V :
 On a : Cp=36 mg / L et DO= 0,2
- Dans le premier cas (sel de Sodium) : M = 582,66 g/mol
Cm = Cp / M = (36x10-3) / 582,66 =6,17 x 10-5 mol /l
Alors : £=A/Cm. L = 0,2/ 6,17x 10-5 x 1 = 3241,49 L.mol-1.cm-1
Donc : £= A /Cm. L = 3241,49 L.mol-1.cm-1
- Dans le premier cas (sel de Calcium) : M = 1159,42 g/mol
Cm = Cp / M = (36x10-3) / 1159,42=3,10 x 10-5 mol /l
Alors : £=A/Cm. L = 0,2/ 3,10 x 10-5 x 1 = 6441,22 L.mol-1.cm-1
Donc : £= A/Cm. L = 6441,22 L.mol-1.cm-1
8) Interprétation des résultats des coefficients d’extinction molaires :
 On constate que le bleu de patenté dispose du plus grand
coefficient d’extinction molaire £ par rapport au jaune de
tartrazine. Alors c’est lui qui absorbe la lumière le plus.
Remarque :
 En fin de compte, le sirop de menthe est une solution aqueuse
contenant deux colorants artificiels : le jaune tartrazine (E 102) et le
bleu patenté (E 131), qui sont responsables de la coloration verte
intense de ce produit. Donc il ne s’agit pas de pigments.
Conclusion
La technique de la chromatographie sur colonne permet la
séparation des différents constituants d'un mélange, mais elle
peut être utilisée couplée à un moyen de détection, comme par
exemple une spectroscopie UV – visible et on obtient ainsi une
chaîne complète automatisable d'analyse.
Conclusion générale :
Durant ces deux TP nous avons réussi à extraire, à
identifier et par la suite à quantifier certains
constituants des échantillons traités en pratiquant
dans des conditions de sécurité quelques méthodes
de techniques d’analyses biochimiques utilisées
couramment.

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Rapport du tp ; tqpa groupe 2 2

  • 1. Réalisé par :  ENNAKHLI SOUHAILA  ZOURAIR IMANE  MAZIGH AHMED IAHIA  OUHMOUCH ABDERRAHIM Groupe : 2 - 2 Encadré par : Mme L. HAMAMA UNIVERSITE SULTANE MOULAY SLIMANE FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES BENI MELLAL Rapport technique des travaux pratiques : techniques d’analyses biochimiques LST : Technologie et qualité des produits agro-alimentaires Module : techniques d’analyses biochimiques Année universitaire : 2017 / 2018
  • 2. Plan : Introduction générale TP :1 : Extraction, identification et dosage des pigments chloroplastiques des végétaux par spectrophotométrie TP :2 : Les méthodes de chromatographie : Principe et application Conclusion générale
  • 3. Introduction générale : Les techniques d’analyses biochimiques désignent l’ensemble des méthodes de point utilisées en biochimie. Ces méthodes exploitent les propriétés physico-chimiques des molécules dans le but de comprendre les divers phénomènes mis en jeu. Exemples : chromatographie, spectrophotométrie, électrophorèse, centrifugation …etc. Ces analyses biochimiques (qualitatives ou quantitatives) peuvent avoir comme objectifs :  La caractérisation des espèces chimiques ;  La quantification des espèces chimiques ;
  • 4. TP :1 : Extraction, identification et dosage des pigments chloroplastiques des végétaux par spectrophotométrie : Lantana sp.
  • 5. Introduction Nous savons que les organismes chlorophylliens sont autotrophes pour le carbone, c'est-à-dire capables de synthétiser des substances organiques à partir de substances minérales. Cette synthèse nécessitant la lumière comme source d'énergie s'appelle donc photosynthèse. Chez les organismes photosynthétiques, l'utilisation de l'énergie lumineuse est rendue possible par l'existence de pigments, molécules organiques ou minérales insolubles dans l’eau et solubles dans les solvants organiques capables d'interagir spécifiquement avec certaines longueurs d'onde de la lumière. Objectif : disposer de solutions des pigments extraits de divers échantillons végétaux pour en identifier les constituants et pour établir les spectres d'absorption correspondants.
  • 6. I. Les types des pigments chez les végétaux et leurs rôles :  Les chlorophylles et les caroténoïdes sont solubles dans des solvants organiques et peuvent donc être séparés à l'aide de solvants ou de mélanges de solvants des lipides. Ces molécules sont dites liposolubles.
  • 7. II. Matériels et méthodes :  L’extraction : procédé de séparation utilisé pour isoler la molécule recherchée dans la matrice qui la contient. -Extraction mécanique par pression : exemple : Huiles… -Extraction chimique : solide/solide, liquide/liquide, liquide/vapeur ou solide/vapeur.  Broyage : faciliter la sortie des substances recherchées en écrasant les membranes et en détruisant les cellules. On distingue : broyage mécanique manuel et broyage électrique (mixeur). - Exemple : Broyage mécanique manuel : mortier + pilon
  • 8.  Centrifugation : procédé de séparation et de fractionnement des composés d’un mélange en fonction de leur différence de densité en les soumettant à une force centrifuge. Centrifugeuse  Spectrophotométrie : méthode analytique qualitative et quantitative qui consiste à mesurer l’absorbance ou la densité optique (DO), la transmittance et la fluorescence d’une solution dans l’UV que dans le visible. Spectrophotomètre
  • 9. III. Protocole expérimental : 1) Préparation des solutions : Verrerie utilisée : -Bécher : instrument pour mélanger. -Fiole jaugée : instrument pour mesurer à température ambiante. Fiole jaugée -Préparation de 50 ml d’une solution mère du tampon tris-HCl :1M à pH 7,5 : La masse molaire du Tris (C4H11NO3) = 121.14 g/mol 1M = solution molaire ; c’est-à-dire : 1 mole 1000 ml 121.14 g 1000 ml X 50 ml X = (50 ml X 121.14 g) /1000 ml = 6.05 g  Alors : 6.05 g 50 ml
  • 10. -A l’aide d’une spatule propre et sèche, on prend le Tris ; -Peser le Tris dans un bécher approprié ; Balance du laboratoire -Tarer la balance (propre et équilibrée) pour obtenir le poids net (6,05 g) ; -Ajouter une petite quantité d’eau DD sur le Tris contenu dans le bécher et homogénéiser à l’aide d’un agitateur magnétique ; Agitateur magnétique Aimant magnétique Spatule Bécher Balance du laboratoire
  • 11. -Ajuster le pH du Tris (base forte) en ajoutant quelques gouttes de HCl petit à petit à l’aide d’une pro pipette (acide fort), et en observant la variation du pH sur un pH-mètre jusqu’à pH7,5 ; PH-mètre -Récupérer le reste des molécules dans le bécher et verser le tout dans une fiole jaugée puis rajouter de l’eau DD jusqu’au trait de jauge (50 ml) ; -Mettre la préparation dans une bouteille appropriée, la renfermer et l’identifier (étiquetage). -Préparer 100 ml d’une solution fille de 50 mM à pH 7,5 : Principe : Schéma : = 5 ml = 100 ml + 95 ml Eau DD
  • 12. -Sachant que : Ci. Vi = Cf. Vf 1 M X ? ml = 0.05 M X 100 ml Vi= (0.05 M X 100 ml) / 1 M = 5 ml -Alors, à l’aide d’une pipette graduée, on prend 5 ml de la solution mère qu’on complète avec 95 ml de l’eau DD ; -Mettre cette solution dans une bouteille appropriée, la renfermer et l’identifier par étiquetage ; 2) Matériel végétal utilisé : parenchyme du limbe foliaire de Lantana sp. -Peser l’échantillon dans un papier aluminium ; Balance du laboratoire 3) Broyage et extraction : 0.4 g de limbe de feuilles vertes bien coupées en petits morceaux
  • 13. -Broyer finement l’échantillon en présence de sable et du PVP. -Ajouter un facilitateur de broyage (Tris-HCl) et continuer de broyer ; -Rajouter 2 ml de tampon et continuer de broyer -Dans un tube à centrifuger (Falcon) en verre ou en polypropylène (matériel inerte pour éviter la corrosion à cause de l’acétone), mettre 0.5 ml du broyat puis rajouter à l’aide d’une pro pipette et sous la Sorbonne active 2 ml d’acétone pure. Pilon Mortier Antioxydant Pour écraser les cellules Facilitateur Pâte homogène Tris–HCl 50 mM pH7,5 Ajout de 2ml du tampon
  • 14. - Centrifuger à 6000g pendant 15min et extraire le culot par de l’acétone 80%v/v : (2 ml de solvant (acétone) / 2.5 ml solution totale) X 100 = 80 %  C’est-à-dire : Vf / Vi = Facteur de dilution 2.5 ml / 0.5 ml = 5 Ajout de 2ml d’acétone Pro pipette 0,5 ml du broyat Tube en Polypropylène Pipette pasteur N.B : On travaille sous Sorbonne active Gant de protection Balance du laboratoire Tube de centrifugation
  • 15.  On récupère le surnageant à l’aide d’une pipette et le verse dans un micro tube (tube Eppendorf) : Surnageant (Pigments, molécules liposolubles et acétone…) Culot (Sable, PVP, débris cellulaires…) Centrifugeuse Rotor Cuve de la centrifugeuse Tubes de centrifugation Tube Eppendorf Surnageant
  • 16. 4) DOSAGE DES PIGMENTS : Les chlorophylles et les caroténoïdes absorbent certaines radiations dans la gamme de la lumière visible comprises entre 400 nm et 700 nm : vers 470 nm (absorption des carotènes), vers 647 et 663 nm (absorption des chlorophylles). Pour cela on reprit l’échantillon, on le met dans une cuve en quartz remplie à ¾ et on mesure son absorbance au spectrophotomètre à 3 longueurs d’onde : 663, 647 nm et 470 nm, en réglant le zéro de l’absorbance (DO) avec le solvant (l’acétone à 80% v/v). On a utilisé :1000μl d’acétone 80% + 200μl de surnageant = 1200μl comme volume total dans la cuve de quartz. Les prises sont faites à l’aide d’une pro pipette.  C’est-à-dire : Facteur de dilution= Vf / Vi = 1200μl /200μl = 6 Echantillon cuvette Acétone Pro-pipette
  • 17.  On obtient la courbe de densité optique = f (longueur d’onde) :  Tableau des valeurs de DO correspondantes à chaque longueur d’onde utilisée (470,647 et 663 nm) :  On a trouvé : (A663) = 0,5685 (A647) = 0,2378 (A470) = 0,5073  Vers 470 nm : absorption des carotènes.  Vers 647 et 663 nm : absorption des chlorophylles. - On peut dire que dans la courbe : Un pic Absorption de la lumière à λ quelconque par une molécule
  • 18. 5) Calcul des quantités de chaque pigment : -On utilise les équations de Lichtenthaler qui donnent la concentration de chaque pigment en μg /ml dans la cuve : Chl a = 12,25 (A663) – 2,79 (A647) Chl b = 21,50 (A647) – 5,10 (A663) Chl a+b = 7,15 (A663) + 18,71 (A647) Car = 5,05 (A470) – (1,82 [Chl a] + 85,02 [Chl b]) 198 Pour la chlorophylle a, on a : Chl a = 12,25 (A663) – 2,79 (A647) = 12,25 x 0,57 – 2,79 x 0,23 = 6,30 μg [Chl a] /ml -En tenant compte le facteur de dilution lors du dosage au spectrophotomètre : On a : Facteur de la dilution = Vf/Vi = 1200μl solution / 200μl d’échantillon = 6 Alors, on doit multiplier 6,30 μg [Chl a] /ml par 6, on aura : 37,8 μg [Chl a] /ml -Et dans un deuxième temps, par le facteur de dilution dans l’acétone (broyat dilué 5 fois par l’acétone) : Fd = Vf/Vi = 2.5 ml / 0.5 ml = 5 Alors, on doit multiplier 37,8 μg [Chl a] /ml par 5, on aura : 189 μg [Chl a] /ml -Puis par le volume total du broyat (4 ml) : C’est-à-dire : 189 μg [Chl a] 0,5 ml X μg [Chl a] 4 ml Et sachant que : 10-6 g = 10-3 mg = 1μg Alors : X = 4ml x 189 μg [Chl a] x 10-3 / 0,5 ml = 1,512 mg [Chl a] -Revenons à la masse initiale de la matière sèche utilisée : - On a : 0,4 g = 1,512mg [Chl a ] 1 g = X mg [Chl a] -Pour 1g de matière sèche, on aura : 3,78 mg [Chl a]. -Donc on a : 3,78 mg [Chl a] / g de matière sèche.
  • 19. - De la même façon, on calcul la quantité des autres pigments en mg par g de matière sèche : Pour la Chlorophylle b : Chl b = 21,50 (A647) – 5,10 (A663) =21,5 x 0,2378 – 5,1 x 0,5685 = 2,21 μg [Chl b] /ml -Donc on a : 1,32 mg [Chl b] / g de matière sèche Et pour les caroténoïdes (carotène, lycopène, xanthophylle …) : Car = 5,05 (A470) – (1,82 [Chl a] + 85,02 [Chl b]) 198 = 5,05 x 0,5673 - (1,82 x 6,30 + 85,02 x 2,21) = 1,55 μg [Car] /ml 198 -Donc on a : 0,93 mg [Car] / g de matière sèche IV. Interprétation des résultats : Puisqu’il s’agit des feuilles vertes (siège de la photosynthèse), c’est normal qu’on a trouvé tous les pigments. Surtout de la chlorophylle a et de la chlorophylle b responsables de la couleur verte. Conclusion La propriété de l’absorbance à une longueur d’onde donnée confère aux pigments une couleur déterminée lorsqu'ils sont éclairés par de la lumière blanche.
  • 20. TP :2 : Les méthodes de chromatographie : Principe et application
  • 21. INTRODUCTION La chromatographie d'adsorption est une technique de séparation de composés basée sur la différence d'affinité existant entre ces composés, la phase mobile, qui entraîne les composés, et la phase stationnaire. La séparation est basée sur les différences de vitesses d'entraînement, vers le bas de la colonne, des substances contenant l'échantillon. Ces vitesses dépendent de la capacité d'adsorption de l'espèce par la phase stationnaire, et de la solubilité de cette espèce dans l'éluant. L’exemple de chromatographie d'adsorption présenté durant ce TP est la chromatographie sur colonne, elle utilise une phase stationnaire introduite dans une colonne de silice. C'est une technique très largement utilisée notamment pour séparer et purifier les différents constituants d'un mélange. Objectif : Au cours de ce TP nous verrons sur l'exemple d'un mélange de colorants : le E102 et le E131, extraits du sirop de menthe, le principe de cette technique en utilisant comme phase stationnaire la silice. Démonstration de l’intérêt de la chromatographie sur colonne par rapport à la chromatographie sur couche mince (CCM).
  • 22. Présentation du matériel : Nous avons ici besoin de ces différents éléments :  Pot silice qui contient la phase stationnaire,  Les deux éluants : eau distillée, puis éthanol,  Sable et coton,  Colonne en verre,  Béchers,  Pipettes pasteur, pro pipettes,  Solution contenant le mélange sirop menthe,  Support de tubes à essai,  Spectrophotomètre I. Chromatographie sur colonne d’un sirop de menthe : 1) Principe :  La technique de chromatographie sur colonne repose sur le même principe que la chromatographie sur couche mince.  Les espèces chimiques à séparer sont plus ou moins entraînées par un éluant sur une phase fixe : 1 - La phase fixe est un solide, le plus souvent de la silice ou de l'alumine remplissant une colonne. 2 - L'échantillon est déposé en haut de la colonne. La séparation des espèces chimiques est obtenue par l'écoulement continu d'une phase mobile (l’éluant) à travers la colonne.  La séparation est basée sur une différence de vitesses d'entraînement des espèces chimiques vers le bas de la colonne.
  • 23. 2) Manipulation : a) Préparation de la colonne (phase stationnaire) :  On place tout d'abord un morceau de coton au fond de la colonne que l'on recouvre d'éluant, afin d'éliminer l'air emprisonné dans le coton. On ajoute 0,5 centimètres du sable environ au-dessus du coton, afin que la phase stationnaire ne puisse pas s'échapper de la colonne.  Ensuite on remplit la colonne avec la phase stationnaire de silice.  Une fois la colonne est remplie, on rajoute 0,5 centimètres de sable en tête de la colonne au-dessus de la surface de silice. Cette couche permet de réaliser des dépôts et d'ajouter de l'éluant sans perturber la surface de silice, ce qui empêcherait une bonne séparation. On rince avec le 1er éluant qui est l'eau distillée et on le laisse s'écouler.  On s'assure régulièrement de ne pas assécher la phase stationnaire, en vérifiant qu'il reste toujours de l’eau au niveau du sable.
  • 24. Colonne de silice  Pour séparer les colorants du sirop de menthe, on utilise : Phase fixe Eluant (phase mobile) Révélation (détection) La silice 1er : eau 2ième : éthanol visuelle  Plus une molécule est soluble dans un éluant plus elle est entraînée avec l’éluant vers le bas de la colonne.  Le gel de silice retient plus ou moins bien les molécules selon leur structure moléculaire. On dit que le gel de silice adsorbe les molécules. Eau distillée(2cm) (éluant) Sable (<0,5cm) Silice(5cm) (phase fixe) Sable (<0,5cm) Coton Pipette
  • 25. -Déposer le coton au fond ; -Ajout du sable ; -Introduire la silice ; V Pipette Coton Sable (<0,5cm) Silice (5cm)
  • 26. -Finir avec du sable ; -Tapoter la colonne et placer un tube sous la colonne ; -Rincer avec de l’eau (l’éluant) ; Sable (<0,5cm) Eau distillée(2cm) (éluant)
  • 27. b) Dépôt de l’échantillon à séparer : -Dépôt délicat de 2 gouttes de sirop de menthe en haut de la colonne ; -Eluer avec de l’eau ; Sirop de menthe Pro pipette Eau distillée (Éluant) Pipette pasteur
  • 28. -Récupérer le 1er colorant arrivant en bas dans un tube Eppendorf ; Jaune de tartrazine (E102) - Remplacer l’eau (éluant) par l’éthanol pour récupérer le 2ème colorant ; - Récupérer le 2ème colorant arrivant en bas dans un autre tube Eppendorf Bleu de patente V (E131) Mélange Le bleuLe jaune Temps d’élution Temps d’élution Temps d’élution
  • 29. Interprétation des résultats de la séparation : En se basant sur le comportement des deux colorants lors de la séparation on peut déduire que :  Le bleu de patenté V présente une grande affinité pour la phase stationnaire (gel de silice) car il est très adsorbé au silice. Et l'eau n'est alors pas un éluant capable de l'entraîner, contrairement à l'éthanol.  Le jaune de tartrazine a plus d’affinité avec la phase mobile (l’eau distillée) car il est très élué dans l’eau. Explication : du point de vue chimique ;  Le bleu de patenté V (E131) avec ses quatre fonctions éthyle C2H5 ressemble à l’éthanol C2H5-OH. Donc il sera le plus soluble dans ce dernier et en présentant alors une grande affinité au gel de silice. Le bleu de patenté V (E131)  Le jaune de tartrazine (E102) possède des fonctions sels (sels tri sodiques), il a donc plus d’affinité avec l’eau et par conséquent c’est le moins soluble dans l’éthanol. Le jaune de tartrazine (E102)
  • 30. Remarque : L’intérêt de la chromatographie sur colonne est de récupérer des substances, les identifier et les doser à la différence de la chromatographie sur couche mince (CCM) qui a pour objectif de séparer des substances dans un but d’analyse ou de purification. On dit alors que la CCM est une méthode analytique qualitative tandis que la chromatographie sur colonne et puisqu’elle est couplée à un spectrophotomètre, on parle -dans ce cas- de méthode analytique quantitative. II. Identification des colorants du sirop de menthe et dosage par spectrophotomètre : L’utilisation spectrophotomètre permet de tracer les spectres d'absorption en fonction de la longueur d’onde, du sirop de menthe et des 2 colorants issus de la séparation précédente. N.B : Une dilution des solutions obtenues est nécessaire pour ne pas dépasser la valeur maximale mesurable par le spectrophotomètre. 1) Manipulation : -Préparer une solution de 10 ml diluée au 1/10 du sirop de menthe ;
  • 31. -Préparer une solution fille (dilution finale 1/100) ; -Préparation des cuves des solutions à analyser ; -Préparer une cuve de l’éluant pour le zéro (blanc) ; On a utilisé :1200μl comme volume final total dans la cuve. Les prises sont faites à l’aide d’une pro pipette. -Faire les spectres et déterminer les longueurs d’ondes λ caractéristiques. N.B : Pour chacune des solutions étudiées, remplir la cuve spectrophotométrique au 2/3 maximum Cuve en quartz Échantillon Solvant utilisé Pro pipette
  • 32. 2) Résultats de la spectrophotométrie :  On obtient la courbe de l’absorbance = f (longueur d’onde) :  Pour le sirop de menthe dilué 100 fois :  Pour le bleu de patenté dilué 6 fois :  Pour le jaune de tartrazine dilué 3 fois :
  • 33. 3) Interprétation des résultats de la spectrophotométrie : D’après les spectre d’absorption :  Le bleu ‘’E131’’ absorbe à 630 nm.  Le jaune ‘’E120’’ absorbe à 425 nm.  Le sirop de menthe absorbe à 630 nm et à 425 nm.  Tableau des valeurs de DO correspondantes à chaque longueur d’onde utilisée (425 et 630 nm) : Solution Absorbance à 425 nm Absorbance à 630 nm Sirop de menthe 0,0152 0,0763 Bleu de patenté 0,0157 1,0633 Jaune de tartrazine 0,1655 -0,0754 o On a : Pour le sirop de menthe :  Dilution : 100 fois Facteur de dilution= Vf/Vi = 1200μl solution/12μl du sirop de menthe= 100  Cuve : en quartz ou en plastique car le solvant est l’eau.  Blanc : l’eau distillée.  Résultat de la spectrophotométrie :
  • 34. Longueur d’onde λ 630 nm 425 nm Densité optique 0,08 0,02 Le sirop de menthe absorbe à deux longueurs d’onde : 630 nm et 425 nm. Pour le bleu de patente V :  Dilution : 6 fois Facteur de dilution= Vf/Vi=1200μl de solution/200μl de bleu de patente= 6  Cuve : en quartz pour éviter la corrosion car le solvant est l’éthanol.  Blanc : l’éthanol.  Résultat de spectrophotométrie : Longueur d’onde λ 630 nm 425 nm Densité optique 1 0 La longueur d’onde du bleu est entre 450-500 nm, mais puisque jamais une molécule absorbe sa propre longueur d’onde. Donc le bleu de patenté absorbe à 630 nm. Pour le jaune de tartrazine :  Dilution : 3 fois Facteur de dilution=Vf/Vi=1200μl de solution/400μl de jaune de tartrazine= 3  Cuve : en quartz ou en plastique car le solvant est l’eau.  Blanc : l’eau distillée.  Résultat de spectrophotométrie : Longueur d’onde λ 630 nm 425 nm Densité optique 0 0,2 La longueur d’onde du jaune est entre 565-590 nm, mais jamais une molécule absorbe sa propre longueur d’onde. Donc le jaune de tartrazine absorbe à 425nm.
  • 35. 4) Détermination de la concentration des trois préparations par spectrophotométrie : On utilise la courbe d’étalonnage donnée pour le bleu de patenté V et pour la tartrazine à partir d’une gamme, pour déterminer les différentes concentrations correspondantes aux valeurs de DO (absorbance) : -On a trouvé que : Pour le sirop de menthe dilué 100 fois : o A630 = 0,08 ≈ 0,1 [Bleu de patenté V] = 1 mg/l -En tenant compte le facteur de dilution lors du dosage au spectrophotomètre ; - On a : Facteur de la dilution = Vf/Vi = 100 -C’est-à-dire on doit multiplier 1 mg/l par 100, on aura : 100 mg/l  Donc on a : 100 mg de Bleu de patenté V / L de sirop de menthe. o A425 = 0,02 [Jaune de tartrazine] = 0,5 mg/l -En tenant compte le facteur de dilution lors du dosage au spectrophotomètre ; - On a : Facteur de la dilution = Vf/Vi = 100 -C’est-à-dire on doit multiplier 0,5 mg/l par 100, on aura : 50 mg/l  Donc on a : 50 mg de jaune de tartrazine / L de sirop de menthe. A Bleu = 1 A Jaune =0,2 A 630 de Sirop de menthe =0,1 A 425 de sirop de menthe = 0,02
  • 36. Pour le bleu de patenté V dilué 6 fois : o A630 = 1 [Bleu de patenté V] = 6 mg/l -En tenant compte le facteur de dilution lors du dosage au spectrophotomètre ; - On a : Facteur de la dilution = Vf/Vi = 6 -C’est-à-dire on doit multiplier 6 mg/l par 6, on aura : 36 mg/l  Donc on a : [Bleu de patenté V] = 36 mg / L Pour le jaune de tartrazine dilué 3 fois : o A425 = 0,2 [jaune de tartrazine] = 5 mg/l -En tenant compte le facteur de dilution lors du dosage au spectrophotomètre ; - On a : Facteur de la dilution = Vf/Vi = 3 -C’est-à-dire on doit multiplier 5 mg/l par 3, on aura : 15 mg/l  Donc on a : [jaune de tartrazine] = 15 mg / L 5) Les facteurs de dilution des deux colorants après chromatographie : On a : Ci. Vi = Cf. Vf Ci/Cf = Vi/Vf Pour le bleu de patenté : Facteur de la dilution =Ci/Cf =100/36= 2,77 Pour le jaune de tartrazine : Facteur de la dilution =Ci/Cf =50/15= 3,33 6) Détermination du volume des éluants utilisés pendant les élutions :  On utilise : Vi = 100 µl : Pour le bleu de patenté : l’éluant est l’éthanol ; On a : Fd = Vf/Vi =Ci/Cf = 2,77 Vf = Vi x Fd = 100 x 2,77 = 277 µl Pour le jaune de tartrazine : l’éluant est l’eau distillée ; On a : Fd = Vf/Vi =Ci/Cf = 3,33 Vf = Vi x Fd = 100 x 3,33 = 333 µl
  • 37. 7) Détermination des coefficients d’extinction molaires des 2 produits :  La loi de Lambert-Beer s’exprime : A = ԑ. L. Cm - A : absorbance ou densité optique de la solution traversée ; - ԑ : Coefficient d’extinction molaire en L. Mol-1 .cm-1 ; -C : Concentration molaire de la solution traversée en Mol/L ; -L : Longueur de la cuve égale à 1cm ; Le Coefficient d’extinction molaire : £=A/Cm. L  La relation entre la concentration molaire et la concentration massique est : C pondérale (massique) = M x C molaire Pour le jaune de tartrazine :  On a : DO =1 ; Cp=15 mg / L et M=534,363 ± 0,027 g/mol Cm = Cp / M = (15x10-3) / 534,363 =2,80 x 10-5 mol /l Alors : £=A/Cm. L = 1/ 2,80 x 10-5 x 1 = 35714,28 L.mol-1.cm-1 Donc : £= A/Cm. L = 35714,28 L.mol-1.cm-1 Pour le bleu de patenté V :  On a : Cp=36 mg / L et DO= 0,2 - Dans le premier cas (sel de Sodium) : M = 582,66 g/mol Cm = Cp / M = (36x10-3) / 582,66 =6,17 x 10-5 mol /l Alors : £=A/Cm. L = 0,2/ 6,17x 10-5 x 1 = 3241,49 L.mol-1.cm-1 Donc : £= A /Cm. L = 3241,49 L.mol-1.cm-1 - Dans le premier cas (sel de Calcium) : M = 1159,42 g/mol Cm = Cp / M = (36x10-3) / 1159,42=3,10 x 10-5 mol /l Alors : £=A/Cm. L = 0,2/ 3,10 x 10-5 x 1 = 6441,22 L.mol-1.cm-1 Donc : £= A/Cm. L = 6441,22 L.mol-1.cm-1
  • 38. 8) Interprétation des résultats des coefficients d’extinction molaires :  On constate que le bleu de patenté dispose du plus grand coefficient d’extinction molaire £ par rapport au jaune de tartrazine. Alors c’est lui qui absorbe la lumière le plus. Remarque :  En fin de compte, le sirop de menthe est une solution aqueuse contenant deux colorants artificiels : le jaune tartrazine (E 102) et le bleu patenté (E 131), qui sont responsables de la coloration verte intense de ce produit. Donc il ne s’agit pas de pigments. Conclusion La technique de la chromatographie sur colonne permet la séparation des différents constituants d'un mélange, mais elle peut être utilisée couplée à un moyen de détection, comme par exemple une spectroscopie UV – visible et on obtient ainsi une chaîne complète automatisable d'analyse.
  • 39. Conclusion générale : Durant ces deux TP nous avons réussi à extraire, à identifier et par la suite à quantifier certains constituants des échantillons traités en pratiquant dans des conditions de sécurité quelques méthodes de techniques d’analyses biochimiques utilisées couramment.